Introduction
La technologie d'hybridome présenté dans ce protocole a été décrite par Köhler et Milstein 1 en 1975 et, sauf pour quelques améliorations techniques, la procédure principale n'a pas changé de façon spectaculaire au cours des 40 dernières années 2. L'objectif de ce protocole est d'expliquer une stratégie plus appropriée de vaccination, une méthode standard pour la production d'anticorps monoclonaux, et un exemple pour une méthode de validation (ELISA).
Les anticorps sont des outils incroyables et contribuent à un large éventail d'approches technologiques, telles que la cytométrie de flux, le tri magnétique de cellules, ou immunofluorescence, ainsi que des options diagnostiques et thérapeutiques pour le suivi et le traitement 3 maladies. La disponibilité commerciale des anticorps monoclonaux pour les cibles désirées est démontrée par la présence de plus de 24 bases de données de Web différents avec pratiquement innombrables quantités d'anticorps ou de produits liés à l' anticorps 4. En 2015, unmolécules ntibody faisaient partie d'une discussion internationale 5-7 en raison de graves problèmes dans la validation et la caractérisation des anticorps disponibles dans le commerce approprié.
Il peut être difficile et coûteux de trouver des anticorps spécifiques pour un antigène cible, et souvent, ils n'ont pas l'affinité ou la spécificité nécessaires. Bien que la génération d'un anticorps est encore temps et nécessite du personnel qualifié pour développer et valider l'anticorps, la production d'un anticorps individuel pourrait mieux que d'acheter un.
En raison du fait que la production d'anticorps est longue et nécessite de l'expérience, les méthodes alternatives pour la production de molécules de liaison ont été développées pour surmonter ces problèmes. La méthode alternative la plus couramment utilisée est la production par recombinaison d'anticorps à chaîne unique par expression phagique. Les gènes codant pour la région variable de liaison sont extraits à partir des cellules et combinées avec la protéine de revêtement de phage. Les sChaîne ingle est ensuite exprimé sur la surface d'un bactériophage et criblé en plusieurs étapes panning 8. La production d'anticorps à chaîne unique est un peu plus rapide, mais il faut aussi un expérimentateur qualifié. Les inconvénients de certains anticorps à chaîne unique recombinantes sont une mauvaise stabilité et un manque d'aptitude pour le diagnostic in vitro. Dans la plupart des tests de diagnostic, un récepteur Fc de détection est nécessaire, qui doit être ajouté à un anticorps à chaîne unique recombinante après. Encore une fois, cela prend beaucoup de temps et d'autant plus complexe que la technique des hybridomes. Dans le diagnostic in vitro, des anticorps pleine longueur souris monoclonal et de lapin ont été démontrés pour être le meilleur choix.
L'une des principales étapes de la production d'anticorps monoclonaux doit être fait avant que le travail dans le laboratoire commence: la conception de l'immunoconjugué. Les questions qui doivent être abordées sont: Quelle est la composition physique de la cible dans la applicat finaleion, et qui matrices sont présents? Quelle concentration la cible avoir dans l'application? Quelle est l'application finale, et quelles sont les exigences que l'anticorps doit remplir?
Il faut toujours prendre en compte que si un fragment de peptide linéaire est utilisé, il doit également être linéaire dans l'épitope finale dans la cible de choix; sinon, l'anticorps ne se lie pas. Bien entendu, indépendamment de la méthode de criblage, les anticorps peuvent être sélectionnés pour reconnaître différents formats antigéniques dans des applications différentes, mais cela doit être validé de façon très précise. Ce sont les raisons pour lesquelles le développement d'anticorps et de validation sont ces processus ambitieux.
