Introduction
Bu protokol sunulan hibridoma teknolojisi ilk Köhler ve 1975 yılında Milstein 1 tarafından tarif edilmiştir ve bazı teknik iyileştirmeler dışında, ana prosedür son 40 yıl 2 sırasında önemli ölçüde değişmedi. Bu protokolün amacı, daha uygun bir aşı stratejisi, monoklonal antikorların üretilmesi için standart bir yöntem ve bir doğrulama yöntemi (ELISA) için bir örnek açıklamaktır.
Antikorlar inanılmaz araçlar ve hastalık izleme ve tedavi 3 tanı ve tedavi seçenekleri yanı sıra, bu tür flow sitometri, manyetik hücre sıralama, ya da immünofloresan gibi teknolojik yaklaşımlar, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. İstenilen hedeflere yönelik monoklonal antikorların, ticari uygunluk antikorlar veya antikor-ilgili ürünlerin 4 yaklaşık sayısız miktarlarda 24 farklı bir web veri tabanları varlığı ile ortaya konmuştur. 2015 yılında, birntibody moleküller nedeniyle uygun doğrulama ve piyasada mevcut antikorların karakterizasyonu ciddi sorunlara uluslararası bir tartışmanın 5-7 parçasıydı.
Hedef bir antijen için spesifik antikorları bulmak zor ve pahalı olabilir, ve genellikle, bu afinite ve özgüllük gerekli bulunmamaktadır. Bir antikor üreten hala zaman alıcı ve kudret daha iyi bir satın alma daha ayrı bir antikor üreten, geliştirmek ve antikor doğrulamak için kalifiye personele ihtiyaç duyar rağmen.
Nedeniyle antikor üretimi zaman alıcıdır ve deneyim gerektirir olması, bağlama moleküllerinin üretimi için alternatif yöntemler, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan alternatif bir yöntem, faj gösterimi ile, tek zincirli antikorların rekombinant üretimi. Değişken bağlayıcı bölge genleri hücrelerinden ekstre edilmiş ve bir faj kaplama proteini ile bir araya getirilmektedir. sIngle zinciri daha sonra bakteriyofaj yüzeyi üzerinde ifade edilir ve birden fazla kaydırma adımda 8 taranır. Tek zincirli antikorların üretimi daha hızlıdır, ancak, aynı zamanda, bir uzman deneye gerektirir. Bazı biraraya getiren tek zincirli antikorların dezavantajları kötü istikrar ve in vitro diagnostik için uygunluk eksikliği vardır. En tanısal testlerde, saptama için bir Fc-reseptörü sonradan yeniden birleştirici tek zincirli antikor eklenmesi ihtiyacı olan gereklidir. Yine, bu zaman alıcı ve hibridoma tekniği daha fazla karmaşıktır. In vitro diagnostik, tam uzunlukta monoklonal fare ve tavşan antikorları en iyi seçenek olarak gösterilmiştir.
immüno tasarımı: laboratuarda çalışma başlamadan önce monoklonal antikorların üretilmesi önemli adımlardan biri yapılmalıdır. ele alınması gereken sorular şunlardır: Nihai applicat hedefin fiziksel kompozisyonu nediriyonu ve mevcut olduğu matrisler? hedef uygulamada hangi konsantrasyon olacak? Nihai uygulama nedir ve antikor yerine getirmesi gerektiğini istenenler nelerdir?
Her zaman doğrusal bir peptid fragmanı kullanıldığı takdirde, aynı zamanda seçim hedefi nihai epitop doğrusal gerektiği dikkate almak; aksi halde, bir antikor bağlamayacaktır. Tabii ki, tarama yönteminin, bağımsız olarak, antikorlar, farklı uygulamalarda farklı antijenik biçimleri tanıyan seçilebilir, ancak bu çok kesin doğrulanması gerekir. Bu antikor geliştirme ve doğrulama gibi iddialı süreçlerdir nedenleri vardır.
