Introduction
تقنية هجين الواردة في هذا البروتوكول وصفت لأول مرة من قبل كولر وميلشتاين 1 في عام 1975، وباستثناء بعض التحسينات التقنية، الإجراء الرئيسي لم يتغير بشكل كبير خلال السنوات ال 40 الماضية 2. والهدف من هذا البروتوكول هو شرح استراتيجية أكثر ملائمة للتحصين، طريقة موحدة لتوليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، ومثال لطريقة التحقق من صحة (ELISA).
الأجسام المضادة هي أدوات لا يصدق وتسهم في مجموعة واسعة من الأساليب التكنولوجية، مثل التدفق الخلوي، فرز الخلايا المغناطيسي، أو المناعي، فضلا عن خيارات التشخيصية والعلاجية لرصد وعلاج 3 المرض. وتتجلى التوافر التجاري من الاجسام المضادة للأهداف المرجوة من وجود أكثر من 24 قواعد بيانات الويب المختلفة مع كميات لا حصر لها تقريبا من الأجسام المضادة أو المنتجات ذات الصلة الأجسام المضادة 4. في عام 2015، لوكانت جزيئات ntibody جزءا من المناقشات الدولية 5-7 بسبب مشاكل خطيرة في التحقق من صحة الصحيح وتوصيف الأجسام المضادة المتاحة تجاريا.
ويمكن أن يكون صعبا ومكلفا للعثور على أجسام مضادة محددة للمستضد المستهدفة، وكثير من الأحيان، لم يكن لديهم تقارب أو خصوصية حاجة. على الرغم من توليد الأجسام المضادة لا تزال تستغرق وقتا طويلا ويتطلب الموظفين المهرة لتطوير والتحقق من صحة الأجسام المضادة، وإنتاج الأجسام المضادة بشكل فردي قد أفضل من شراء واحدة.
يرجع ذلك إلى حقيقة أن إنتاج الأجسام المضادة وتستغرق وقتا طويلا ويتطلب خبرة، وتطوير أساليب بديلة لإنتاج جزيئات ملزمة للتغلب على هذه المشاكل. الطريقة البديلة الأكثر شيوعا هو إنتاج المؤتلف من الأجسام المضادة سلسلة واحدة عن طريق عرض فج. يتم استخراج الجينات في المنطقة ملزمة متغير من الخلايا وجنبا إلى جنب مع البروتين طلاء من فج. لياليثم أعرب إنجل السلسلة على سطح الجراثيم وعرض في أكثر من بالغسل 8 خطوات. إنتاج الأجسام المضادة سلسلة واحدة هو أسرع قليلا، ولكنه يتطلب أيضا التجريبي المهرة. مساوئ بعض الأجسام المضادة سلسلة واحدة المؤتلف والاستقرار الفقراء وعدم صلاحيتها للتشخيص في المختبر. في معظم الاختبارات التشخيصية، ومستقبلات التيسير للكشف ضروري، والتي تحتاج إلى أن تضاف إلى الأجسام المضادة سلسلة واحدة المؤتلف بعد ذلك. مرة أخرى، وهذا هو مضيعة للوقت وأكثر تعقيدا من تقنية هجين. في التشخيص في المختبر، وقد أظهرت كامل طول وحيدة النسيلة الماوس والأرنب الأجسام المضادة ليكون أفضل خيار.
ويجب أن يتم واحدة من الخطوات الرئيسية في توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة قبل العمل في المختبر يبدأ: تصميم immunoconjugate. الأسئلة التي تحتاج إلى التعامل معها هي: ما هو التكوين الجسمي لهدف في تطبيق و النهائيأيون، والتي المصفوفات هي موجودة؟ التي تركز فان الهدف يكون في التطبيق؟ ما هو التطبيق النهائي، وما هي الشروط التي يجب أن تتوفر الأجسام المضادة؟
تأخذ دائما بعين الاعتبار أنه إذا تم استخدام الببتيد شظية الخطي، كما أن لديها أن تكون خطية في حاتمة النهائية في الهدف من الاختيار؛ على خلاف ذلك، فإن الأجسام المضادة لا يلزم. وبطبيعة الحال، بغض النظر عن طريقة الفحص، يمكن اختيار الأجسام المضادة ليتعرف على تنسيقات مختلفة مولدة في تطبيقات مختلفة، ولكن هذا يجب أن يتم التحقق من صحة بدقة متناهية. هذه هي الأسباب التي تطور الأجسام المضادة والمصادقة عليها هي تلك العمليات الطموحة.