Le choix du format antigénique pour l'immunisation est fondamentale pour le développement d'anticorps et détermine le succès ou l'échec de ce processus. Une fois que les souris expriment un titre d'anticorps approprié, les cellules de rate sont isolées et fusionnées avec des cellules de myélome. Les lignées cellulaires de myélome les plus courants pourle développement murin d'anticorps monoclonaux sont X63-Ag 8.653 9 et Sp2 / 0-Ag 14 10 à partir d' un / c souche de souris Balb. Les cellules descendent d'un lymphome des cellules B malignes et ont été choisis parce qu'ils ne sécrètent une quelconque de leurs chaînes lourdes ou légères. Les cellules peuvent être adaptées à un rapport compris entre 1:10 et 10: 1 (splénocytes par rapport aux cellules de myélome). Dans ce protocole, les cellules ont été adaptées à un rapport de 3: 1 et fusionnés par le polyéthylène glycol (PEG) et électrofusion, selon Stoicheva Hui et 11.
La fusion des cellules B et des cellules de myélome est un processus aléatoire. Par conséquent, les hybrides de deux lymphocytes B ou de deux cellules de myélome peuvent être produites, mais ces hybrides ne seraient pas capables de survivre pendant une longue période de culture. Les cellules subissent une hypoxanthine, de l' aminoptérine et de la thymidine (HAT) la sélection, par lequel seules les cellules d'hybridome fusionnées peuvent survivre en raison de la possibilité d'utiliser la voie de novo de la synthèse des pyrimidines. Pour la génération de monoclonal anticorps, il est nécessaire d'obtenir une lignée cellulaire provenant d'une cellule mère. La monoclonalité est assurée en limitant les techniques de dilution et l'analyse microscopique de la croissance cellulaire. Les surnageants de culture d'hybridomes sont criblés pour la production d'anticorps spécifiques, la plupart du temps par la méthode ELISA ou cytométrie de flux, et les meilleurs liants sont sélectionnés. Après que la culture et la purification de masse, la molécule d'anticorps peut enfin être caractérisé et validé pour l'application souhaitée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balb / c ou des souris NMRI (Mus musculus) de notre colonie de reproduction à l'Université de Potsdam (Potsdam, Allemagne) ont été utilisés pour la production d'anticorps monoclonaux. Le travail des animaux a été menée conformément aux directives nationales et internationales pertinentes. L'étude a été approuvée par le ministère de l'Environnement de Brandebourg, de la santé et la protection des consommateurs (numéro de référence V3-2347-A16-4-2012).
1. Préparation d'immunoconjugués
- Pour coupler l'antigène à un support, en utilisant des protocoles classiques de couplage par l' intermédiaire de groupes amino, ou des groupes sulfo-groupes carboxy, tels que par le glutaraldéhyde, le N - (3-diméthylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC) ou le N - [Y-maléimidobutyryloxy ] succinimide ester (GMBS sulfo-).
- Pour le couplage (par exemple avec le glutaraldéhyde) 13, en utilisant la protéine cible ou le peptide et le support (ovalbumine, l' albumine de sérum bovin ou l' hémocyanine de patelle) dans un rapport de 1: 1. Diluer la pr cibleotein ou d'un peptide dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et la protéine porteuse en mM NaHCO 3 50 tampon. Adapter le volume et la concentration à la quantité nécessaire pour les vaccinations.
- Mélanger les deux solutions et ajouter 1,25% de glutaraldéhyde. Mélanger et incuber l'échantillon pendant 4 h à la température ambiante (RT). Pour sélectionner les cellules d'hybridome, faire la même immunoconjugué, mais avec un autre transporteur, afin d'éviter la sélection des liants de support non spécifiques.
- Dialyser l'échantillon de couplage en effectuant une dialyse rapide avec de la résine commerciale grossière (par exemple, Sephadex G25).
- Perfore le fond d'une fiole de réaction de 1,5 ml avec une aiguille creuse et le placer dans un tube de 15 ml. Mettez la laine de verre dans le fond pour l'étanchéité et le couvrir avec 300 mg de résine grossière (à la marque d'étalonnage de 0,5 mL).
- Avec précaution, mettre 1 ml de PBS goutte à goutte dans un tube de réaction de 1,5 ml et assurez-vous que la laine de verre est encore étanchéité de la perforation. Laissez la résine grossière sbien et centrifuger la colonne à 500 g pendant 2 min. Une telle colonne peut être utilisée pour dialyser 200 pi de l'échantillon de couplage. Pour des volumes plus élevés, faire plus de colonnes.
