Introduction
이 프로토콜에 제시된 하이 브리 도마 기술은 처음 쾰러와 1975 년 밀스타인 (1)에 의해 설명하고, 몇 가지 기술적 인 개선을 제외하고 주요 절차는 지난 40 년 2 동안 크게 변경되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은보다 적절한 면역화 전략, 모노클로 날 항체의 생성 표준 방법 및 검증 방법 (ELISA)에 대한 예를 설명한다.
항체는 놀라운 도구 질병 모니터링 및 처리 3에 대한 진단 및 치료 옵션뿐만 아니라 이러한 유세포 자기 세포 분류, 또는 면역 같은 기술적 접근법 광범위한 기여한다. 원하는 목표에 대한 단일 클론 항체의 상용화는 항체 또는 항체 관련 제품 (4)의 거의 셀 수없이 많은 수량 24 개 이상의 서로 다른 웹 데이터베이스의 존재에 의해 설명된다. 2015에서,ntibody 분자 인해 적절한 검증 및 상업적으로 이용 가능한 항체의 특성에 심각한 문제로 국제 논의 5-7의 일부.
표적 항원에 특이적인 항체를 찾기 어렵고 고가 일 수 있고, 종종, 이들은 친 화성 또는 특이성은 필요 없다. 항체를 생성하는 것은 아직 시간이 많이 걸리는이며, 수도 더 나은 하나를 구입하는 것보다 개별적으로 항체를 생산, 개발 및 항체를 확인하는 숙련 된 인력이 필요하지만.
인해 항체 생산은 시간 소모적이며, 경험을 필요로한다는 사실에 결합 분자의 제조를위한 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 가장 일반적으로 사용되는 다른 방법은 파지 디스플레이를 통해 단일 쇄 항체의 재조합 생성한다. 가변 결합 영역의 유전자는 세포로부터 추출하고, 파지의 코트 단백질과 결합된다. 의 S화롯불 체인은 박테리오파지의 표면에 발현 여러 패닝 단계 8에서 상영된다. 단일 사슬 항체의 생산은 다소 빠르지 만 또한 숙련 된 실험자를 필요로한다. 일부 재조합 단일 사슬 항체의 단점은 가난한 안정성 및 체외 진단을위한 적합성의 부족이다. 대부분의 진단 시험에서 검출을위한 된 Fc 수용체 나중에 재조합 단일 쇄 항체에 추가 될 필요가있는 것이 필요하다. 또한, 이것은 시간을 소모하고, 하이 브리 도마 기술보다 훨씬 더 복잡하다. 체외 진단에서 전체 길이 단일 클론 마우스와 토끼 항체는 최선의 선택이 될 입증되었습니다.
면역 접합체의 설계 : 실험실 작업을 시작하기 전에 단일 클론 항체를 생성하는 주요 단계 중 하나는 수행되어야한다. 해결해야 할 질문은 다음과 같습니다 최종 응용 제품에서 대상의 물리적 조성은 무엇입니까이온 및 존재하는 행렬? 대상은 응용 프로그램에서 어떤 농도가 있습니까? 최종 응용 프로그램은 무엇이며, 항체가 충족해야하는 요구 사항은 무엇입니까?
항상 선형 펩티드 단편을 사용하는 경우, 또한 원하는 대상의 최종 선형 에피토프되어야한다는 고려; 그렇지 않은 경우, 항체에 결합하지 않을 것이다. 물론, 스크리닝 방법과 무관하게 항체는 서로 다른 애플리케이션의 서로 다른 형식의 항원을 인식하도록 선택 될 수 있지만, 이것은 매우 정밀하게 검증되어야한다. 이러한 항체 개발 및 유효성 검사는 야심 찬 프로세스입니다 이유입니다.