اختيار شكل الأنتيجين للتحصين أمر أساسي لتطوير الأجسام المضادة ويحدد نجاح أو فشل هذه العملية. وبمجرد أن الفئران تعبر عن الأجسام المضادة ذات الصلة، وعزل خلايا الطحال وتنصهر مع خلايا المايلوما. خطوط الخلايا المايلوما الأكثر شيوعا لالفئران تطوير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة هي X63-حج 8.653 9 و SP2 / 0-AG 14 10 من / ج الماوس سلالة BALB. الخلايا تنحدر من خبيث سرطان الغدد الليمفاوية الخلية البائية واختيرت لأنها لا تفرز أي من السلاسل الثقيلة أو الخفيفة الخاصة بها. الخلايا يمكن أن تتكيف مع نسبة بين 1:10 و 10: 1 (splenocytes مقابل خلايا الورم النقوي). في هذا البروتوكول، تم تكييف الخلايا إلى نسبة 3: 1 وتنصهر التي كتبها البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والكهربائي، وفقا لStoicheva وهوى 11.
اندماج الخلايا البائية والخلايا المايلوما هو عملية عشوائية. لذلك، الهجينة من اثنين ب الخلايا الليمفاوية أو اثنين خلايا المايلوما يمكن أن تتولد، ولكن تلك الهجينة لن تكون قادرة على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة في الثقافة. الخلايا الخضوع لاختيار هيبوزانتين، أمينوبترين، والثيميدين (HAT)، الذي فقط خلايا هجين تنصهر يمكن البقاء على قيد الحياة نظرا لإمكانية استخدام دي نوفو مسار تخليق بيريميدين. لتوليد مونالأجسام المضادة oclonal، فمن الضروري للحصول على خط الخلية التي تنشأ من خلية أم واحدة. يتم ضمان monoclonality عن طريق الحد من تقنيات التخفيف والتحليل المجهري للنمو الخلايا. يتم فحص وsupernatants ثقافة هجين لإنتاج الأجسام المضادة المحددة، ومعظمهم من ELISA أو قياس التدفق الخلوي، ويتم اختيار أفضل المواد اللاصقة. بعد الثقافة الجماهيرية وتنقية، ويمكن للجزيء الضد أخيرا أن توصف والتحقق من صحتها عن التطبيق المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واستخدمت BALB / ج أو NMRI الفئران (المصحف العضلة) من مستعمرة تربية لدينا في جامعة بوتسدام (بوتسدام، ألمانيا) لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. وقد أنجز عمل الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والدولية ذات الصلة. وتمت الموافقة على الدراسة من قبل وزارة براندنبورغ البيئة والصحة وحماية المستهلك (المرجع رقم V3-2347-A16-4-2012).
1. إعداد Immunoconjugates
- لاقتران مستضد إلى الناقل، تستخدم بروتوكولات اقتران القياسية عبر جذر الأمينو، كربوكسي، أو جماعات سلفو، مثل غلوتارالدهيد، N - (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC)، أو N - [ص maleimidobutyryloxy ] succinimide استر (سلفو GMBS).
