Protocol
1. Preparação de Superfície para formação de biofilme
- Corte 1 mm de espessura 304 chapas de aço inoxidável em chips (10 × 10 mm 2) com um cortador mecânico.
- Executar a limpeza ultra-sónica das fichas em acetona, metanol, e água desionizada (DI) sequencialmente água durante 10 min cada. Usar um recipiente resistente a solventes, feita de substâncias tais como vidro, para remover a contaminação orgânica.
- Lave as batatas fritas com água de fluxo DI para 3-5 seg.
- Secam-se as batatas fritas usando o fluxo de gás N2 durante 3-5 seg.
2. Preparação de uma cultura bacteriana
- Tome um P. putida KT2440 (gentilmente cedido pelo Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Coreia do Sul) Stock armazenado em um -80 ° C congelador.
- Descongelar à temperatura ambiente após 1 min, e a camada de topo da solução estoque congelada transforma a lama. Imergir uma malha na camada derretida da solução estoque.
- Utilize este loop para raia as bactérias em um Luriaplaca -Bertani (LB) contendo 1,5% de agar.
- Incubar a placa durante a noite a 30 ° C para crescer as colónias bacterianas.
- Escolher uma única colónia da placa utilizando um loop fresco.
- Inocular 10 ml de caldo de LB num tubo cónico de 50 ml, com o loop contendo a colónia bacteriana único.
- Incubar o caldo num incubador com agitação durante 16 horas a 30 ° C e 160 rpm.
3. formação de biofilme na superfície
- Pegue cada uma das fichas preparadas com uma pinça e mergulhá-los em 70% de etanol 5 vezes por 1-2 segundos cada, para esterilizar a superfície de cada chip. Certifique-se de que os chips são realizadas com uma pinça durante o mergulho.
- Mergulhe cada chip em água DI autoclavado e em caldo LB sequencialmente, 5 vezes para 1-2 segundos cada, para remover o etanol remanescente.
- Coloque esses chips em placas de cultura de 6 poços com 2 chips e 5 ml de caldo LB por poço.
- Dilui-se a cultura bacteriana até que a concentração no caldo LB atinge8 x 10 8 culas / mL (densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda: ~ 0,8).
- Inocular cada poço com 50 uL da cultura bacteriana diluída.
- Incubar as placas a 30 ° C sem agitação durante 24 horas, para a formação de biofilmes.
Lavagem 4. CO 2 Aerosol
- Mergulhe as batatas fritas em forma de biofilme em tampão de acetato de amónio 10 mM (voláteis) 5 vezes para remover frouxamente ligado e bactérias planctônicas.
- Secar esses chips em uma cabine de segurança biológica, onde o ar flui suavemente.
- Imediatamente após secagem, colocar um chip no local de carregamento, que é de 20 mm a partir do bico de CO 2 ao longo do eixo do jacto. Inclinação do eixo do jacto para um ângulo de 40 °.
- Defina as pressões de estagnação de CO 2 e N 2 de gás para 5,3 MPa e 0,7 MPa, respectivamente, utilizando os reguladores de pressão de gás.
- Aplicar o jacto de aerossol sobre a parte central do chip. Aerossóis brancas, incluindo o CO2 sólido deveser visível. "Ligar" a válvula solenóide de CO 2 durante 5 segundos e, em seguida, transformá-lo "off" por 3 segundos (ciclo: 8 seg) periodicamente, utilizando um interruptor controlado manualmente. Se uma purga de azoto necessita de ser usado, ligar a válvula de solenóide para um fornecimento contínuo de N 2.
- Trate os chips com CO 2 aerossóis para 16, 40 e 88 segundos, com e sem purgas de azoto. Reter fichas sem tratamento como controlos negativos.
5. Análise para Eficiência de Remoção
- Prepare 1 mM ácido mancha de fluorescência nucleico verde (comprimento de onda de excitação / emissão: 480/500 nm) em água DI para corar células bacterianas no controle e batatas fritas tratados com aerossol.
- Coloque as fichas na solução de coloração.
- Incubar as batatas fritas em uma incubadora, sem luz, a 37 ° C durante 30 min.
- Após a incubação, lave as batatas fritas com água de fluxo DI para remover corante fluorescente excessiva.
- Seque o wi fichasth fluxo de gás de N2.
- Tome fluorescência imagens microscópicas de 5 campos aleatórios de vista (321 × 240 mm 2) para cada chip usando um microscópio de epifluorescência, uma lente objetiva de 40X, e uma câmera CCD.
- Obter a intensidade de fluorescência para cada imagem usando um software de processamento de imagem, tais como ImageJ. No ImageJ, use a função "Background Subtrair" no menu "Processos", e selecione "densidade integrada" na janela "Definir Medidas" no menu "Analisar". Faça o "Medição" no menu "Analisar" para obter a intensidade de fluorescência.
- Calcula-se a eficiência de remoção de biofilme de acordo com a seguinte fórmula:% 100 x (I de chips de controle - I de chips tratados) / (I de chips de controle), onde I é a intensidade de fluorescência calculado.
- Obter a média de eficiência na remoção e desvios-padrão. use pelopelo menos 4 chips para cada caso.
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Representative Results
CO 2 aerossóis foram usadas para remover o P. putida biofilmes de superfícies SUS304 (Figura 1). A maior parte das superfícies foram cobertas com o biofilme, após 24 h de crescimento. A maior parte do biofilme foi removido utilizando o CO 2 aerossóis (Figura 2). Como esperado, a Figura 3 mostra um aumento na eficiência de remoção do biofilme como o CO 2 tempo de tratamento de aerossol aumentou. Para o tempo de tratamento de 88 segundos, a eficácia de remoção foi determinada para ser tão elevada quanto 97,74% e 98,29%, com e sem uma purga de azoto, respectivamente. A temperatura do ar era de 23-24 ° C e a humidade relativa foi de 26-50%, quando as experiências foram conduzidas de limpeza.
Figura 1. Esquema que mostra a remoção de um biofilme usando CO 2 aerossóis. Os aerossóis quando a alta pressão de CO 2 de gás é expandido adiabaticamente através de um bico de venturi (0,4 mm) e a temperatura do gás cai rapidamente. Esses de alta velocidade de CO 2 aerossóis são aplicadas a uma superfície coberta com um biofilme. Quando uma purga de azoto é utilizado, N 2 gás é fornecido através de 8 bicos em torno do tubo central CO 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fluorescência imagens microscópicas para P. 24-hr-grown biofilmes putida em 304 fichas de aço inoxidável. Os chips foram tratados com CO 2 aerossóis para diferentes períodos de tratamento (0, 16, 40 e 88 seg) sem purgas de azoto. imagens monocromáticas foram de cor verde, e as barras de escala brancas indicam 50 mm.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. eficiência de remoção do P. biofilmes putida dos 304 superfícies de aço inoxidável com diferentes tempos de CO 2 de tratamento de aerossol, com e sem purgas de azoto. As eficiências de remoção foram calculados com base nas intensidades de fluorescência dos biofilmes. As barras de erro representam os desvios padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
