Introduction
Den hybridoma teknologi presenteres i denne protokollen ble først beskrevet av Kohler og Milstein en i 1975, og med unntak for noen tekniske forbedringer, har den viktigste prosedyren ikke endret seg dramatisk i løpet av de siste 40 årene 2. Formålet med denne protokollen er for å forklare en mer hensiktsmessig immunisering strategi, en standard metode for generering av monoklonale antistoffer, og et eksempel på en valideringsmetode (ELISA).
Antistoffer er utrolig verktøy og bidra til en lang rekke teknologiske metoder, som strømningscytometri, magnetisk cellesortering, eller immunofluorescens, samt diagnostiske og terapeutiske muligheter for sykdom overvåking og behandling tre. Den kommersielle tilgjengeligheten av monoklonale antistoffer til ønskede mål er demonstrert ved tilstedeværelsen av over 24 ulike nettdatabaser med nesten utallige mengder av antistoffer eller antistoff-relaterte produkter 4. I 2015, enntibody molekyler var en del av en internasjonal diskusjon 5-7 på grunn av alvorlige problemer i riktig validering og karakterisering av kommersielt tilgjengelige antistoffer.
Det kan være vanskelig og dyrt å finne spesifikke antistoffer for en målrettet antigen, og ofte har de ikke har affinitet eller spesifisitet nødvendig. Selv om det å generere et antistoff er fremdeles tidkrevende og krever faglært personell for å utvikle og validere antistoff, som produserer et antistoff individuelt kanskje bedre enn å kjøpe en.
På grunn av det faktum at antistoffproduksjon er tidkrevende og krever erfaring, ble alternative fremgangsmåter for fremstilling av bindingsmolekyler utviklet for å overvinne disse problemene. Den mest brukte alternativ fremgangsmåte er den rekombinante produksjon av enkeltkjede antistoffer via fag-display. Genene for de variable bindende region er ekstrahert fra celler og kombinert med belegget protein av en fag. de single kjeden blir deretter uttrykt på overflaten av en bakteriofag og vist i flere panning åtte trinn. Produksjon av enkeltkjede antistoffer er litt hurtigere, men det krever også en dyktig experimentalist. Ulempene ved enkelte rekombinante enkelt-kjedede antistoffer er dårlig stabilitet og en mangel på egnet for in vitro diagnostikk. I de fleste diagnostiske tester, er en Fc-reseptor for å påvise det er nødvendig, som må tilsettes til et rekombinant enkelt-kjede antistoff etterpå. Igjen, dette er tidkrevende og enda mer kompleks enn den hybridoma-teknikk. I in vitro diagnostikk, har full-lengde monoklonalt mus og kanin antistoffer vist seg å være det beste valget.
En av de viktigste trinnene i å generere monoklonale antistoffer må gjøres før arbeidet i laboratoriet begynner: utformingen av immunkonjugat. Spørsmål som må tas opp er: Hva er den fysiske sammensetningen av målet i finalen application, og som matriser er til stede? Hvilken konsentrasjon vil målet har i søknaden? Hva er den endelige søknaden, og hva er kravene at antistoff må oppfylle?
alltid ta hensyn til at dersom et lineært peptid-fragment som blir brukt, har det også å være lineær i den endelige epitop på det målet for valg; ellers vil antistoffet ikke binde. Selvfølgelig, uavhengig av screening-metoden, antistoffer kan bli valgt for å gjenkjenne ulike antigene formater i ulike anvendelser, men dette må valideres meget nøyaktig. Dette er årsakene til at antistoffutvikling og validering er slike ambisiøse prosesser.
Valget av antigen format for immunisering er grunnleggende for antistoffutvikling og avgjør suksess eller fiasko for denne prosessen. Når mus uttrykker et aktuelt antistofftiter blir miltcellene isolert og fusjonert med myelomceller. De mest vanlige myelom-cellelinjer formonoklonale antistoffer utvikling er X63-Ag 8,653 9 og Sp2 / 0-Ag 14 10 fra en Balb / c mus belastning. Cellene ned fra en ondartet B-celle lymfom og ble valgt fordi de ikke utskiller noen av sine egne tunge eller lette kjeder. Cellene kan tilpasses til et forhold mellom 1:10 og 10: 1 (splenocytter versus myelomceller). I denne protokollen, ble cellene tilpasset til et forhold på 3: 1 og fusjonert ved polyetylenglykol (PEG) og elektrosveising, i henhold til Stoicheva og Hui 11.