- للاقتران (على سبيل المثال، مع غلوتارالدهيد) 13، استخدام البروتين المستهدف أو الببتيد والناقل (ألبومين البيض، ألبومين المصل البقري، أو ثقب المفتاح هيموسيانين البطلينوس) في نسبة 1: 1. تمييع العلاقات العامة الهدفotein أو الببتيد في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والبروتين الناقل في 50 ملي NaHCO 3 العازلة. التكيف مع حجم وتركيز على المبلغ اللازم للتحصينات.
- خلط كل من حلول وإضافة 1.25٪ غلوتارالدهيد. خلط واحتضان العينة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT). لتحديد الخلايا هجين، وجعل نفسه immunoconjugate، ولكن مع ناقل آخر، من أجل تجنب اختيار المجلدات الناقل غير محددة.
- Dialyze العينة اقتران عن طريق إجراء غسيل الكلى سريع مع الراتنج التجاري الخشنة (على سبيل المثال، باستخدام Sephadex G25).
- خرم الجزء السفلي من رد فعل قارورة 1.5 مل مع إبرة جوفاء ووضعه في أنبوب 15 مل. وضع الصوف الزجاجي في أسفل لختم وتغطية ذلك مع 300 ملغ من الراتنج الخشنة (للعلامة معايرة 0.5 مل).
- بعناية، ووضع 1 مل PBS قطرة قطرة في أنبوب رد فعل 1،5 مل والتأكد من أن الصوف الزجاجي لا يزال ختم ثقب. دع الراتنج الخشنة الصورةجيد وأجهزة الطرد المركزي في عمود في 500 x ج لمدة 2 دقيقة. واحد من هذه الأعمدة يمكن استخدامها لdialyze 200 ميكرولتر من العينة اقتران. لكميات أكبر، وجعل أكثر من الأعمدة.
- تغيير أنبوب وإسقاط حل اقتران على الراتنج الخشنة تضخم. الطرد المركزي مرة أخرى في 500 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة شاطف من أنبوب واستخدامه للتحصين.
2. تحصين الحيوانات
- اختيار الفئران BALB / ج من العمر 12 عاما الأسبوع مرتين أو ثلاث 6- لللتحصين.
- لحيوان واحد، وإعداد 150 - 200 ميكروغرام من immunoconjugate في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ومزجها مع 100 ميكرولتر من كاملة مساعد Freund's (CFA). مزيج الحل 3 مرات مع إبرة قصيرة ورقيقة (0.6 مم) على حقنة 1 مل. حقن محلول البريتونى في الفأر.
- إعطاء حقن معززة بعد 6 أسابيع مع نفس الكمية من immunoconjugate، ولكن من دون CFA. أخذ الدم في وقت لاحق 7 أيام (من الجيب retroorbital) واستعداداتإعادة المصل التي يحتضنها الدم لمدة 3-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أجهزة الطرد المركزي الخليط في 3000 x ج لمدة 5 دقائق. اتخاذ طاف في الدم وتحويلها إلى أنبوب جديد. تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تجاهل بيليه.
- تحليل مصل عبر ELISA، كما هو موضح في الخطوة 3. للحصول على الانصهار، واختيار الماوس وفقا لأعلى عيار المصل.
- استعدادا للاندماج الخلايا، وتعزيز الماوس مع 150 - 200 ميكروغرام من immunoconjugate في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من دون مساعد قبل 4 أيام فقط الانصهار.
3. ELISA
- يعد حل المستضد مع تركيز من 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني ونقل 50 ميكرولتر في كل ELISA بئر من لوحة 96-جيدا.
- احتضان لوحة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
- غسل لوحة 3 مرات مع ماء الصنبور. منع الآبار مع 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / 5٪ العجل حديثي الولادة المصل (سي إس) لكل بئر لمدة 1 ساعة على RT في الفصل الرطبالعنبر. إعداد التخفيفات المصل في 1: 5 سلسلة بدءا من 01:50. لتحليل زراعة الخلايا، واستخدام طاف ثقافة مخفف.
- غسل لوحة 3 مرات مع ماء الصنبور. ماصة 50 ميكرولتر من عينة لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في غرفة رطبة. إعداد الحل الضد الثانوية في 1: 5000 تخفيف من الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (HRP).