면역 항원에 대한 포맷의 선택은 항체 개발을위한 기본이며,이 방법의 성공 또는 실패를 결정한다. 생쥐가 중요한 항체를 발현하면, 비장 세포를 분리하여 골수종 세포와 융합된다. 가장 일반적인 골수종 세포주쥐의 모노클로 날 항체 개발은 X63-의 Ag 8.653 (9) 및을 Balb / C 마우스 변형에서 Sp2을 / 0의 Ag (14) (10)이다. 세포는 악성 B 세포 림프종의 자손 그들 자신의 중량 또는 경쇄 중 어느 분비하지 않기 때문에 선택되었다. 1 (골수종 세포 대 비장) 세포를 1:10 내지 10의 비율로 구성 될 수있다. Stoicheva 및 귀 (11)에있어서, (1) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 전기 융합하여 융합이 프로토콜에서, 세포는 3의 비율로 적응시켰다.
B 세포와 골수종 세포의 융합은 임의의 공정이다. 따라서, 두 개의 B 림프구 또는 골수종 세포의 하이브리드를 생성 할 수 있지만, 이러한 하이브리드 배양 장기간 생존 할 수 없다. 세포는 하이 브리 도마 세포 융합 의한 피리 미딘 합성 새로이 경로를 사용할 수있는 가능성에 견딜 수있는하여 하이포크 산틴, 아미 노프 테린 및 티미 딘 (HAT)을 둘러 거칠. 월의 생성oclonal 항체, 한 머더 세포 유래 세포주를 얻기 위해 필요하다. monoclonality는 희석 기술 및 세포 증식의 현미경 분석을 제한함으로써 보장된다. 하이 브리 도마 배양 상청액은 ELISA에 의해 주로, 특이 적 항체 생산에 대해 스크리닝 또는 유동 세포 계측법 및 가장 바인더가 선택된다. 대량 배양 및 정제 한 후, 항체 분자는 마침내 특성화 될 수 있으며, 원하는 애플리케이션에 대한 검증.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
포츠담 대학 (포츠담, 독일)에서 우리의 사육 식민지에서 BALB / C 또는 NMRI 마우스 (뮤스의 musculus)는 단일 클론 항체의 생산을 위해 사용되었다. 동물 연구는 관련 국가 및 국제 가이드 라인에 따라 실시 하였다. 이 연구는 환경, 보건 브란덴부르크 정부 및 소비자 보호 (참조 번호 V3-2347 - A16-4-2012)에 의해 승인되었다.
면역 접합체의 1. 준비
- 담체에 항원을 결합하는, 아미노 통해 표준 커플 링 프로토콜을 사용하여 글루 타르 알데히드, N에 의해 같은 카복시 또는 설포 기, - (3- 디메틸 아미노 프로필) - N의 다이이 미드 (EDC) 또는 N - [Y 말레이 미도 ] 숙신이 미드 에스테르 (설포 GMBS).
- : 1 비율 (글루 타르 알데하이드와 예) 커플 링 (13), 1에서 표적 단백질 또는 펩티드와 캐리어 (난 알부민, 소 혈청 알부민 또는 키홀 삿갓 조개 헤 모시)를 사용한다. 대상 홍보를 희석otein 또는 인산 완충 용액 (PBS), 50 mM의 NaHCO3을 버퍼 캐리어 단백질의 펩티드. 볼륨 및 예방 접종을 위해 필요한 양의 농도를 적응.
- 두 솔루션을 혼합하고 1.25 %의 글루 타르 알데히드를 추가합니다. 혼합하고 실온에서 4 시간 (RT) 동안 시료를 배양한다. 하이 브리 도마 세포를 선택하기 위해, 동일한 면역을하지만, 다른 담체와 순서 비특이적 담체 결합제의 선택을 방지 할 수 있습니다.
- (예를 들어, 세파 덱스 G25) 상업적 거친 수지 빠르고 투석을 행하여 커플 링 샘플을 투석.
- 중공 바늘 1.5 mL의 반응 바이알의 저부를 관통하고, 15 ㎖의 튜브에 배치. 밀봉 바닥에 유리 섬유를 넣고 (0.5 mL를 교정 마크) 조 수지의 300 밀리그램으로 커버.
- 조심스럽게, 1.5 mL의 반응 관에 1 mL의 PBS의 적가를 넣고 유리 울 여전히 구멍을 밀봉되어 있는지 확인합니다. 거친 수지의하자잘 원심 분리기 2 분 500 XG에 열. 이러한 하나의 열은 커플 링 200 μL 샘플을 투석하기 위해 사용될 수있다. 높은 볼륨의 경우, 더 많은 열을 확인합니다.
