Protocol
1. Preparazione della superficie per formazione di biofilm
- Cut 1 mm di spessore 304 piastre in acciaio inox in chip (10 × 10 mm 2) con una fresa meccanica.
- Effettuare la pulizia ad ultrasuoni delle chips in acetone, metanolo, e deionizzata (DI) in sequenza per 10 minuti ciascuno. Utilizzare un contenitore resistente ai solventi, fatta di sostanze come il vetro, per eliminare la contaminazione biologica.
- Sciacquare i chip con acqua corrente per 3-5 DI sec.
- Asciugare i chip utilizzando il flusso di gas N 2 per 3-5 sec.
2. Preparazione di coltura batterica
- Prendete un P. putida KT2440 (gentilmente fornito dal Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Corea del Sud) stock memorizzato in un -80 ° C deep-freezer.
- Scongelare a temperatura ambiente dopo 1 minuto, e lo strato superiore della soluzione madre congelato si trasforma in fanghiglia. Immergere un loop nello strato fuso della soluzione di riserva.
- Utilizzare questo ciclo per striscia i batteri su una Luria-Bertani Piastra (LB) contenente 1,5% agar.
- Incubare la piastra per una notte a 30 ° C per crescere le colonie batteriche.
- Scegliere una singola colonia dalla piastra utilizzando un ciclo fresco.
- Seminare 10 ml di brodo LB in una provetta conica da 50 ml con il ciclo contenente la singola colonia batterica.
- Incubare il brodo in un incubatore agitazione per 16 ore a 30 ° C e 160 rpm.
3. formazione di biofilm sulla superficie
- Raccogliere ciascuno dei chip preparati con le pinzette e di immergere in etanolo al 70% 5 volte per 1-2 secondi ciascuno, per sterilizzare la superficie di ogni chip. Assicurarsi che i chip si svolgono con una pinzetta durante l'immersione.
- Immergere ogni chip in acqua deionizzata autoclavato e in brodo LB in sequenza, 5 volte per 1-2 secondi ciascuna, per rimuovere residuo di etanolo.
- Mettere questi chip in piastre di coltura 6 pozzetti con 2 chip e 5 ml di brodo LB per pozzetto.
- Diluire la coltura batterica fino a quando la concentrazione nel tratto brodo LB8 × 10 8 cellule / ml (densità ottica a 600 nm di lunghezza d'onda: ~ 0,8).
- Inoculare ogni pozzetto con 50 ml di coltura batterica diluito.
- Incubare le piastre a 30 ° C senza agitazione per 24 ore per la formazione di biofilm.
Pulizia 4. CO 2 Aerosol
- Immergere il chip biofilm formati in 10 mM tampone di acetato di ammonio (volatili) 5 volte per rimuovere vagamente attaccate e batteri planctonici.
- Asciugare questi chip in un armadio biosicurezza, dove l'aria scorre dolcemente.
- Subito dopo l'essiccazione, collocare un chip sul luogo di carico, che è 20 mm dall'ugello CO 2 lungo l'asse del getto. Inclinare l'asse del getto ad un angolo di 40 °.
- Impostare la pressione totale di CO 2 e N 2 gas a 5,3 MPa e 0,7 MPa, rispettivamente impiegando regolatori di gas a pressione.
- Applicare il getto di aerosol sulla parte centrale del chip. Aerosol bianchi tra cui la CO 2 dovrebbe solidoessere visibile. Turn "on" l'elettrovalvola per CO 2 per 5 secondi, e poi girarla "off" per 3 secondi (ciclo: 8 sec) periodicamente tramite un interruttore controllato manualmente. Se un flusso di azoto deve essere utilizzato, attivare l'elettrovalvola di alimentazione continua di N 2.
- Trattare i chip con CO 2 aerosol per 16, 40, e 88 sec con e senza purghe azoto. Conservare chip senza trattamento come controlli negativi.
5. Analisi per la rimozione efficienza
- Preparare 1 micron di fluorescenza nucleico verde acido macchia (lunghezza d'onda di eccitazione / emissione: 480/500 nm) in acqua deionizzata per colorare le cellule batteriche in materia di controllo e patatine aerosol-trattata.
- Mettere le fiches nel soluzione colorante.
- Incubare i chip in un incubatore senza luce a 37 ° C per 30 min.
- Dopo l'incubazione, lavare delicatamente i chip con acqua corrente per eliminare DI colorante fluorescente eccessivo.
- Asciugare il chip with flusso di gas N 2.
- Prendere fluorescenza immagini microscopiche di 5 campi aleatori di vista (321 × 240 micron 2) per ogni chip utilizzando un microscopio a epifluorescenza, una lente obiettivo 40X, e una camera CCD.
- Ottenere l'intensità di fluorescenza per ogni immagine utilizzando un software di elaborazione delle immagini, come ImageJ. In ImageJ, utilizzare la funzione "Background Sottrarre" nel menu "Azione", e selezionare "densità integrata" nella finestra "Set misure" nel menu "Analizza". Fare la "misura" nel menu "Analizza" per ottenere l'intensità di fluorescenza.
- Calcolare l'efficienza di rimozione biofilm secondo la seguente formula: 100% × (I chip di controllo - I chip trattati) / (I chip di controllo), dove I è l'intensità di fluorescenza calcolato.
- Ottenere la media efficienze di rimozione e le deviazioni standard. L'uso adalmeno 4 chip per ciascun caso.
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Representative Results
CO 2 aerosol sono stati usati per rimuovere la P. putida biofilm da SUS304 superfici (Figura 1). La maggior parte delle superfici sono state coperte con il biofilm dopo 24 ore di crescita. La maggior parte del biofilm è stato rimosso utilizzando il CO 2 aerosol (Figura 2). Come previsto, la figura 3 mostra un aumento dell'efficienza di rimozione biofilm come il CO 2 tempo di trattamento aerosol aumentato. Per il tempo di trattamento di 88 secondi, l'efficienza di rimozione è stato determinato per essere alto come 97,74% e 98,29% con e senza flusso di azoto, rispettivamente. La temperatura dell'aria era 23-24 ° C e l'umidità relativa è 26-50% quando sono stati condotti gli esperimenti di pulizia.
Figura 1. Schema che mostra la rimozione di un biofilm utilizzando CO 2 aerosol. Gli aerosol quando l'alta pressione gas CO 2 è adiabaticamente espanso attraverso un ugello Venturi (0,4 mm) e la temperatura del gas scende rapidamente. Questi alta velocità CO 2 aerosol vengono applicati ad una superficie ricoperta con un biofilm. Quando si utilizza un flusso di azoto, N 2 gas viene alimentato attraverso 8 ugelli che circondano l'ugello centrale di CO 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. fluorescenza immagini microscopiche per 24 ore-grown P. biofilm putida su 304 chip acciaio inox. I chip sono stati trattati con CO 2 aerosol per diversi tempi di trattamento (0, 16, 40, e 88 sec) senza spurgo di azoto. immagini monocromatiche sono di colore verde, e le barre di scala bianche indicano 50 micron.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. efficienza di rimozione per la P. putida biofilm dalle superfici in acciaio inox 304 con diversi tempi di CO 2 di trattamento di aerosol, con e senza purghe di azoto. Le efficienze di rimozione sono stati calcolati sulla base delle intensità di fluorescenza dei biofilm. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
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