- غسل لوحة 3 مرات مع ماء الصنبور وإضافة 50 ميكرولتر من الحل الضد الثانوية لكل بئر. احتضان لمدة 45 دقيقة في RT في غرفة رطبة.
- يعد حل الركيزة الطازجة. جعل الحلول الأسهم من 0.1 م ناه 2 ص 4 و 0.1٪ بيروكسيد الهيدروجين. خذ 5 أجزاء ناه 2 ص 4، 4 أجزاء بيروكسيد الهيدروجين، و 1 جزء tetramethylbenzidine من أجل حل الركيزة الطازجة.
- غسل لوحة 10 مرات مع ماء الصنبور. ماصة 50 ميكرولتر من محلول الركيزة جديدة في الآبار واحتضان لمدة 5-10 دقيقة فيظلام.
- وقف رد الفعل مع 50 ميكرولتر 1 MH 2 SO 4 لكل بئر. باستخدام قارئ لوحة، وقياس الكثافة البصرية في 450 نانومتر مع الطول الموجي المرجعية في 630 نانومتر.
4. التحضير للثقافات خلية المايلوما
- من الآن فصاعدا، أداء جميع الأعمال تحت ظروف معقمة.
- إعداد المتوسطة ثقافة جديدة لزراعة الخلايا. تكملة 500 مل من RPMI1640 مع 10٪ مصل الجنين العجل (50 مل)، 2 مم L-الجلوتامين (5 مل)، و 50 ميكرومتر المركابتويثانول (5 مل). استبدال الجلوتامين كل 7 أيام.
- ذوبان الجليد قارورة من الفئران SP2 0 خلية / في المياه الدافئة. نقل الحل خلية في 10 مل من مستنبت الطازجة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 200 × ز. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 1 مل من مستنبت الطازجة.
- نقل الخلايا في 25 سم 2 قارورة واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة. توسيع الخلايا لمدة 75 م 2 قوارير فرنكاالانصهار خام. الحفاظ قسامات للتخزين على المدى الطويل، كما هو موضح في الخطوة 7.
5. إعداد الخلايا المغذية
- تضحية الماوس عمره 12 أسابيع NMRI (وفقا لمبادئ توجيهية وطنية والمؤسسية؛ على سبيل المثال، من خلال CO 2 الاستنشاق). إزالة الفراء وتنظيف البطن مع الايثانول 70٪.
- حقن 5 مل من الجليد الباردة RPMI المتوسطة في البطن، تدليك البطن مع منتاش، ونضح تعليق الخلية المغذية. وضع خلايا في أنبوب فارغ 50 مل. تنفيذ هذه الخطوة مرة أخرى. يجب أن يتم استرداد 7-10 مل من تعليق الخلية المغذية.
- إعداد 100 مل المغذية تعليق خلية بإضافة 90 مل من مستنبت خلية كاملة (RPMI 1640، 10٪ مصل العجل الجنين، 2 مم الجلوتامين، و 50 المركابتويثانول ميكرومتر). مزجها ونقل 100 ميكرولتر / جيد في لوحات ثقافة الخلية 10 × 96 جيدا. احتضان لوحات ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة.
فيوجن 6. خلية
- التضحية الماوس تحصين خلع عنق الرحم أو CO 2 الاستنشاق واستئصال الطحال 14. أخذ الدم إضافية من القلب وإعداد مصل، كما هو موضح في الخطوة 2.3، كما تحكم إيجابية في ELISA.
- إعداد تعليق خلية الطحال عن طريق الضغط على الطحال من خلال مصفاة الخلية. ملء ما يصل الى 20 مل مع كامل مستنبت الخلية. حصاد الخلايا في أنابيب 50 مل بواسطة الطرد المركزي (200 x ج، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية). تجاهل طاف.