- 튜브를 변경하고 팽창 거친 수지 상에 커플 링 솔루션을 놓습니다. 원심 분리기 다시 2 분 동안 500 XG에. 튜브에서 전개 용매를 제거하고 예방 접종을 위해 사용합니다.
동물의 2. 예방 접종
- 예방 접종에 대한 두 개 또는 세 개의 6 ~ 12 주령의 Balb / c 마우스를 선택합니다.
- PBS 200 μL의 면역 접합체의 200 μg의 완전한 Freund's 보조제의 100 μL (CFA)와 함께 혼합 - 한 동물의 경우, (150)을 준비합니다. 1 ML의 주사기에 솔루션을 짧고가는 바늘로 3 회 (0.6 mm 직경)를 섞는다. 마우스에 복강 내 용액을 주입한다.
- 육주 후 면역 접합체의 같은 양의 부스터 주사를 부여하지만, CFA없이. 합니다 (안와 동 만점) 칠일 후에 혈액과 처리장을실온에서 4 시간 (RT) - (3)에 대해 혈액을 배양하여 혈청 재.
- 5 분 동안 3,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 혈청 상층 액을 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. -20 ° C에서 보관합니다. 펠렛을 폐기하십시오.
- ELISA를 통해 혈청을 분석, 융합을 위해 3 단계에 설명 된대로, 가장 높은 혈청 역가와 마우스를 선택합니다.
- 단지 4 일 융합 전에 보조없이 PBS 300 μL의 면역 접합체의 200 μg의 - 세포 융합에 대비하여, (150)와 마우스를 향상.
3. ELISA
- PBS에서 5 μg의 / ㎖ 농도의 항원 용액을 조제하고, 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 μL ELISA 옮긴다.
- 37 ° C 또는 밤새 습기 챔버 4 ° C에서 2 시간 동안 접시를 품어.
- 수돗물로 플레이트를 3 회 반복한다. 습기 채널에 실온에서 1 시간 동안 잘 당 PBS / 5 % 신생아 혈청 80 μL (NCS)와 우물을 차단호박색. 1시 50분로 시작하는 5 시리즈 : 1의 혈청 희석을 준비합니다. 세포 배양 분석의 경우, 희석 배양 상등액을 사용한다.
- 수돗물로 플레이트를 3 회 반복한다. 피펫 (50)도 당 샘플의 μL 및 습기 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양. 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 접합 염소 항 - 마우스 IgG 항체의 5,000 희석 : 1의 이차 항체 솔루션을 준비합니다.
- 수돗물로 판을 3 회 세척하고 잘 당 이차 항체 용액 50 μL를 추가합니다. 습기 챔버에서 실온에서 45 분 동안 품어.
- 신선한 기질 용액을 준비합니다. 0.1 M의 NaH 2 PO 4, 0.1 % 과산화수소의 스톡 용액을 만든다. 5 중량 부에 NaH 2 PO 4, 4 부 과산화수소 및 신선한 기질 용액 1 부 테트라 메틸 벤지딘을 가지고.
- 수돗물로 판 10 회 반복한다. 피펫 (50) 우물에 신선한 기질 용액 μL 5 부화 - 10 분어두운.
- 50 μL 1 MH이 아니라 당 SO 4로 반응을 중지합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 630 nm에서 기준 파장 450 nm에서의 광학 밀도를 측정한다.
골수종 세포 배양 4. 준비
- 지금부터, 멸균 조건에서 모든 작업을 수행합니다.
- 세포 배양을위한 새로운 배지를 준비합니다. 10 % 소 태아 혈청 (50 ㎖), 2 mM L- 글루타민 (5 ㎖) 및 50 μM의 메르 캅토 에탄올 (5 mL)로 RPMI1640 500㎖의 보조 식품. 매 7 일 글루타민을 대체합니다.
- 따뜻한 물에 쥐 SP2 / 0 세포의 병을 해동. 200 x g에서 10 분 동안 신선한 배양액을 원심 분리로 10 mL의 세포 용액을 전송. 뜨는을 취소하고 신선한 배양액 1 mL에 펠렛을 재현 탁.