- Changer le tube et déposer la solution de couplage sur la résine grossière gonflé. Centrifugeuse à nouveau à 500 g pendant 2 min. Retirer l'éluant du tube et de l'utiliser pour l'immunisation.
2. L'immunisation des animaux
- Choisir deux ou trois de 6 à 12 semaines d'âge des souris Balb / c pour l'immunisation.
- Pour un animal, préparer 150-200 pg de l'immunoconjugué dans 200 pi de PBS et mélanger avec 100 pi d'adjuvant complet Freund's (CFA). Mélanger la solution 3 fois avec une aiguille courte et mince (0,6 mm de diamètre) sur une seringue de 1 ml. Injecter la solution par voie intrapéritonéale à la souris.
- Donner une injection de rappel 6 semaines plus tard avec la même quantité de l'immunoconjugué, mais sans CFA. Prenez le sang 7 jours plus tard (sur le sinus rétro-orbitaire) et prepare du sérum par incubation du sang pour les 3 - 4 h à la température ambiante (RT).
- Centrifuger le mélange à 3000 xg pendant 5 min. Prenez le surnageant de sérum et de le transférer dans un nouveau tube. Entreposer à -20 ° C. Jeter le culot.
- Analyser les sérums par ELISA, comme décrit à l' étape 3. Pour la fusion, choisissez la souris avec le titre sérique le plus élevé.
- En préparation de la fusion cellulaire, augmenter la souris avec 150-200 pg de l'immunoconjugué dans 300 ul de PBS sans adjuvant seulement 4 jours avant la fusion.
3. ELISA
- Préparer une solution d'antigène à une concentration de 5 pg / ml dans du PBS et transférer 50 pi dans chaque puits ELISA d'une plaque à 96 puits.
- Incuber la plaque pendant 2 h à 37 ° C ou pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humide.
- Laver la plaque 3 fois avec de l'eau du robinet. Bloquer les puits avec 80 ul de PBS / 5% de sérum de veau nouveau-né (NCS) par puits pendant 1 h à température ambiante dans un ch humideambre. Préparer les dilutions de sérum dans un 1: 5 séries commençant par 1:50. Pour l'analyse de la culture cellulaire, en utilisant le surnageant de culture non dilué.
- Laver la plaque 3 fois avec de l'eau du robinet. Pipeter 50 ul de l'échantillon par puits et incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide. Préparer la solution d'anticorps secondaire dans une dilution 1: 5000 d'un anticorps anti-souris IgG de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (HRP).
- Laver la plaque 3 fois avec de l'eau du robinet et ajouter 50 ul de la solution secondaire d'anticorps par puits. Incuber pendant 45 min à température ambiante dans une chambre humide.
- Préparer une solution de substrat frais. Faire des solutions mères de 0,1 M NaH 2 PO 4 et 0,1% de peroxyde d'hydrogène. Prendre 5 parties NaH 2 PO 4, 4 parties de peroxyde d'hydrogène et 1 partie tétraméthylbenzidine pour la solution de substrat frais.
- Laver la plaque 10 fois avec de l'eau du robinet. Introduire à la pipette 50 ul de solution de substrat frais dans les puits et incuber pendant 5 à 10 min dans lefoncé.
- Arrêter la réaction avec 50 pi 1 MH 2 SO 4 par puits. En utilisant un lecteur de plaque, mesurer la densité optique à 450 nm avec une longueur d'onde de référence à 630 nm.
4. Préparation des cultures de cellules myélomateuses
- A partir de maintenant, effectuer tous les travaux dans des conditions stériles.
- Préparer un milieu de culture frais pour la culture cellulaire. Supplément 500 ml de RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal (50 ml), 2 mM de L-glutamine (5 ml) et 50 uM mercaptoéthanol (5 ml). Remplacez la glutamine tous les 7 jours.