bağışıklama için antijenik biçimi seçimi antikor gelişimi için esastır ve bu sürecin başarısını veya başarısızlığını belirler. farenin ilgili bir antikor titresi ifade sonra, dalak hücreleri izole edildi ve miyeloma hücreleri ile birleştirilmiştir. En sık miyeloma hücre çizgilerifare monoklonal antikor gelişimi X63-Ag 8,653 9 ve Balb / c fare suşundan SP2 / 0-Ag 14 10 vardır. Hücreler malign B hücre lenfoması soyundan ve kendi ağır veya hafif zincirlerinin bir salgılar çünkü seçilmiştir. 1 (miyelom hücreleri karşı splenositler): hücreler 1:10 ile 10 arasında bir oranda uyarlanabilir. Stoicheva Hui 11'e göre, 1 ve polietilen glikol (PEG) ve elektrofüzyon ile kaynaşık: Bu protokol, hücrelerin 3 bir oranda uyarlanmıştır.
B hücreleri ve miyelom hücrelerinin füzyonu rasgele bir süreçtir. Bu nedenle, iki B lenfositleri ya da iki miyelom hücrelerinin hibridlerinin oluşturulmasına olabilir, ancak bu melez kültürde uzun süre hayatta mümkün olmaz. Hücreleri sadece kaynaşık hibridoma hücreleri nedeniyle pirimidin sentezi de novo yolu kullanan olasılığı dayanabildiği bir hipoksantin, aminopterin ve timidin (HAT) seçimi, tabi tutulur. mon üretimi içinoclonal antikorlar, bir ana hücreden kaynaklanan bir hücre çizgisi elde etmek için gereklidir. monoklonalitenin seyreltme teknikleri ve hücre büyümesinin mikroskobik analizi sınırlayarak sağlanır. hibridom kültür süpernatantları çok ELISA ile spesifik antikor üretimi için ya da akış sitometrisi, ve en iyi bağlayıcılar seçilebilirler. kitle kültürü ve saflaştırmadan sonra, antikor molekülü son karakterize edilebilir ve arzu edilen uygulama için doğrulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Potsdam'ın University (Potsdam, Almanya), bizim ıslah kolonisinden Balb / c ya da NMRI fareleri (Mus musculus) monoklonal antikorların üretilmesi için kullanıldı. Hayvan çalışmaları, ilgili ulusal ve uluslar arası kurallara göre yapılmıştır. Çalışma Ortamı, Sağlık Brandenburg Bakanlığı ve Tüketiciyi Koruma (referans numarası V3-2347-A16-4-2012) tarafından onaylanmıştır.
Immüno 1. Hazırlık
- Bir taşıyıcıya antijen bağlanması için, amino- ile standart eşleme protokollerini kullanarak, örneğin glutaraldehid, N ile olduğu gibi karboksi ya da sülfo-gruplan, - (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid (EDC) veya N - [y-maleimidobutiriloksi ] süksinimid ester (sülfo-GMBS).
- : 1 oranında (glutaraldehitle ör) bağlantı 13, bir 1 hedef proteini veya peptidi ve bir taşıyıcı (ovalbümin, büyükbaş hayvan serum albümini veya anahtar deliği limpet hemosiyanin) kullanın. Hedef pr seyreltinotein veya fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 50 mM NaHCO 3 tamponunda taşıyıcı protein peptid. hacim ve aşılar için gerekli miktara konsantrasyonu uyarlayın.
- Her iki çözüm karıştırın ve% 1.25 glutaraldehid ekleyin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 4 saat (RT) örnek inkübe edilir. hibridoma hücreleri seçmek için aynı immünokonjugatı yapmak, ancak başka bir taşıyıcı ile, sırayla belirsiz taşıyıcı bağlayıcıların seçimi önlemek için.
- (Örneğin, Sephadex G25) ticari kaba reçine ile hızlı bir diyaliz gerçekleştirerek bağlantı örneği dialyze.
- içi boş bir iğne ile bir 1.5 ml reaksiyon şişesine alt delmek ve bir 15 ml tüp içine koyun. Sızdırmazlık için alt cam yünü koyun ve (0.5 mL kalibrasyon işareti) kaba reçine 300 mg ile örtün.
- Dikkatle, 1.5 ml reaksiyon tüpüne 1 ml PBS damla damla koymak ve cam yünü hala perforasyon sızdırmazlık emin olun. kaba reçine s Letiyi ve santrifüj 2 dakika süreyle 500 xg'de sütun. Bu tür bir kolon birleştirme örnek 200 uL diyaliz için kullanılabilir. yüksek miktarlar için, daha fazla sütun yapmak.