- شطف قارورة زراعة الخلايا وحصاد خلايا المايلوما بواسطة الطرد المركزي (200 x ج، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية) وتجاهل طاف.
- Resuspend والكريات خلية في 20 مل من العازلة ملح متوازن (BSS) (125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 4 مم CaCl 2، 2.5 ملي MgCl 2، و 5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تكرار غسل الخطوات ثلاث مرات.
- لضبط خلية طحالية: نسبة خلية الورم النخاعي، عد الخلايا بعد الخطوة غسل الثانية التنوبالحادي وإعادة التعليق على بيليه في 1 مل من العازلة BSS. جعل تخفيف 01:10 ونقل 10 ميكرولتر إلى غرفة عد الخلايا. عد الخلايا وتحديد تركيز خلية في 1 مل.
- ضبط أعداد الخلايا في المنطقة العازلة BSS إلى ثلاثة أجزاء splenocytes وخلايا المايلوما جزء واحد في الحجم النهائي 1 مل. أخذ 200 ميكرولتر من تعليق خلية ومزجها مع 200 ميكرولتر من PEG8000 (1 غرام في 4 مل من العازلة BSS). نقل 400 ميكرولتر إلى كوفيت Electroporation للبقطر 2 مم وتعيين النبض (600-650 V و 25 مللي ثانية).
- بعد النبض، واحتضان الخلايا في RT لمدة 3 دقائق في كفيت. إزالة الخلايا ووضعها قطرة قطرة إلى دورق مخروطي مع 100 مل من HAT المتوسطة (RPMI 1640، 10٪ FCS، 2 مم الجلوتامين، 50 ميكرومتر المركابتويثانول، 100 هيبوزانتين ميكرومتر، و 5.8 ميكرومتر آزاسيرين، و 16 ميكرومتر الثيميدين).
- كرر الانصهار 4 مرات حتى يتم إنفاق الدفعة 1 مل. احتضان دورق مخروطي لمدة 3 ساعات في CO 2 37 درجة مئوية و 5٪في حاضنة.
- تكملة التعليق الخلية مرة أخرى مع هيبوزانتين، آزاسيرين، والثيميدين قبل طلاء الخلايا في الطبقة المغذية. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية لكل بئر لوحات طبقة المغذية واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 (في حاضنة) 5٪. وينبغي أن يكون التركيز النهائي داخل البئر 100 هيبوزانتين ميكرومتر، و 5.8 ميكرومتر آزاسيرين، و 16 الثيميدين ميكرومتر.
- إجراء التحليل المجهري (التكبير: 10X عدسة الهدف، 10X العين قطعة) للنمو نسيلي في كل بئر من لوحة بعد 7 أيام من أجل تحديد ما إذا كانت الآبار هي أحادية أو بولكلونل. الخلايا وحيدة النسيلة هي مجموعة واحدة من الخلايا التي تنشأ من خلية واحدة. الخلايا بولكلونل هي مجموعات متعددة من الخلايا في بئر واحدة. تغيير وسائل الإعلام كاملة بعد 7 أيام واحتضان مرة أخرى لمدة 7 أيام في المتوسط HAT.
- تغيير المتوسطة HAT وزراعة الخلايا في كامل مستنبت الخلية. استخدام طاف لإجراء Eليزا، كما هو موضح في الخطوة 3. خلايا هجين الإيجابية يجب أن تتوسع في 24 لوحات جيدا وفقا للاختبارات للإنتاج أجسام مضادة محددة. إذا كانت الخلايا بولكلونل، وتخفيف محدود لابد من تنفيذ (كما هو موضح في الخطوة 8).
7. Cryoconservation من الهجينة
- Cryoconserve أحادية إيجابية والهجينة بولكلونل للتخزين على المدى الطويل. حصاد الخلايا من 24 لوحة جيدا مع التقاء> 60٪ عن طريق الطرد المركزي (200 x ج، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية).