- Décongeler une fiole de murins cellules SP2 / 0 dans l'eau chaude. Transférer la solution de cellules dans 10 mL de milieu de culture frais et centrifuger pendant 10 min à 200 x g. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 ml de milieu de culture frais.
- Transférer les cellules dans un flacon de 2 à 25 cm et incuber à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur. Développer les cellules à deux de 75 m 2 flacons befla fusion du minerai. Conserve aliquotes pour le stockage à long terme, tel que décrit à l'étape 7.
5. Préparation de cellules nourricières
- Sacrifiez une souris de 12 semaines d'âge NMRI (selon les directives nationales et institutionnelles, par exemple, par inhalation de CO 2). Retirez la fourrure et nettoyer l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Injecter 5 ml de glace froide milieu RPMI dans l'abdomen, masser l'abdomen avec une pince à épiler, et aspirer la suspension de cellules nourricières. Placez les cellules dans un 50 ml tube vide. Effectuez cette étape une fois de plus. 7 à 10 ml de la suspension de cellules nourricières devraient être récupérées.
- Préparer un dispositif d'alimentation de suspension de cellules de 100 ml par addition de 90 ml de milieu de culture cellulaire complet (RPMI 1640, 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine et 50 pM mercaptoéthanol). Mélanger et transférer 100 pl / puits dans 10 x 96 puits des plaques de culture cellulaire. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur.
6. Fusion cellulaire
- Sacrifiez la souris immunisées par dislocation cervicale ou inhalation de CO 2 et exciser la rate 14. Prélever du sang supplémentaire du coeur et préparer le sérum, tel que décrit à l'étape 2.3, en tant que contrôle positif dans le test ELISA.
- Préparer une suspension de cellules de rate en appuyant sur la rate à travers un tamis cellulaire. Remplir jusqu'à 20 mL avec plein milieu de culture cellulaire. Récolter les cellules dans des tubes de 50 ml par centrifugation (200 x g, 10 min, 4 ° C). Jeter le surnageant.
- Rincer la fiole de culture de cellules et la récolte des cellules de myélome par centrifugation (200 x g, 10 min, 4 ° C), et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les culots cellulaires dans 20 ml de tampon de sel équilibrée (BSS) (125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 4 mM de CaCl2, 2,5 mM MgCl2 et 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4) et on centrifuge à nouveau. Répéter le lavage étapes trois fois.
- Pour régler le splénocytes: rapport de cellules de myélome, compter les cellules après la deuxième étape de lavage par le sapinst remise en suspension du culot dans 1 ml de tampon BSS. Faire une dilution au 1:10 et transférer 10 pl dans une chambre de comptage de cellules. Compter les cellules et à déterminer la concentration des cellules dans 1 ml.
- Réglez le nombre de cellules dans le tampon BSS à trois-pièces splénocytes et les cellules de myélome en une partie dans un volume final de 1 ml. Prendre 200 ul de la suspension cellulaire et le mélanger avec 200 pi de PEG8000 (1 g dans 4 ml de tampon BSS). Transférer les 400 pi dans une cuvette d'électroporation d'un diamètre de 2 mm et régler l'impulsion (600-650 V et 25 ms).
- Après l'impulsion, incuber les cellules à température ambiante pendant 3 minutes dans la cuvette. Retirez les cellules et les mettre goutte à goutte dans un flacon Erlenmeyer avec 100 ml de milieu HAT (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de glutamine, 50 uM mercaptoéthanol, 100 uM hypoxanthine, 5,8 uM azasérine, et 16 uM thymidine).
- Répétez la fusion 4 fois jusqu'à ce que le lot de 1 ml est dépensé. Incuber l'erlenmeyer pendant 3 h à 37 ° C et 5% de CO 2dans un incubateur.
- Compléter la suspension cellulaire à nouveau avec de l'hypoxanthine, l'azasérine et de la thymidine avant l'étalement des cellules sur la couche nourricière. Ajouter 100 ul de la suspension cellulaire par puits pour les plaques à couche d'alimentation et laisser incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2 (dans un incubateur). La concentration finale dans le puits devrait être de 100 uM d'hypoxanthine, 5,8 uM azasérine, et 16 uM thymidine.