- 25 cm 2 플라스크에서 세포를 옮기고 항온 CO 2, 37 ° C에서 그들을 부화 5 %. 이 75 m에 세포를 확장 2 플라스크 BEF광석 융합. 단계 7에 기재된 바와 같이, 장기간의 저장을 위해 분취 량을 절약.
피더 세포의 5. 준비
- (; 예를 들면, CO 2 흡입 국가 및 기관의 지침에 따라) 12 주령 NMRI 마우스를 희생. 모피를 제거하고 70 % 에탄올로 복부를 청소하십시오.
- 복부에 얼음 차가운 RPMI 배지 5 mL를 주입 트위터와 복부를 마사지하고, 피더 세포 현탁액을 대기음. 빈 50 ML의 튜브에 세포를 놓습니다. 다시 한 번이 단계를 수행합니다. 피더 세포 현탁액의 7 ~ 10 mL를 검색 할 수 있습니다.
- 전체 세포 배양 배지 90 ㎖ (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민, 50 μM 머 캅토 에탄올)을 첨가하여 100 mL의 피더 세포 현탁액을 준비한다. 그것을 혼합하고 10 × 96 웰 세포 배양 플레이트에 웰 100 μL / 옮긴다. 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2의 접시를 품어.
6. 셀 퓨전
- 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입하여 예방 접종을 마우스를 희생하고 비장 (14)를 절제. 엘리사의 양성 대조군으로, 단계 2.3에 설명 된대로, 마음에서 추가 혈액을 타고 혈청을 준비합니다.
- 셀 스트레이너를 통해 비장을 눌러 비장 세포 현탁액을 제조. 전체 세포 배양 배지 20 ㎖까지 입력합니다. 원심 분리에 의해 50 ㎖의 튜브에 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ℃). 상층 액을 버린다.
- 세포 배양 플라스크를 씻어 원심 분리하여 골수종 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ° C) 및 상층 액을 버린다.
- 20 평형 염 완충액 ㎖ (BSS)에서 세포 펠렛을 재현 탁 (125 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 4 mM의 CaCl2를 2.5 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM 트리스 - 염산, pH를 7.4), 원심 분리를 다시. 세탁 세 번 단계를 반복합니다.
- 비장 조정 : 골수종 세포 비, 눈에 의해 제 2 세정 단계 후에 세포를 카운트ST는 BSS 완충액 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 1:10 희석을 확인하고 셀 카운팅 챔버에 10 μL를 전송합니다. 세포를 세어 한 용액으로 세포 농도를 결정한다.
- 1 ㎖의 최종 부피로 세 부품 비장 한 부분 골수종 세포에 BSS 버퍼 내의 세포 수를 조정한다. 세포 현탁액의 200 μL를 가지고 PEG8000 200 μL (BSS 버퍼의 4 ㎖의 1g)와 함께 섞는다. 2mm 직경의 전기 천공 큐벳에 400 μL 전송 펄스 세트 (600-650 V, 25 밀리 초).
- 펄스 후에 큐벳에서 3 분 동안 실온에서 세포를 배양한다. 세포를 제거하고이를 HAT 보통 100 ㎖ (RPMI 1640, 10 % FCS, 2 mM의 글루타민, 50 μM의 머 캅토 에탄올, 100 μM의 히 포크 산틴, 5.8 μM 아자 세린, 16 μM 티미 딘)와 함께 삼각 플라스크에 적가.
- 1 mL의 배치가 소비 될 때까지 융합 4 번 반복합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 시간 동안 삼각 플라스크를 인큐베이션인큐베이터한다.
- 피더 층 세포 도금 전에 하이포크 산틴, 아자 세린 및 티미 딘 다시 세포 현탁액을 보완. 피더 층 플레이트에 웰 당 세포 현탁액 100 μL를 추가하고 37 ° C, 5 % (인큐베이터)에서 CO 2의 접시를 품어. 잘 내에서 최종 농도는 100 μM의 하이포크 산틴, 5.8 μM 아자 세린, 16 μM의 티미 딘을해야합니다.