- Resuspend وبيليه في 500 ميليلتر من وسائل الإعلام ثقافة خلية كاملة وتحويلها إلى cryotube. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة تجميد (RPMI 1640، 20٪ FCS، و 15٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد)، ومزجها، ووضعها في في مربع الستايروفوم أو مربع تجميد خاص. مخزن في -80 درجة مئوية لمدة 3 أيام. بعد 3 أيام، وcryotube يمكن نقلها إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
8. الحد من التخفيف من بولكلونل الهجينة
- ماكعصام ثقافة الطبقة المغذية، كما هو موضح في الخطوة 5. حصاد الخلايا بولكلونل إيجابية، كما هو موضح في الخطوة 7.1. عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 6.5، وضبط عدد الخلايا إلى 10 خلية / مل، مع الحجم النهائي من 10 مل لوحة 96-جيدا. إضافة 100 ميكرولتر / جيد على طبقة المغذية.
- احتضان لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية وتحليل النمو نسيلي مجهريا (التكبير: 10X عدسة الهدف، 10X العين قطعة). جعل إليسا من طاف الثقافة، كما هو موضح في الخطوة 3، وتحديد الهجينة وحيدة النسيلة المناسبة للثقافة الجماهيرية.
9. الثقافة الجماهيرية وتنقية وحيدة النسيلة الأجسام المضادة
- نقل الهجينة وحيدة النسيلة مع إشارات ELISA المناسبة ل25 سم 2 أو 75 سم 2 قوارير وجمع ما يصل الى 500 مل من طاف الثقافة. اختبار أسبوعيا الثقافة لإنتاج الأجسام المضادة المحددة والحفاظ 3-5 قسامات في هجين للتخزين على المدى الطويل، كما هو موضح في الخطوة 7.
- إعداد البروتين عمود قبل غسله مع غسل العازلة (تمييع العازلة ملزمة 1: 3 في DH 2 O). تمرير طاف من الخطوة 9.2 على عمود وجمع من خلال تدفق. أزل الأجسام المضادة ملزمة مع 0.1 M سترات، ودرجة الحموضة 3.5 وتحييد الحموضة على الفور مع 500 ميكرولتر من تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.0.
- تميز الأجسام المضادة مزال بواسطة SDS-PAGE، وصمة عار الغربية، وإليسا، والتحقق من صحة ذلك من أجل تطبيق النهائي.
- لصفحة SDS، واتخاذ 3-5 ميكروغرام من حل الأجسام المضادة النقي في حارة (عينة 20 ميكرولتر)، إضافة 5 ميكرولتر من 4X SDS عينة العازلة تحميل (8٪ SDS، 20٪ 2-المركابتويثانول، و 40٪ الجليسرين، و0.015 ٪ برموفينول، وانخفاض)، والحرارة تحقيقات في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كعنصر تحكم، استخدم نفس العينة مع لتنقيتهntibody من نفس نمط إسوي لكن خصوصية غير ذات صلة.
- تحميل العينات على 12.5٪ SDS هلام، ومكان 5 ميكرولتر من سلم بروتين غير ملوثين في ممر إضافي، وفرقوا بينهم من قبل الكهربائي. وصمة عار الجل مع Coomassie بريليانت الأزرق وتوثيق النتائج. وأنشئ بروتوكول SDS الأساسية التي Laemmli في عام 1970 (15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 مثالا من عيار المصل مستضد معين للتحصين واحدة أجريت في المختبر. في هذا الرقم، والمناعة الأمصال ألف وباء ومعاير من 1:50 إلى 1: 5،000،000 بالمقارنة مع مصل الفأر السذاجة. والمغلفة للمستضد على المرحلة الصلبة، وتم الكشف عن الأجسام المضادة المحددة مع الماعز مترافق POD-لمكافحة فأر الإيج الأجسام المضادة. أظهر كل من مصل الفئران تحصين أعلى بكثير عيار مستضد معين مقارنة مع الماوس السذاجة. إشارة في التخفيف من 1: 5000 كافية للانتقال إلى الخطوة التالية، وانصهار الخلية.