- Effectuer une analyse microscopique (grossissement: 10X objectif, 10X oculaire) pour la croissance clonale dans chaque puits de la plaque après 7 jours afin de déterminer si les puits sont mono- ou polyclonaux. cellules monoclonaux sont un amas de cellules qui proviennent d'une seule cellule. cellules polyclonaux sont multiples amas de cellules dans un puits. Changer le milieu complet après 7 jours et incuber à nouveau pendant 7 jours dans le milieu HAT.
- Changer le milieu HAT et cultiver les cellules en pleine milieu de culture cellulaire. Utilisez le surnageant pour effectuer une ELISA, comme décrit dans l'étape 3. Les cellules d'hybridome positives doit être élargi dans des plaques à 24 puits selon les tests pour la production d'anticorps spécifiques. Si les cellules sont des anticorps polyclonaux, une dilution limitée doit être effectuée (décrit dans l'étape 8).
7. Cryoconservation des hybridomes
- Cryoconservé mono- positif et hybridomes polyclonaux pour le stockage à long terme. Récolter les cellules à partir d'une plaque de 24 puits avec une confluence de> 60% par centrifugation (200 x g, 10 min, 4 ° C).
- Reprendre le culot dans 500 ul de plein milieux de culture cellulaire et le transférer dans un cryotube. Ajouter 500 ul de milieu de congélation (RPMI 1640, 20% de FCS, et 15% de diméthylsulfoxyde), mélanger, et le mettre dans une boîte en polystyrène ou une boîte de congélation spéciale. Conserver à -80 ° C pendant 3 jours. Au bout de 3 jours, les cryotubes peut être transféré dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme.
8. dilution limitante des hybridomes polyclonal
- Makea couche d'alimentation de la culture, comme décrit à l'étape 5. cellules polyclonaux positives de récolte, comme décrit à l'étape 7.1. Compter les cellules, comme décrit à l'étape 6.5, et de régler le nombre de cellules de 10 cellules / ml, avec un volume final de 10 ml pour une plaque à 96 puits. Ajouter 100 pl / puits sur la couche d'alimentation.
- Laisser incuber pendant 7 jours à 37 ° C et à analyser la croissance clonale au microscope (grossissement 10X lentille d'objectif 10X oculaire). Faire un test ELISA du surnageant de culture, tel que décrit à l'étape 3, et d'identifier les hybridomes monoclonaux appropriés pour la culture de masse.
9. Mass Culture et purification des anticorps monoclonaux
- Transférer les hybridomes monoclonaux avec les signaux ELISA appropriés pour 25 cm 2 ou flacons de 75 cm2 et recueillir jusqu'à 500 ml du surnageant de culture. Testez l'hebdomadaire de culture pour la production d'anticorps spécifiques et de conserver 3 - 5 aliquotes par hybridome pour le stockage à long terme, tel que décrit à l'étape 7.
- Préparer une colonne de protéine A par lavage avec du tampon de lavage (tampon de liaison diluée 1: 3 dans dH2Û). Passez le surnageant de l'étape 9.2 sur la colonne et recueillir le flux continu. Éluer l'anticorps lié avec 0,1 M de citrate, pH 3,5 et neutraliser le pH immédiatement avec 500 pl de Tris-HCl, pH 9,0.
- Caractériser l'anticorps élue par SDS-PAGE, Western Blot et ELISA, et le valider pour l'application finale.
- Pour la SDS-PAGE, prendre 3 - 5 ug de solution d'anticorps purifiée par voie (un échantillon de 20 ul), ajouter 5 ul de 4 x SDS tampon de charge d'échantillon (8% de SDS, 20% de 2-mercaptoéthanol, 40% de glycerol et 0,015 bromophénol%, réduite), et chauffer les sondes à 95 ° C pendant 5 min. En tant que témoin, utiliser le même échantillon avec un a purifiéntibody du même isotype, mais une spécificité non pertinente.