- 우물은 모노 또는 폴리 클로 날 있는지 확인하기 위해 7 일 후 플레이트의 각 웰에 클론 성장 : 현미경 분석 (10X 대물 렌즈, 10 배 눈 조각 확대)을 수행합니다. 단일 클론 세포는 단일 세포에서 유래 한 세포의 클러스터이다. 폴리 클로 날 세포는 잘 하나의 셀의 다수의 클러스터이다. 7 일 후 전체 미디어를 변경하고 HAT 배지에서 7 일간 다시 품어.
- 모자 매체를 변경하고 전체 세포 배양 배지에서 세포를 배양. 전자를 수행하는 상층 액을 사용하여단계에 기재된 리사 3. 양성 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항체의 생산에 대한 시험에있어서, 24 웰 플레이트에서 팽창되어야한다. 세포 클론 인 경우 제한 희석 (단계 8에서 설명 됨)을 수행해야한다.
하이 브리 도마의 7 Cryoconservation
- 장기 보관 용 포지티브 및 모노 클론 된 하이 브리 도마를 Cryoconserve. 원심 분리에 의해> 60 % 합류로 24- 웰 플레이트로부터의 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ℃).
- 전체 세포 배양액 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 cryotube로 옮긴다. 동결 매체의 500 μL (RPMI 1640, 20 % FCS, 15 %의 디메틸 설폭 시드)를 추가로 혼합하고, 스티로폼 상자 또는 특수 냉동 상자에 넣어. 3 일간 -80 ° C에서 보관. 삼일 후 cryotube 장기 저장을 위해 액체 질소로 전송 될 수있다.
8. 폴리 클로 날 하이 브리 도마의 희석을 제한
- 막개 세포층 문화, 단계 7.1에 설명 된 단계 5에 수확 긍정적 인 클론 세포를 설명한대로. 단계 6.5에 기재된 바와 같이 세포 수를 계산하고, 96 웰 플레이트 10 ㎖의 최종 부피로 10 세포 / ㎖로 세포 수를 조정한다. 100 μL / 웰 상에 공급 층을 추가합니다.
- 37 ℃에서 7 일간 배양 및 현미경 (배율 : 10 배 대물 렌즈, 10 배 눈 조각) 클론 성장을 분석 할 수 있습니다. 단계 3에서 설명한 바와 같이, 배양 상청액의 ELISA를 확인하고, 대량 배양에 적합한 하이 브리 도마 클론을 확인한다.
9. 대중 문화와 단일 클론 항체의 정제
- 이 25cm 또는 75cm이 플라스크에 적절한 ELISA 신호로 하이 브리 도마 클론을 전송하고, 배양 상청액 500 ㎖까지 모은다. 특정 항체의 생산을위한 배양 주간 테스트 3 절약 - 단계 7에 기재된 바와 같이, 장기간의 저장을 위해, 하이 브리 도마 당 5 분취한다.
- (: DH 2 O 3 바인딩 버퍼 1 희석) 세척 완충액으로 세척하여 단백질을 열 준비. 칼럼을 통해 단계 9.2에서 뜨는을 전달하고 플로우를 통해 수집합니다. 0.1 M 시트 레이트, pH를 3.5으로 결합 된 항체를 용출 및 트리스 - 염산 500 μL, pH가 9.0 즉시 pH를 중화.
- SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의해 용출 된 항체의 특성, 최종 응용 프로그램을 확인합니다.
- 5 μL 배 SDS 샘플 로딩 버퍼 (8 % SDS, 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 40 %의 글리세린, 0.015의 추가, 레인 (20 μL 샘플) 당 정제 된 항체 용액의 5 μg의 - SDS 페이지의 경우, 3을 % 브로 모 페놀, 감소)을 5 분 동안 95 ℃에서 프로브를 가열한다. 대조군으로, 정제 된과 동일한 샘플을 사용하여같은 이소하지만 관련이없는 특이성 ntibody.
- , 12.5 % SDS 겔에 샘플을로드 추가 차선에서 흠없는 단백질 사다리의 5 μL를 배치하고, 전기 영동으로 구분합니다. 쿠마 브릴리언트 블루와 젤을 얼룩하고 그 결과를 문서화합니다. 기본 SDS 프로토콜은 1970 15 램 믈리에 의해 설립되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1은 실험실에서 수행 한 면역 용 항원 특이 혈청 역가의 예를 도시한다. 순진한 마우스의 혈청과 비교 5,000,000이 도면에서, 면역 혈청 A 및 B 1:50 내지 1에서 적정 하였다. 항원은 고체 상에 도포하고, 특정의 항체는 POD - 공액 된 염소 항 - 마우스 IG 항체로 검출 하였다. 면역화 된 마우스의 혈청 모두는 나이브 마우스에 비해 상당히 높은 항원 특이 역가를 나타내었다. 하나의 희석에서 신호 5,000 다음 단계, 세포 융합으로 이동하는 것으로 충분하다.
도 2에 도시 된 바와 같이, 하이 브리 도마의 증식은 세포 클론의 발전에 의한 HAT 선택 7 ~ 10 일 후에 가시적이었다. 이미지 10 일 융합 후 96 웰 플레이트에서 촬영됐다. 세포 클론과 우물의 aminopterinemono- 또는 polyclonality개별 현미경 분석 (: 10 배 대물 렌즈, 10 배 눈 조각 배율)으로 관찰 하였다. 모노클 웰 플레이트의 상부에 점으로 표시 하였다. 플레이트를 ELISA에서 시험했을 때, 하이 브리 도마로부터 모노클로 날 항원 특이 적 신호를 쉽게 식별 할 수있다. 양성 하이 브리 도마 배양은 recloned 확대 배양 안정적인 클론, 및 항원 특이 적이었다까지 cryoconserved 하였다. 배양 상등액을 단백질 A-매개되는 친 화성 크로마토 그래피를 통해 생성 된 모노클로 날 항체를 정제하기 위하여 배양 시간 동안 수집 하였다. 도 3은의 IgG1 아이소 타입을 가진 모노클로 날 항체의 표준 용출 프로파일을 나타낸다.
도 4에 도시 된 바와 같이, 모노클로 날 정제 항체는 또한, SDS PAGE를 특징으로 하였다. 50 및 25 kDa의에서는, 중쇄 및 경쇄는 항체 분자의 정제를 나타내는 명확하게 표시했다. 레인 2의동일한 이소와 대조군 항체를 howed.
그림 1 : 예방 접종 후 혈청 적정. 이 마우스에서 혈청 1:50 1까지의 희석으로 적정 하였다 : 5,000,000 및 ELISA에 의한 항원 특이성 테스트. 비 면역화 된 마우스의 혈청 같이 제어 1시 50분의 희석에 사용 하였다. 항원 특이 적 신호는 하이 브리 도마 생성에 사용 된 두 면역화 된 마우스와 마우스 비장 세포 (A)의 양성이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 모노 및 폴리 클로 날 하이 브리 도마의 사진. 모노 폴리 클로 날 숨바꼭질bridomas 현미경으로 십일 세포 융합 후 분석 하였다. 사진은 모노클로 날 (A) 및 폴리 클로 날 (B) 특성을 갖는 안정한 하이 브리 도마 세포주에 대한 통상적 인 결과를 나타낸다. 스케일 바 : 10 μm의; B 스케일 바 : 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :의 IgG1 이소와 단일 클론 항체에 대한 표준 용출 프로파일. 생성 된 단일 클론 항체는 단백질 A-매개되는 친 화성 크로마토 그래피, 및의 IgG1 항체의 용출 프로필은도에 나타나있다. 첫 번째 피크는 pH가 5.0에서 용출 된 단일 클론 항체 분자를 나타냅니다. 다음 봉우리의 pH 3.5, pH가 2.0 나타냅니다. pH를 감소해야완전히 모든 물질의 열을 청소하고 다음 정제를위한 열 매트릭스를 다시 생성 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :의 IgG1 이소와 단일 클론 항체에 대한 표준 SDS 페이지. 항체 용출액의 순도는 코마시 염색 된 SDS-PAGE에 의해 결정 하였다. 항체 용액은 5 μg의 L2에 적용 환원 조건 하에서 L3 표준의 IgG1 항체의 5㎍을 비교 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
하이 브리 도마 기술에 의해 모노클로 날 항체의 생성은 항체가 대상을 인식해야 할 때, 특히 최종 애플리케이션에 대하여, 강한 상세한 에피토프 분석을 요구한다. 이것은 종종 사용자가 과소 평가 약한 공연 항체에 이르게된다. 융합 프로세스는 특정 하이 브리 도마의 결과가이 시점에서 셀 비율과 활력에 크게 의존하는 것을 의미하는, 항상 랜덤이다. 제한 희석 한 후, 셀은 매우 불안정하며, 세포 증식 및 항체 생산의 엄격한 모니터링을 필요로한다. 방법 문제를 해결할 때 이러한 매개 변수를 신중하게 분석해야한다.
기술의 한계점은 세포주를 생성하는 데 필요한 시간 및 원하는 항체 생산 세포의 선택을 포함한다. 융합 후 염색체의 배체 설정으로 인해 세포가 매우 불안정하고 나중에 다시 반수체하는 세트를 줄일 수 있습니다. 이 수세포가 더이상 항체를 생산하지 일으키는 항체 관련 유전자의 손실을 초래할. 또 다른 제한은 원하는 항체 생산 세포의 선택은 배양 상등액에가 아니라 정제 된 항체 용액에 기반한다는 것이다. 따라서, 항체의 최종 특성은, 대부분의 경우에만 가능 선택된 하이 브리 도마 클론의 대량 배양 후. 따라서, 항체의 최종 어플리케이션에서 작동 할 수없는 위험성이 매우 높다.
레이저 기반 분석 및 처리 기술 (LEAP) 16 화성 포획 표면 디스플레이 (ACSD) (17) 또는 겔 microdrop 기술 (18)와 같은 여러 기술적 인 수정은 적절한 항체를 선택시 결점을 회피하기 위해 설명되었다. 이들 모든 방법은 하이 브리 도마 생성 및 선택의 다양한 측면을 개선 할 수 있지만, 대부분은 모든 단세포 리튬위한 고가 장비를 필요로하거나 최적화북동 16.
우리 실험실에서 개발 된 또 다른 개선 또는 수정 Messerschmidt에 등 (19)에 설명 된대로 키메라 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)과 새로운 예방 접종 전략이다. 입자는 바이러스 코트 구조에 삽입하고 그 입자 표면에 제시 원하는 에피토프 서열에 의해 변형 될 수있다. 이는 해당 동물 4 주 후 매우 빠르고 특정 예방 접종에 연결됩니다. 생성 된 단일 클론 항체는 IgG2 또는의 IgG1 아이소 타입이 있고 기본 항원에 대한 매우 구체적인 에피토프 선택에 따라 달라집니다. 또한 인공 세포 표면 마커를 이용하여 하이 브리 도마 세포에 대한 특정 선택 단계를 개발했다. 사용 된 형질 전환 골수종 세포가 안정적으로 삽입 된 표면 마커를 표시. 이 표면 마커, 희석을 제한하지 않고 과도한 ELISA 검사없이 항원하는데 사용 또는 이소 -는 구체적으로 직접 융합 후 하이 브리 도마 세포를 정렬 할 수있다로 기존 하이 브리 도마 기술 (20)에 실제로 필요합니다.
전술 한 바와 같이, 향후에 상기 처리를 개선하고 현재의 하이 브리 도마 기술의 단점을 줄일 수있는, 모노클로 날 항체 생성에 사용할 수있는 일부 유망한 대안이있다. 생성 된 모노클로 날 항체를 성공적으로 작동 할 수 있도록 그럼에도 불구하고, 절차는 항상 엄격한주의 깊게 계획 프로그램과 조합하여 목적하는 에피토프의 상세한 확인을 필요로 할 것이다. 하이 브리 도마 기술에 의해 모노클로 날 항체의 발생으로 인해 과학, 진단 및 치료에 막대한 수요 향후 중요한 필요한 단계가 될 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