وكان نمو الهجينة وضوحا بعد 7-10 أيام من اختيار HAT من خلال تطوير استنساخ الخلايا، كما هو مبين في الشكل 2. تم التقاط الصورة من لوحة 96-جيدا بعد 10 يوما الانصهار. استنساخ الخلية وaminopterinemono- أو polyclonality من الآبارتمت مراقبتها من قبل التحليلات المجهرية الفردية (التكبير: 10X عدسة الهدف، 10X العين قطعة). وصفت الآبار وحيدة النسيلة مع نقطة على الجزء العلوي من لوحة. عندما تم اختبار لوحات في ELISA، وإشارات مستضد معين من الهجينة وحيدة النسيلة يمكن التعرف عليها بسهولة. تم recloned الثقافات هجين إيجابية، توسع، وcryoconserved حتى كانت ثقافة وحيدة النسيلة، مستقرة، ومستضد معين. وقد تم جمع طاف الثقافة خلال فترة زراعة من أجل تنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إنتاجها عبر اللوني تقارب البروتين وبوساطة. ويبين الشكل 3 لمحة شطف القياسية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع نمط إسوي IgG1.
تميزت الأجسام المضادة وحيدة النسيلة النقاء مزيدا من صفحة SDS، كما هو مبين في الشكل (4). في 50 و 25 كيلو دالتون، كانت قيوده الثقيلة والخفيفة واضحة للعيان، مما يدل على تنقية جزيء الضد. حارة 2 ثانيةhowed الأجسام المضادة السيطرة مع نفس نمط إسوي.
الشكل 1: المعايرة المصل بعد التحصين. ومعاير الأمصال من اثنين من الفئران في التخفيفات من 1:50 حتى 1: 5000000 واختبار لخصوصية المستضد بواسطة ELISA. كما المصل السيطرة على الماوس غير المحصنين كان يستخدم في تخفيف 01:50. وكانت إشارات محددة مستضد الإيجابية لكل من الفئران تحصين وsplenocytes الماوس وكانت تستخدم لتوليد هجين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور من أحادية وبولكلونل الهجينة. أحادية ومحطا بولكلونلوقد تم تحليل bridomas مجهريا بعد 10 يوما الانصهار خلية. وتظهر الصور نتيجة التقليدية للخطوط الخلايا هجين مستقرة مع وحيدة النسيلة (A) وبولكلونل (ب) الخصائص. شريط مقياس: 10 ميكرون. ب شريط النطاق: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الملف شطف قياسي لوحيدة النسيلة الأجسام المضادة مع نمط إسوي IgG1. تمت تنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ولدت عبر اللوني تقارب بوساطة A-بروتين، ويتم عرض الملف الشخصي شطف من الأجسام المضادة IgG1 في الشكل. وتشير الذروة الأولى في مزال جزيء الضد وحيدة النسيلة في درجة الحموضة 5.0. وتشير القمم التالية الرقم الهيدروجيني 3.5 والرقم الهيدروجيني 2.0. من الضروري خفض درجة الحموضةلتنظيف تماما العمود جميع المواد وتجديد مصفوفة عمود للالتنقيات المقبلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: PAGE SDS القياسية لوحيدة النسيلة الأجسام المضادة مع نمط إسوي IgG1. تم تحديد نقاء شاطف الأجسام المضادة من قبل Coomassie الملطخة SDS-PAGE. طبقت 5 ميكروغرام من الحل الأجسام المضادة لL2 ومقارنة مع 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة IgG1 القياسي في L3 في ظل ظروف انخفاض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من ورم هجين يتطلب تحليلا مكثفة ومفصلة حاتمة، وخاصة فيما يتعلق بتطبيق النهائي، عندما ينبغي أن تعترف الضد المستهدف. في كثير من الأحيان التقليل من شأنها من قبل المستخدمين ويؤدي إلى الأجسام المضادة مع ضعف الأداء. عملية الانصهار دائما عشوائية، مما يعني أن نتائج الهجينة محددة تعتمد بشكل كبير على نسبة الخلايا وحيوية في هذه المرحلة. بعد تخفيف محدود، خلايا غير مستقرة للغاية وتتطلب مراقبة صارمة من نمو الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة. وينبغي تحليل تلك المعايير بدقة عند استكشاف الطريقة.
قيود إضافية على تقنية تشمل الوقت اللازم لتوليد خط الخلية واختيار الخلية المنتجة للأجسام المضادة المطلوبة. ويرجع ذلك إلى مجموعة رباعي الصيغة الصبغية من الكروموسومات بعد الانصهار، خلايا غير مستقرة جدا وبعد ذلك تقلل من مجموعة إلى فرداني مرة أخرى. هذا ممكنيؤدي إلى فقدان الجينات ذات الصلة الأجسام المضادة، مما يجعل الخلايا لا تنتج الأجسام المضادة بعد الآن. الحد الآخر هو أن اختيار الخلايا المنتجة للأجسام المضادة المنشود يقوم على ثقافة طاف وليس على الحلول الضد النقاء. ولذلك، فإن التوصيف النهائي للالضد هو، في معظم الحالات، ممكن فقط بعد الثقافة الجماهيرية من استنساخ هجين المحدد. وهكذا، فإن خطر أن الأجسام المضادة ليست قادرة على العمل في تطبيق النهائي مرتفع جدا.
وصفت العديد من التعديلات التكنولوجية، مثل تحليل تمكين الليزر وتكنولوجيا التصنيع (LEAP) 16، تقارب عرض سطح القبض على (ACSD) 17، أو هلام التكنولوجيا microdrop 18، من أجل الالتفاف على العوائق أثناء اختيار الأجسام المضادة المناسبة. كل هذه الأساليب هي قادرة على تحسين جوانب مختلفة من جيل هجين والاختيار، ولكن معظمها تتطلب معدات مكلفة أو الأمثل لكل لى خلية واحدةشمال شرق 16.
تحسن آخر أو التعديل الذي تم تطويره في مختبر لدينا هو استراتيجية التحصين جديدة مع الجسيمات الفيروسية خيالية مثل (VLPs)، كما هو موضح في Messerschmidt وآخرون (19). الجسيمات يمكن تعديلها من قبل تسلسل حاتمة المطلوب جزءا لا يتجزأ من بنية معطف الفيروسي وقدم على سطح هذه الجسيمات. وهذا يؤدي إلى سريع جدا ومحددة التحصين بعد 4 أسابيع في الحيوانات المقابلة. الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ولدت لديها IgG2 أو IgG1 isotypes وتعتمد على اختيار حاتمة محددة للغاية للمستضد الأصلي. وضعنا أيضا خطوة اختيار محددة لخلايا هجين باستخدام علامات سطح الخلية الاصطناعية. خلايا المايلوما المعدلة وراثيا المستخدمة عرض علامة سطح إدراج ثابت. هذه علامة السطح يمكن استخدامها لantigen- أو نمط إسوي على وجه التحديد فرز الخلايا هجين مباشرة بعد الانصهار، دون الحد من التخفيف ودون فحص ELISA المفرط،كما من الضروري فعلا في ورم هجين التقليدية 20.
وكما ذكر أعلاه، هناك بعض البدائل الواعدة المتاحة في توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أنه في المستقبل، يمكن أن تحسن التعامل وتقليل السلبيات من ورم هجين الحالية. ومع ذلك، فإن الإجراء يتطلب دائما تحديد مفصل للحاتمة المطلوب في تركيبة مع تطبيق صارم والمخطط لها بعناية بحيث يعمل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ولدت بنجاح. سوف توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من ورم هجين سيكون خطوة هامة وضرورية في المستقبل بسبب الطلب الهائل في العلوم، والتشخيص، والعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