- Charger les échantillons sur un gel SDS à 12,5%, placer 5 ul d'une échelle de protéine non colorée dans une voie supplémentaire, et de les séparer par électrophorèse. Colorer le gel avec Coomassie Brilliant Blue et documenter les résultats. Un protocole SDS de base a été établi par Laemmli en 1970 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 montre un exemple de titre sérique spécifique de l' antigène pour une immunisation effectuée dans le laboratoire. Sur cette figure, les sérums immuns A et B ont été titrés de 1:50 à 1: 5.000.000 par rapport à un sérum d'une souris naïve. L'antigène a été déposé sur la phase solide, et les anticorps spécifiques ont été détectés avec un anticorps Ig anti-souris de chèvre conjugué POD. Les deux sérums des souris immunisées ont montré un titre d'antigène spécifique significativement plus élevée par rapport à la souris naïve. Le signal à une dilution de 1: 5000 est suffisante pour passer à l'étape suivante, la fusion cellulaire.
La croissance d'hybridomes a été visible après 7 à 10 jours de sélection HAT par le développement de clones de cellules, comme représenté sur la figure 2. L'image a été prise à partir d'une plaque de 96 puits 10 jours après la fusion. Les clones cellulaires et aminopterinemono- ou des puits polyclonalitéont été suivis par des analyses microscopiques individuelles (grossissement: 10X objectif, 10X oculaire). puits monoclonaux ont été marqués avec un point situé sur la partie supérieure de la plaque. Lorsque les plaques ont été testées en ELISA, des signaux spécifiques de l'antigène provenant d'hybridomes monoclonaux pourraient être facilement identifiés. les cultures d'hybridome positives ont été reclonés, agrandies et cryoconservés jusqu'à ce que la culture est monoclonal, stable et spécifique à un antigène. Le surnageant de culture a été recueilli au cours de la période de culture, afin de purifier l'anticorps monoclonal produit par l'intermédiaire d'une Chromatographie d'affinité sur protéine A-médiée. La figure 3 montre un profil d'élution standard d'un anticorps monoclonal avec un isotype IgG1.
Les anticorps monoclonaux purifiés sont caractérisés en outre par une SDS - PAGE, comme le montre la figure 4. 50 et 25 kDa, les chaînes lourdes et légères étaient clairement visibles, ce qui indique la purification d'une molécule d'anticorps. La piste 2 showed un anticorps témoin avec la même isotype.
Figure 1: Titration sérum après immunisation. Les sérums provenant de deux souris ont été titrés dans des dilutions de 1:50 jusqu'à 1: 5.000.000 et testé pour spécificité d'antigène par un ELISA. En tant que sérum témoin de souris non immunisées a été utilisé à une dilution de 1:50. Les signaux spécifiques de l'antigène ont été positifs pour les deux souris immunisées et des splénocytes de souris A ont été utilisées pour la production d'hybridomes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Photographies de mono- et polyclonaux hybridomes. Mono- et hy polyclonauxbridomas ont été analysés au microscope 10 jours après la fusion cellulaire. Les images montrent les résultats classiques pour les lignées cellulaires d'hybridomes stables avec des anticorps monoclonaux (A) et (B) polyclonaux propriétés. Une barre d'échelle: 10 um; B barre d'échelle: 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Profil d'élution standard pour un anticorps monoclonal avec un Isotype IgG1. L'anticorps monoclonal produit a été purifié par Chromatographie d'affinité sur protéine A médiation et le profil d'élution d'un anticorps IgG1 est représenté sur la figure. Le premier pic indique que la molécule d'anticorps monoclonal a été éluée à pH 5,0. Les pics suivants indiquent un pH de 3,5 et à pH 2,0. La diminution du pH est nécessaire,pour nettoyer complètement la colonne de toutes les substances et pour régénérer la matrice de la colonne pour les prochains purifications. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: PAGE standard SDS pour un anticorps monoclonal avec un Isotype IgG1. La pureté de l'éluant d'anticorps a été déterminé par une SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie. 5 ug de la solution d'anticorps ont été appliquées à L2 par rapport à 5 pg d'un anticorps IgG1 standard L3 dans des conditions réductrices. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La génération d'anticorps monoclonaux par la technologie des hybridomes nécessite une analyse épitopique intense et détaillée, notamment en ce qui concerne l'application finale, lorsque l'anticorps doit reconnaître la cible. Ceci est souvent sous-estimée par les utilisateurs et conduit à des anticorps avec des performances faibles. Le processus de fusion est toujours aléatoire, ce qui signifie que le résultat d'hybridomes spécifiques est très dépendant du rapport de la cellule et la vitalité à ce stade. Après dilution limitée, les cellules sont très instables et nécessitent un contrôle rigoureux de la croissance cellulaire et la production d'anticorps. Ces paramètres doivent être soigneusement analysés lors de la résolution de la méthode.