- hortumunu değiştirin ve kabarmış kaba reçine üzerine bağlantı çözümü bırakın. Santrifüj tekrar 2 dakika süreyle 500 xg'de. tüpten eluent çıkarın ve bağışıklama için kullanabilirsiniz.
Hayvanların 2. Bağışıklama
- immünizasyon için, iki ya da üç 6 ila 12 haftalık Balb / c fareleri seçin.
- 200 ul PBS içinde immüno 200 ug ve tam Freund's yardımcı madde, 100 uL (CFA) ile karıştırarak - bir hayvan için, 150 hazırlayın. 1 ml şırınga çözelti bir kısa ve ince bir iğne ile 3 kez (0.6 mm çap) karıştırın. fare içine intraperitoneal çözüm enjekte.
- 6 hafta sonra immüno aynı miktarda bir yükseltici enjeksiyonu, ama CFA olmadan. (Retroorbital sinüs dışarı) 7 gün sonra kan ve Koordinatörler alınOda sıcaklığında 4 saat (RT) - 3 için kan inkübe edilerek serum yeniden.
- 5 dakika boyunca 3.000 xg'de karışımı santrifüj. Serum süpernatant atın ve yeni bir tüp içine aktarın. -20 ° C'de saklayın. pelet atın.
- ELISA aracılığıyla sera analiz, füzyon için Adım 3'te açıklandığı gibi, en yüksek serum titresi ile fare seçin.
- Sadece 4 gün füzyon önce adjuvan olmadan PBS 300 uL immüno 200 mikrogram - hücre füzyonu için hazırlık olarak, 150 ile fare artırmak.
3. ELISA
- PBS içinde 5 mg / mL'lik bir konsantrasyon ile bir antijen çözeltisi hazırlayın ve 96 oyuklu plakanın her bir ELISA içinde 50 uL aktarın.
- 37 ° C ya da gece boyunca nemli bir oda içinde 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
- musluk suyu ile plaka 3 kez yıkayın. Nemli Ch, oda sıcaklığında 1 saat boyunca göz başına PBS /% 5 neonatal dana serumu, 80 uL (NCS) ile kuyu blokekehribar. 1:50 ile başlayan 5 serisi: 1 serum dilüsyonları hazırlayın. hücre kültürü analizi için, seyreltilmemiş kültür süpernatanı kullanımı.
- musluk suyu ile plaka 3 kez yıkayın. Pipet 50 oyuk başına örnek ul ve nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş bir keçi anti-fare IgG antikoru 5000 seyreltme: 1 ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
- musluk suyu ile plaka 3 kez yıkanır ve her ikincil antikor çözeltisinin 50 ul ekle. nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin.
- taze bir substrat çözeltisi hazırlayın. 0.1 M NaH 2 PO 4 ve% 0.1 hidrojen peroksit stok çözümleri olun. 5 parça NaH 2 PO 4, 4 kısım hidrojen peroksit ve taze alt-tabaka çözeltisi 1 parçası tetrametilbenzidin al.
- musluk suyu ile plaka 10 kez yıkayın. Pipet 50 kuyulara taze substrat çözeltisi uL ve 5 için inkübe - 10 dakikakaranlık.
- 50 uL 1 MH 2 kuyu başına SO 4 ile reaksiyonu durdurun. Bir levha okuyucu ile 630 nm'de bir referans dalga boyu ile 450 nm'de optik yoğunluk ölçülür.
Miyelom Hücre Kültürleri 4. hazırlanması
- Şu andan itibaren, steril koşullar altında tüm çalışmaları gerçekleştirmek.
- Hücre ekimi için taze bir kültür ortamı hazırlayın. % 10 fetal dana serumu (50 mL), 2 mM L-glutamin (5 ml) ve 50 uM merkaptoetanol (5 mL) ile RPMI1640 500 mL Supplement. Her 7 gün glutamin değiştirin.
- Sıcak su içinde murin SP2 / 0 hücre şişe çözülme. 200 x g'de 10 dakika süre ile taze kültür ortamı ve santrifüj 10 ml hücre solüsyonu aktarın. Süpernatant atılır ve taze kültür ortamına 1 mL pelletini.
- 25 cm2 şişeye hücreleri aktarın ve bir kuluçka CO2 37 ° C'de inkübe ve% 5. İki 75-m hücreleri genişletmek 2 şişeler befcevher füzyon. Adım 7'de tarif edildiği gibi, uzun süreli depolama için alikotları koruyun.
Besleyici hücreler 5. hazırlanması
- (; Örneğin, CO 2 inhalasyon yoluyla ulusal ve kurumsal kurallarına göre) 12 haftalık NMRI fare Kurban. kürk çıkarın ve% 70 etanol ile karın temizleyin.
- , Karın içine buz RPMI ortamı 5 ml enjekte edilir bir cımbız ile karın masaj ve besleyici hücre süspansiyonu aspire. Boş 50 ml bir tüp içinde hücreleri yerleştirin. bir kez daha bu adımı gerçekleştirin. besleyici hücre süspansiyonu, 7 ila 10 ml geri alınmalıdır.
- Tam hücre kültür ortamında 90 mL (RPMI 1640,% 10 fetal dana serumu, 2 mM glutamin, ve 50 uM merkaptoetanol) ekleyerek 100 mL'lik besleyici hücre süspansiyonu hazırlamak. Karıştır ve 10 x 96 gözlü hücre kültür levhaları içerisine oyuk başına 100 uL / aktarın. Gece boyunca kuluçka makinesi içinde 37 ° C ve% 5 CO2 de inkübe edin.
6. Hücre Füzyon
- Servikal dislokasyon veya CO 2 inhalasyon yoluyla bağışıklı fare Kurban ve dalak 14 tüketim. ELISA'da pozitif kontrol olarak, aşama 2.3'de tarif edildiği gibi, kalp ek kan örneği ve serum hazırlamak.
- Bir hücre süzgecinden dalak basarak bir dalak hücre süspansiyonu hazırlayın. Tam hücre kültür ortamı ile 20 ml'ye kadar doldurun. santrifüj ile 50 ml tüpler hücreleri hasat (200 x g'de, 10 dakika, 4 ° C). süpernatant atın.
- Hücre kültür şişesi yıkayın ve santrifüj ile miyeloma hücreleri hasat (200 x g'de, 10 dakika, 4 ° C) ve süpernatant atılır.
- 20 dengeli tuz tamponu (BSS) hücre pelet yeniden süspanse (125 mM NaCI, 5 mM KCI, 4 mM CaCl2, 2.5 mM MgCl2, 5 mM Tris-HCI, pH 7.4) ve santrifüj daha. Yıkama üç kez adımları tekrarlayın.
- splenosit ayarlamak için: miyelom hücre oranı, köknar ikinci yıkama aşamasından sonra hücreleri saymakSt BSS tamponu 1 mL içinde topağın tekrar askıda. 1:10 seyreltme yapın ve bir hücre sayım odasına 10 uL aktarın. Hücre sayımı ve 1 ml hücre konsantrasyonunu belirler.
- 1 ml nihai hacim içinde üç parça splenosit ve tek parçalı bir miyelom hücrelerine BSS tamponu içinde hücre sayısını ayarlar. Hücre süspansiyonunun 200 uL al ve PEG8000 200 uL (BSS 4 ml tampon içinde 1 g) ile karıştırın. 2 mm çapındaki bir elektroporasyon küvetine 400 uL aktarın ve nabız ayarlayın (600-650 V ve 25 ms).
- nabız sonra küvet içinde 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe hücreleri. hücreleri çıkarın ve HAT ortamı 100 mL (RPMI 1640,% 10 FCS, 2 mM glutamin, 50 uM merkaptoetanol, 100 uM hipoksantin, 5.8 uM azaserin, ve 16 uM timidin) sahip bir Erlenmeyer şişesi içine damlatılmıştır.
- 1-ml toplu harcanan kadar füzyon 4 kez tekrarlayın. 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde 3 saat Erleni inkübebir kuluçka makinesi içinde.
- besleyici katmandaki hücreleri kaplama önce hipoksantin, azaserin ve timidin ile tekrar hücre süspansiyonu Supplement. Besleyici tabaka plakalarına yuva başına hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve 37 ° C'de ve% 5 (bir kuluçka makinesi içinde) CO2 de inkübe edin. oyuk içindeki nihai konsantrasyon 100 uM hipoksantin, 5.8 uM azaserin, ve 16 uM timidin olmalıdır.
- kuyu mono- ya da poliklonal olup olmadığını tespit etmek amacıyla 7 gün sonra plakanın her bir klonal büyümesi için iyi: mikroskopik analiz (10X objektif lens, 10X göz parça büyütme) uygulayın. Monoklonal hücreler tek bir hücrenin köken hücrelerin bir küme vardır. Poliklonal hücre, bir gözdeki hücrelerin birden çok kümelerdir. 7 gün sonra tam ortam değiştirme ve HAT ortamında 7 gün daha inkübe edilir.
- HAT ortamı değiştirin ve tam hücre kültürü ortamında hücreleri yetiştirmek. Bir E gerçekleştirmek için süpernatant kullanınAşama tarif edildiği gibi lisa 3. Pozitif hibridoma hücreleri özel antikorların üretimi için testlere göre 24 oyuklu plakalar içinde yayılması gerekir. Hücreler poliklonal ise, sınırlı seyreltme (aşama 8'de tarif) yapılmalıdır.
Hibridomalar 7. dondurarak korunması
- Uzun süreli depolama için pozitif mono- ve poliklonal hibridomalar Cryoconserve. santrifüj ile>% 60 bir izdiham ile 24 oyuklu plaka hücreleri hasat (200 x g'de, 10 dakika, 4 ° C).
- Tam hücre kültür ortamının 500 uL pelletini ve cryotube içine aktarın. Dondurarak ortamın 500 uL (RPMI 1640,% 20 FCS ve% 15 dimethylsülfoksit) ekleyin karıştırın ve bir strafor kutu veya özel bir dondurma kutusuna koydu. 3 gün -80 ° C'de saklayın. 3 gün sonra, cryotube uzun süreli saklama için sıvı nitrojen aktarılabilir.
8. Poliklonal hibridomalar sınırlayıcı seyreltme
- MakEA besleyici tabaka kültürü, Aşama 7.1'de tarif edildiği gibi Adım 5. Hasat pozitif poliklonal hücreleri tarif edildiği gibi. Aşama 6.5 de tarif edildiği gibi, hücre sayımı ve 96 oyuklu bir plaka 10 mL'lik bir son hacme sahip 10 hücre / ml hücre sayısını ayarlamak. 100 uL / oyuk üzerine besleme katmanı ekleyin.
- 37 ° C'de 7 gün inkübe ve mikroskopik (büyütme: 10X objektif lens, 10X göz parça) klonal büyüme analiz. Aşama 3'te tarif edildiği gibi, kültür süpernatanı içinde bir ELISA olun ve kütle kültürü için uygun monoklonal hibridomlar tespit.
9. Kütle Kültür ve monoklonal antikorların saflaştırılması,
- 25 cm2 veya 75 cm2 şişelerde uygun ELISA sinyalleri ile monoklonal hibridomalar transferi ve kültür yüzey 500 mL'ye toplar. özel bir antikor üretimi için kültür haftalık test edin ve 3 muhafaza - Adım 7'de tarif edildiği gibi, uzun süreli depolama için hibridoma başına 5 alikotları.
- (: DH 2 O 3 bağlayıcı tampon: 1 seyreltin) yıkama tamponu ile yıkanarak bir protein, bir kolon hazırlanmıştır. kolonu üzerinde Adım 9.2 süpernatant Pass ve flow-through toplamak. 0.1 M sitrat, pH 3.5 ile bağlı antikoru Zehir ve Tris-HCl, 500 uL, pH 9.0 hemen pH nötralize.
- SDS-PAGE, Western Blot, ve ELISA ile elüt antikoru karakterize ve son uygulama için doğrulamak.
- 5 uL 4 x SDS numune yükleme tamponu (% 8 SDS,% 20 2-merkaptoetanol,% 40 gliserin ve 0.015 ekleyin, şerit (20 uL numune) her saflaştınlmış antikor çözeltisi 5 ug - SDS PAGE için, 3 sunar % bromofenol, indirgenmiş) ve 5 dakika boyunca 95 ° C 'de probları ısıtın. Bir kontrol olarak, saflaştırılmış A ile aynı örnek kullanımıAynı izotip ancak özgüllüğü belli olmayan ntibody.
- ,% 12.5 SDS jel örnekleri yükleyin ek şeritte bir boyanmamış protein merdiven 5 uL koyun ve elektroforez ile ayırın. Coomassie Brillant Blue ile jel Leke ve sonuçları belgelemek. Temel SDS protokolü 1970 15 Laemmli tarafından kurulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, laboratuarda yapılan bir immünizasyon için antijene özel serum titeri bir örneğini göstermektedir. naif fare serumu ile karşılaştırıldığında 5,000,000: Bu şekilde, bağışıklık serasının A ve B 1:50 1 ila titre edilmiştir. Antijen katı faz üzerinde kaplanmış ve spesifik antikorlar POD-konjuge keçi anti-fare Ig antikoru ile tespit edilmiştir. bağışıklık kazandırılmış farelerin iki sera naif fare ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir antijene spesifik titresi göstermiştir. 1 bir seyreltme sinyal: 5000 bir sonraki aşamada, hücre füzyonunun geçmek için yeterli olmaktadır.
Şekil 2'de gösterildiği gibi, hibridomaların büyümesi, hücre klonlarının geliştirilmesi yolu ile HAT seçimine 7 ila 10 gün sonra görünür. Resim 10 gün füzyon sonra 96 oyuklu bir plakada edildi. hücre klonları ve kuyu aminopterinemono- ve poliklonalBireysel mikroskobik analizler (: 10X objektif lens, 10X göz parçalı büyütme) tarafından izlendi. Monoklonal kuyu plaka üzerine bir nokta ile etiketlenmiştir. Plakalar ELISA'da test edildiğinde, monoklonal hibridomlardan antijene spesifik sinyaller kolayca tespit edilebilir. Pozitif hibridom kültür, yeniden klonlandı genişletilmiş ve kültür stabil monoklonal, ve antijene özgü kadar kriyo-konserve edildi. Kültür yüzer madde protein A-aracılı afinite kromatografisi ile üretilen monoklonal antikoru saflaştırmak üzere yetiştirme zamanında toplanmıştır. Şekil 3, bir IgG1 izotipine sahip bir monoklonal antikor standart bir elüsyon profilini gösterir.
Şekil 4'te gösterildiği gibi, saflaştırılmış monoklonal antikorlar ayrıca, bir SDS-PAGE ile karakterize edilmiştir. 50 ve 25 kDa 'de, ağır ve hafif zincirlerinin bir antikor molekülünün saflaştırılmasına gösteren açıkça görülebilir. Şerit 2 sAynı izotip ile kontrol antikoru howed.
Şekil 1: Bağışıklama sonrası serum Titrasyon. İki farelerden elde edilen serumlar 1:50 1 kadar gelen seyreltiler halinde titre edilmiştir: 5.000.000 ve ELISA ile antijen özgüllüğü bakımından test edilir. olmayan bir immünize fare kontrol serum 1:50 seyreltme kullanılmıştır. antijene spesifik sinyaller hibridoma üretimi için kullanılan her iki aşılanmış farelerden ve fare splenositleri için pozitiftir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: mono-ve poliklonal hibridomlar elde edilen fotoğraflar. Mono-ve poliklonal HYbridomas mikroskobik 10 gün hücre füzyon sonra analiz edilmiştir. Resimlerde monoklonal (A) ve poliklonal (B) özelliklere sahip stabil hibridoma hücre çizgileri için geleneksel sonucunu göstermektedir. Bir ölçek çubuğu: 10 um; B ölçek çubuğu: 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: bir IgG1 izotipine bir monoklonal antikor için standart Elüsyon profili. üretilen monoklonal antikor proteini A aracılı afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve bir IgG1 antikoru çıkan madde profili şekil gösterilmektedir. birinci pik pH 5.0 elüt monoklonal antikor molekülü belirtir. Aşağıdaki zirveler, pH 3.5 ve pH 2.0 göstermektedir. pH azaltılması gereklidirTamamen tüm maddelerin sütunu temizlemek için ve bir sonraki saflaştırma için sütun matrisi yeniden oluşturmak için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: bir IgG1 izotipine bir monoklonal antikor için standart SDS-PAGE. Antikor elüsyon saflığı Coomassie boyalı SDS-PAGE ile tespit edilmiştir. Antikor çözeltisi 5 ug L2 uygulanır ve indirgenmiş koşullar altında L3 standart IgG1 antikoru 5 ug ile karşılaştırılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorların üretimi, antikor hedefi kabul ne zaman, özellikle de son uygulama ile ilgili olarak, yoğun ve ayrıntılı epitop analizi gerektirir. Bu genellikle kullanıcılar tarafından hafife ve zayıf performansları ile antikorlara neden olmaktadır. Füzyon işlemi spesifik hibridomlar sonucu bu noktada hücre oranı ve canlılık üzerine son derece bağlı olduğu anlamına gelir, her rastgele. Sınırlı seyreltildikten sonra, hücreler, çok dengesizdirler ve hücre büyümesi ve antikor üretimi sıkı kontrol edilmesi gereken. yöntemi giderirken bu parametreler dikkatle analiz edilmelidir.
tekniğin başka sınırlamalar hücre çizgisi oluşturulması için gerekli olan zamanı ve arzu edilen antikor üreten hücre seçimini içerir. füzyon sonra kromozomların tetraploid kümesi nedeniyle, hücreler çok kararsız ve daha sonra tekrar haploid için set azaltır. Bu olabilirHücreler artık antikor üretmeyen neden antikor-ilgili genler kaybına yol açar. Diğer bir sınırlama, istenen antikor üreten hücrelerin seçimi kültürü üst sıvısı için olup saflaştınlmış antikor çözeltileri göre olmasıdır. Bu nedenle, son antikor karakterizasyonu, çoğu durumda, mümkün seçilen hibridom klonunun kütle kültürden sonra. Böylece, antikor son uygulamada çalışmak mümkün değildir riski çok yüksektir.
Bu tür lazer özellikli analiz ve işleme teknolojisi (YEEP) 16, afinite yakalama yüzey ekran (ACSD) 17 ya da jel microdrop teknolojisi 18, gibi bazı teknolojik değişiklikler, uygun antikorların seçimi sırasında sorunların üstesinden gelmek için tarif edildi. Tüm bu yöntemler hibridoma üretimi ve seçimi farklı yönlerini geliştirmek mümkün, ancak bunların çoğu her hücre li için pahalı ekipman ya da optimizasyon gerektirirne 16.
Laboratuarımızda geliştirilen bir diğer gelişme ya da değişiklik Messerschmidt et al 19 de tarif edildiği gibi kimerik virüs benzeri partiküller (VLP'ler) ile yeni bir aşı stratejisi. parçacıklar viral kaplama yapısı içinde gömülmüş ve bu parçacıkların yüzeyinde bulunan, içinde istenilen epitopun dizileri ile değiştirilebilir. Bu, ilgili hayvan içinde 4 hafta sonra, çok hızlı ve spesifik bağışıklık yol açar. üretilen monoklonal antikorların IgG2 ya izotipleri IgG1 ve doğal antijen için yüksek düzeyde spesifik epitop seçimi bağlıdır. Ayrıca, yapay hücre yüzey markörleri kullanılarak hibridoma hücreleri için belirli bir seçme adımında geliştirdi. kullanılan transjenik miyeloma hücreleri kararlı bir şekilde yerleştirilen bir yüzey işaretleyici gösterir. Bu yüzey işaretleyici, seyreltme kısıtlamadan ve aşırı ELISA tarama olmadan, antijen için kullanılan ya da izotip-spesifik doğrudan füzyon sonra hibridoma hücrelerinin sıralamak mümkündürgibi geleneksel hibridoma teknolojisi 20 aslında gereklidir.
Yukarıda sözü edildiği gibi, gelecekte işlenmesini geliştirmek ve mevcut hibridom teknolojisi sakıncaları azaltabilecek, monoklonal antikor üretimi uygun bazı umut verici alternatifler vardır. üretilen monoklonal antikor başarıyla çalıştığı için Bununla birlikte, prosedür her zaman sıkı bir dikkatle planlanması uygulaması ile birlikte arzu edilen epitopu ayrıntılı olarak tespit gerektirecektir. hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorların üretimi nedeniyle bilim, teşhis ve tedavide büyük talep gelecekte önemli ve gerekli bir adım olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