Den sammensmelting av B-celler og myelomceller er en tilfeldig prosess. Derfor er hybrider av to B-lymfocytter, eller to myelomceller kan genereres, men disse hybrider vil ikke være i stand til å overleve i lang tid i kultur. Cellene gjennomgå en hypoxantin, aminopterin, og tymidin (HAT) utvelgelse, ved hvilken bare sammensmeltede hybridoma-celler kan overleve på grunn av muligheten for å bruke de novo syntesen av pyrimidin syntese. For den generasjonen manoclonal antistoffer, er det nødvendig for å oppnå en cellelinje som stammer fra en mor celle. Den monoklonalitet sikres ved å begrense fortynningen teknikker og mikroskopisk analyse av cellevekst. De hybridomkultursupernatantene blir screenet for spesifikk antistoffproduksjon, for det meste ved hjelp av ELISA eller flowcytometri, og de beste bindemidler blir valgt. Etter massekultur og rensing kan antistoffmolekylet endelig være preget og validert for det ønskede programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balb / c eller NMRI-mus (Mus musculus) fra kolonien ved University of Potsdam (Potsdam, Tyskland) ble benyttet til produksjon av monoklonale antistoffer. Dyret arbeidet ble gjennomført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer. Studien ble godkjent av Brandenburg Miljøverndepartementet, Helse og Consumer Protection (referansenummeret V3-2347-A16-4-2012).
1. Utarbeidelse av Immunokonjugater
- For kobling av antigenet til en bærer, å bruke standard koblingsprotokoller via amino-, karboksy- eller sulfo-grupper, så som med glutaraldehyd, N - (3-dimetylaminopropyl) - N-etylkarbodiimid (EDC) eller N - [y-maleimidobutyryloksy ] succinimidester (sulfo-GMBS).
- For kobling (for eksempel med glutaraldehyd) 13 ved å bruke målproteinet eller peptidet og bæreren (ovalbumin, bovint serumalbumin eller keyhole limpet hemocyanin) i et 1: 1 forhold. Spe målet protein eller peptid i fosfat-bufret saltvann (PBS) og bærerprotein i 50 mM NaHCO3 buffer. Tilpass volumet og konsentrasjonen til beløpet som er nødvendig for vaksinasjoner.
- Bland begge løsninger og legge 1,25% glutaraldehyd. Bland og inkuber prøven i 4 timer ved romtemperatur (RT). For å velge hybridomcellene, få samme immunkonjugatet, men med en annen transportør, for å unngå valg av uspesifikke bærerbindemidler.
- Dialyser koplingen prøven ved å utføre en rask dialyse med kommersiell grov harpiks (for eksempel Sephadex G25).
- Perforere bunnen av et 1,5-ml reaksjonsglasset med en hul nål, og plasser det i et 15 ml rør. Sette glassull i bunnen for tetting og dekke den med 300 mg av grov harpiks (til kalibreringsmerke på 0,5 ml).
- Nøye, sette 1 ml PBS dråpevis til en 1,5-ml reaksjonsrøret og sørge for at glassull er fortsatt tette perforeringen. La den grove harpiks sgodt og sentrifuger kolonnen ved 500 x g i 2 min. En slik kolonne kan brukes til å dialyser 200 ul av koplingen prøven. For høyere volumer, lage flere kolonner.
- Endre røret og slippe koblings løsningen på svulmet grov harpiks. Sentrifuger på nytt ved 500 x g i 2 min. Fjern elueringsmiddel fra røret og bruke den for vaksinasjon.
2. Immunisering av dyr
- Velge to eller tre 6- til 12-uker gamle Balb / c-mus for immunisering.
- For ett dyr, forberede 150-200 mikrogram av Immunkonjugat i 200 mL PBS og bland det med 100 ul komplett Freund's adjuvans (CFA). Bland oppløsningen 3 ganger med en kort og tynn nål (0,6 mm diameter) på et 1-ml sprøyte. Injiser oppløsning intraperitonealt i musen.
- Gi en booster-injeksjon 6 uker senere med den samme mengde av immunkonjugatet, men uten CFA. Ta blod 7 dager senere (ut av retroorbital sinus) og behandling anleggre serum ved inkubasjon av blodet i 3 - 4 timer ved romtemperatur (RT).
- Sentrifuger blandingen ved 3000 xg i 5 min. Ta serum supernatanten og overføre den til et nytt rør. Oppbevar den på -20 ° C. Kast pelleten.
- Analyser sera via ELISA, som beskrevet i trinn 3. For fusjon, velger musen med den høyeste titer serum.
- Som forberedelse for cellefusjon, øke mus med 150-200 pg av immunkonjugatet i 300 ul PBS uten adjuvant bare 4 dager før fusjon.
3. ELISA
- Fremstille et antigen-løsning med en konsentrasjon på 5 pg / ml i PBS og overfør 50 pl i hver ELISA-brønn av en 96-brønns plate.
- Inkuber platen i 2 timer ved 37 ° C eller over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer.
- Vask platen 3 ganger med vann fra springen. Blokkere brønner med 80 ul av PBS / 5% nyfødt kalveserum (NCS) per brønn i 1 time ved romtemperatur i et fuktig lmrav. Forbered serumfortynninger i en 1: 5-serien starter med 01:50. For analyse av cellekulturen ved å bruke ufortynnet kultursupernatanten.
- Vask platen 3 ganger med vann fra springen. Pipetter 50 ul av prøven per brønn og inkuberes i 1 time ved romtemperatur i et fuktig kammer. Fremstille sekundære antistoff oppløsning i en 1: 5000 fortynning av geit anti-mus IgG-antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP).
- Vask platen 3 ganger med vann fra springen og tilsett 50 mL av det sekundære antistoff løsning per brønn. Inkuber i 45 minutter ved romtemperatur i et fuktig kammer.
- Forbered en frisk substrat løsning. Gjøre stamoppløsninger av 0,1 M NaH 2PO 4 og 0,1% hydrogenperoksyd. Ta 5 deler NaH 2PO 4, 4 deler hydrogenperoksid, og en del tetrametylbenzidin for fersk substratoppløsningen.
- Vask platen 10 ganger med vann fra springen. Pipetter 50 ul av frisk substratløsning til brønnene og inkuber i 5 - 10 min imørk.
- Stopp reaksjonen med 50 mL 1 MH 2 SO 4 per brønn. Ved anvendelse av en plateleser, måle den optiske tettheten ved 450 nm med en referansebølgelengde på 630 nm.
4. Fremstilling av myeloma cellekulturer
- Fra nå av, utfører alt arbeid under sterile forhold.
- Forbered en frisk dyrkingsmedium for celledyrking. Supplement 500 ml av RPMI 1640 med 10% føtalt kalveserum (50 ml), 2 mM L-glutamin (5 ml), og 50 uM merkaptoetanol (5 ml). Substitute glutamin hver 7. dag.
- Tine en ampulle med muse-SP2 / 0-celler i varmt vann. Overfør celleløsning inn i 10 ml friskt kulturmedium og sentrifuger i 10 minutter ved 200 x g. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml friskt kulturmedium.
- Overfør cellene i en 25-cm 2-kolbe og inkuberes dem ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator. Utvid cellene til to 75-m 2 kolber BEFmalm fusjon. Spar porsjoner for langtidslagring, som beskrevet i trinn 7.
5. Utarbeidelse av feeder-celler
- Ofre en 12-ukers gamle NMRI mus (i henhold til nasjonale og institusjonelle retningslinjer, for eksempel ved CO 2 innånding). Fjern pels og rense magen med 70% etanol.
- Injisere 5 ml iskald RPMI-medium i bukhulen, massere magen med en pinsett, og aspireres matecellesuspensjon. Plassere cellene i en tom 50 ml tube. Utfør dette trinnet igjen. 7 til 10 ml av matecellesuspensjon skal hentes.
- Fremstille en 100-mL mater cellesuspensjonen ved tilsetning av 90 ml komplett cellekulturmedium (RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin og 50 mM merkaptoetanol). Bland det og overføre 100 mL / brønn i 10 x 96-brønners cellekulturplater. Platene inkuberes over natten ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator.
6. Cell Fusion
- Ofre immunisert mus ved halshugging eller CO 2 innånding og avgiftsdirektoratet milten 14. Ta ekstra blod fra hjertet og fremstille serum, som beskrevet i trinn 2.3, som en positiv kontroll i ELISA.
- Forbered en miltcellesuspensjon ved å trykke på milten gjennom en celle sil. Fyll opp til 20 ml med komplett cellekulturmedium. Høste cellene i 50-ml rør ved sentrifugering (200 x g, 10 min, og 4 ° C). Kast supernatanten.
- Skyll cellekulturflaske og høste myelomceller ved sentrifugering (200 x g, 10 min, og 4 ° C) og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelletene i 20 ml balanserte saltbuffer (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl2, 2,5 mM MgCl2 og 5 mM Tris-HCl; pH 7,4) og sentrifuger på nytt. Gjenta vasketrinn tre ganger.
- For justering av splenocytt: myelom-celle-forhold, telle cellene etter det andre vasketrinnet ved granst resuspendering av pelleten i 1 ml BSS buffer. Foreta en fortynning på 1:10 og overføre 10 ul til en celle tellekammer. Telle celler og bestemme cellekonsentrasjonen i 1 ml.
- Juster cellenumrene i BSS-buffer til tre deler splenocytter og en-dels myelomceller i et 1-ml sluttvolum. Ta 200 ul av cellesuspensjonen og blande den med 200 ul av PEG8000 (1 g i 4 ml BSS buffer). Overfør 400 ul inn i en elektroporasjon kyvette med en diameter på 2 mm og setter puls (600-650 V og 25 ms).
- Etter at puls, inkubere cellene ved RT i 3 min i kyvetten. Fjerne cellene og setter dem dråpevis til en Erlenmeyerkolbe med 100 ml av HAT-medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutamin, 50 mM merkaptoetanol, 100 uM hypoxantin, 5,8 uM azaserin, og 16 uM tymidin).
- Gjenta fusjon 4 ganger inntil en-ml parti er brukt. Inkuber Erlenmeyer-kolbe i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2i en inkubator.
- Supplement cellesuspensjonen igjen med hypoxantin, azaserin, og tymidin før plating av cellene på materen lag. Tilsett 100 ul av cellesuspensjonen per brønn til matesjiktplater og inkuberes platene ved 37 ° C og 5% CO2 (i en inkubator). Den endelige konsentrasjonen i brønnen bør være 100 uM hypoxantin, 5,8 uM azaserin, og 16 uM tymidin.
- Utfør en mikroskopisk analyse (forstørrelse: 10X objektiv, 10X øye-stykke) for klonal vekst i hver brønn av platen etter 7 dager for å finne ut om brønnene er mono- eller polyklonale. Monoklonale celler er en klynge av celler som stammer fra en enkelt celle. Polyklonale celler er flere klynger av celler i en brønn. Endre komplett medie etter 7 dager og inkuberes igjen i 7 dager i HAT medium.
- Endre HAT-medium og dyrke cellene i sin helhet cellekulturmedium. Bruk supernatanten for å utføre en ELISA, som beskrevet i trinn 3. Positive hybridomceller må utvides i 24-brønners plater i henhold til testene for produksjon av spesifikke antistoffer. Hvis cellene er polyklonalt, har en begrenset fortynning som skal utføres (beskrevet i trinn 8).
7. kryokonservering av Hybridomer
- Cryoconserve positiv mono- og polyklonale hybridomene for langtidslagring. Høste celler fra en 24-brønns plate med en sammenfletting av> 60% ved sentrifugering (200 x g, 10 min, og 4 ° C).
- Resuspender pelleten i 500 pl komplett cellekulturmedier og overføre den til et kryorør. Legg til 500 mL av fryse medium (RPMI 1640, 20% FCS, og 15% dimetylsulfoksyd), bland det, og legg den i en Styrofoam boks eller en spesiell fryseboksen. Oppbevares ved -80 ° C i 3 dager. Etter 3 dager, kan kryorør overføres til flytende nitrogen for langtidslagring.
8. begrensende fortynning av polyklonale Hybridomer
- Makea mater lag kultur, som beskrevet i trinn 5. Slakte positive polyklonale celler, som beskrevet i trinn 7.1. Tell cellene, som beskrevet i trinn 6.5, og juster celletallet til 10 celler / ml, med et sluttvolum på 10 ml for en 96-brønns plate. Tilsett 100 ul / brønn inn i materen lag.
- Inkuber i 7 dager ved 37 ° C og analysere klonal vekst mikroskopisk (forstørrelse: 10X objektiv, 10X øye-brikke). Gjør en ELISA av kultursupernatanten, som beskrevet i trinn 3, og identifisere de aktuelle monoklonale hybridomaer til massekultur.
9. massekultur og rensing av monoklonale antistoffer
- Overfør de monoklonale hybridomene med de passende ELISA-signalene til 25 cm 2 eller 75 cm2 kolber og samle opp til 500 ml av kultursupernatanten. Test kultur ukentlig for spesifikk antistoffproduksjon og spare 3 - 5 porsjoner per hybridom for langtidslagring, som beskrevet i trinn 7.
- Fremstille en protein A-kolonne ved å vaske det med vaskebuffer (fortynne bindingsbufferen 1: 3 i dH 2 O). Bestå supernatanten fra trinn 9.2 over kolonnen og samler gjennomstrømnings. Eluere det bundne antistoff med 0,1 M citrat, pH 3,5 og nøytralisere pH straks med 500 ul Tris-HCl, pH 9,0.
- Karakterisere eluerte antistoffet ved hjelp av SDS-PAGE, Western Blot, og ELISA, og validere den for den endelige anvendelse.
- For SDS PAGE, ta 3-5 ug renset antistoff løsning per kjørefelt (20 mL prøve), tilsett 5 mL på 4x SDS sample lasting buffer (8% SDS, 20% 2-mercaptoethanol, 40% glyserin, og 0,015 % bromfenol, redusert), og oppvarme probene ved 95 ° C i 5 min. Som en kontroll, bruker den samme prøven med en renset enntibody av den samme isotype, men irrelevant spesifisitet.
- Last prøvene på en 12,5% SDS gel, plassere 5 mL av en unstained protein stige i et ekstra kjørefelt, og skille dem ved elektroforese. Flekk gelen med Coomassie Brilliant Blue og dokumentere resultatene. En grunnleggende SDS-protokollen ble etablert av Laemmli i 1970 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et eksempel på den antigen-spesifikke serum-titer etter en immunisering utført i laboratoriet. I denne figur, ble immunsera A og B titrert fra 1:50 til 1: 5.000.000 i forhold til et serum fra et naivt mus. Antigenet ble belagt på den faste fasen, og de spesifikke antistoffer ble detektert med en POD-konjugert geite-anti-muse-Ig-antistoff. Begge sera fra de immuniserte mus viste en signifikant høyere antigen-spesifikt titer sammenlignet med naive mus. Signalet ved en fortynning på 1: 5000 er tilstrekkelig til å gå videre til det neste trinnet, cellefusjon.
Veksten av hybridomer ble synlig etter 7 til 10 dager i HAT utvalg av utviklingen av cellekloner, som vist i figur 2. Bildet ble tatt fra en 96-brønns plate 10 dager etter fusjon. De cellekloner og aminopterinemono- eller polyclonality av brønneneble overvåket av individuelle mikroskopiske analyser (forstørrelse: 10X objektiv, 10X øye-brikke). Monoklonale brønner ble merket med et punkt på toppen av platen. Når platene ble testet i ELISA, kan antigen-spesifikke signaler fra monoklonale hybridomaer lett identifiseres. Positive hybridoma-kulturer ble reklonet, ekspandert, og cryoconserved inntil kulturen var monoklonale, stabil, og antigen-spesifikke. Kultursupernatanten ble samlet opp i løpet av tiden for dyrking for å rense den fremstilte monoklonale antistoffet via protein A-mediert affinitetskromatografi. Figur 3 viser en standard elueringsprofilen av et monoklonalt antistoff med en lgG1 isotype.
Rensede monoklonale antistoffer ble videre karakterisert ved hjelp av en SDS-PAGE, som vist i figur 4. Ved 50 og 25 kDa, de tunge og lette kjeder var klart synlig, hvilket indikerer at rensing av et antistoffmolekyl. Lane 2 showed et kontroll-antistoff med den samme isotype.
Figur 1: Serum Titrering etter immunisering. Sera fra to mus ble titrert i fortynninger fra 1:50 til 1: 5.000.000 og testet med hensyn til antigenspesifisitet ved en ELISA. Som kontrollserum fra ikke-immuniserte mus ble anvendt i en fortynning på 1:50. Den antigen-spesifikke signaler som var positive for begge immuniserte mus og miltceller fra mus A ble anvendt for hybridoma generasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fotografier av mono- og polyklonale Hybridomer. Mono- og polyklonale hybridomas ble mikroskopisk analysert 10 dager etter cellefusjon. Bildene viser den konvensjonelle resultatet for stabile hybridoma cellelinjer med monoklonalt (A) og (B) polyklonale egenskaper. En skala bar: 10 mikrometer; B skala bar: 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Standard elueringsprofil for et monoklonalt antistoff med en IgG1 Isotype. Den genererte monoklonale antistoffet ble renset ved protein A-mediert affinitetskromatografi, og elueringsprofilen av en lgG1-antistoff er vist i figuren. Den første topp indikerer eluert monoklonale antistoff-molekyl ved pH 5,0. De følgende topper indikerer pH 3,5 og pH 2,0. Den pH-reduksjon er nødvendigfor fullstendig å rense søylen av alle stoffer og for å regenerere kolonnen matrise for de neste rensinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Standard SDS PAGE for et monoklonalt antistoff med en IgG1 Isotype. Renheten av antistoffet elueringsmidlet ble bestemt ved en Coomassie-farget SDS-PAGE. 5 ug av antistoffoppløsningen ble påført på L2 og sammenlignet med 5 ug av et standard lgG1-antistoff i L3 under reduserte betingelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av monoklonale antistoffer ved hybridoma-teknologi krever en intens og detaljert analyse epitop, spesielt med hensyn til den endelige anvendelse, når antistoffet skal gjenkjenne målet. Dette er ofte undervurdert av brukere og fører til antistoffer med svake forestillinger. Fusjonsprosessen er alltid tilfeldig, noe som betyr at resultatet av spesifikke hybridomer er sterkt avhengig av det celle-forhold og vitalitet ved dette punktet. Etter begrenset fortynning, cellene er meget ustabil og krever stringent kontroll av cellevekst og antistoffproduksjon. Disse parametrene bør være nøye analysert ved feilsøking metoden.
Ytterligere begrensninger av den teknikk som omfatter den tid som er nødvendig for cellelinje generering og utvelgelse av den ønskede antistoff-produserende celle. På grunn av den tetraploid kromosomsett etter fusjon, cellene er meget ustabil og etterpå reduserer satt til haploid igjen. dette kanføre til tap av antistoff-relaterte gener, slik at cellene ikke å produsere antistoffer lenger. En annen begrensning er at utvalget av de ønskede antistoffproduserende celler som er basert på kultursupernatanten, og ikke på de rensede antistoffløsninger. Derfor er en endelig karakterisering av antistoffet er, i de fleste tilfeller bare mulig etter massekultur av det valgte hybridom-klon. Således er risikoen for at antistoffet ikke er i stand til å arbeide i den endelige anvendelsen er meget høy.
Flere teknologiske endringer, for eksempel laser-aktivert analyse og prosessteknikk (LEAP) 16, affinitet fangst overflaten display (merket ACSD) 17, eller gel microdrop teknologi 18, ble beskrevet for å omgå ulempene ved valg av egnede antistoffer. Alle disse fremgangsmåter er i stand til å forbedre forskjellige aspekter av hybridom generering og utvelgelse, men de fleste av dem krever kostbart utstyr eller optimalisering for hver enkelt celle line 16.
En annen forbedring eller modifikasjon som ble utviklet i vårt laboratorium er en ny strategi immunisering med kimære viruslignende partikler (VLP), som beskrevet i Messerschmidt et al 19. Partiklene kan modifiseres ved de ønskede antigener innleiret i det virale belegge struktur og presentert på overflaten av disse partikler. Dette fører til meget rask og spesifikk immunisering etter 4 uker i de tilsvarende dyr. De genererte monoklonale antistoffene har IgG2 eller IgG1-isotyper og er avhengig av epitope utvalg meget spesifikt for det native antigenet. Vi har også utviklet et bestemt utvalg skritt for hybridomceller ved hjelp av kunstige celleoverflatemarkører. De brukte transgene myelomcellenes vise en overflate markør stabilt satt inn. Dette overflatemarkør kan benyttes til å antigen eller isotype-spesifikt sortere hybridomceller direkte etter fusjon, uten å begrense fortynningen og uten overdreven ELISA-screening,som faktisk er nødvendig i konvensjonell hybridoma teknologi 20.
Som nevnt ovenfor, er det noen lovende alternativer som er tilgjengelige i monoklonalt antistoff generasjon som, i fremtiden, kan bedre håndtering og reduserer ulempene med den aktuelle hybridomteknologi. Ikke desto mindre, vil prosedyren alltid krever den detaljerte forklaringen av det ønskede epitop i kombinasjon med en streng og nøye planlagt program slik at den genererte monoklonale antistoff virker på riktig måte. Den generasjonen av monoklonale antistoffer ved hybridoma teknologi vil være et viktig og nødvendig skritt i fremtiden på grunn av den enorme etterspørselen i vitenskap, diagnostikk og terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