D'autres limitations de la technique comprennent le temps nécessaire pour la génération de la lignée cellulaire et la sélection de la cellule productrice d'anticorps désirée. En raison de l'ensemble des chromosomes tétraploïde après la fusion, les cellules sont très instables et réduire ensuite l'ensemble à haploïdes à nouveau. cela pourraitconduisent à la perte de gènes liés à l'anticorps, ce qui provoque des cellules à ne plus produire des anticorps. Une autre limitation est que la sélection des cellules productrices d'anticorps souhaitées est basé sur le surnageant de culture et non pas sur les solutions d'anticorps purifiés. Par conséquent, une caractérisation finale de l'anticorps est, dans la plupart des cas, ne sera possible qu'après la culture en masse du clone d'hybridome sélectionné. Ainsi, le risque que l'anticorps ne sont pas en mesure de travailler dans l'application finale est très élevé.
Plusieurs modifications technologiques, telles que l' analyse de laser est activé et la technologie de traitement (LEAP) 16, l' affinité affichage de la surface de capture (ACSD) 17, ou de la technologie de microgouttes de gel 18, ont été décrits dans le but de contourner les inconvénients lors de la sélection des anticorps appropriés. Toutes ces méthodes sont en mesure d'améliorer les différents aspects de la production et de la sélection hybridome, mais la plupart d'entre eux nécessitent des équipements coûteux ou d'optimisation pour chaque li cellule uniquene 16.
Une autre amélioration ou modification qui a été développé dans notre laboratoire est une nouvelle stratégie de vaccination avec des particules virales chimères (VLP), comme décrit dans Messerschmidt et al 19. Les particules peuvent être modifiés par les séquences d'épitope désiré intégrées dans la structure d'enveloppe virale et présentés à la surface de ces particules. Cela conduit à une immunisation très rapide et spécifique après 4 semaines chez les animaux correspondants. Les anticorps monoclonaux sont générés IgG2 ou IgG1 isotypes et dépendent de la sélection d'épitopes hautement spécifique de l'antigène natif. Nous avons également développé une étape de sélection spécifique pour les cellules d'hybridome en utilisant des marqueurs de surface cellulaire artificielle. Les cellules de myélome utilisées transgéniques présentent un marqueur de surface inséré de façon stable. Ce marqueur de surface peut être utilisée pour l'antigène ou un isotype particulier trier les cellules d'hybridome directement après la fusion, sans limiter la dilution et sans excès de criblage ELISA,comme est réellement nécessaire dans la technologie classique des hybridomes 20.
Comme mentionné plus haut, il existe des alternatives prometteuses disponibles dans la génération d'anticorps monoclonal qui, dans le futur, peuvent améliorer la manipulation et à réduire les inconvénients de la technologie des hybridomes en cours. Néanmoins, la procédure exige toujours l'identification détaillée de l'épitope souhaité en combinaison avec une application stricte et soigneusement planifiée de telle sorte que l'anticorps monoclonal généré fonctionne avec succès. La génération d'anticorps monoclonaux par la technologie des hybridomes sera une étape importante et nécessaire à l'avenir en raison de l'énorme demande dans la science, le diagnostic et la thérapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
