Introduction
虚血性心疾患およびこれらの合併症は、世界中の主要な死因の一つです。現在の治療戦略が狭く、血管を拡張するか、またはバイパスを作成することによってのいずれかで、再確立の血流に焦点を当てます。静脈自家移植片を用いて、冠動脈バイパス術（CABG）は、最初1968年に記載されたし、長年にわたって洗練されています。離れて左冠動脈前下行枝の血行再建から、伏在静脈導管は、最も一般的に1を使用しています。しかし、グラフト開存は、伏在静脈グラフト（SVG）のアキレス腱のまま。一年間手術後、グラフト開存は、10年2,3後に61％に低下、85％です。 SVGの開存損失の病態生理学的メカニズムと原因を発表することが重要な作業です。
このビデオでは、静脈グラフトの損失を調査するため、ラットの静脈介在モデルを示しています。この方法の全体的な目標は、基礎となる病理生物学を探求していますそして、-physiologicalプロセス疾患の進行中に、薬剤や治療法の選択肢のテストに適したモデルを開発します。動脈系への浅腹壁静脈に移植することにより、このモデルは、厳密に、冠状動脈バイパス移植の臨床状況を模倣します。外科的外傷、虚血、および壁応力は、病理学的な血管の変化の重要なトリガーであると説明したモデルで模倣されています。
異なるモデルと種が静脈グラフト開存損失を調査するために利用可能です。このような豚4、ヒツジ5、犬6、およびサル7などの大型動物モデルは、人間の血管との解剖学的構造に似ているので、8をテストするために、このようなバイパスステント留置術または新しい外科技術のような複雑な治療戦略を可能にします。しかし、特別な住宅、設備、スタッフが必要とされています。また、高コストと手術中の追加の麻酔医の必要性は、そのより広範な適用を妨げます。 Smのラットを含めたすべての動物は、特別な住宅を必要としない、取り扱いが容易で、かつ管理コストを持っています。マウスモデル9,10に比べて、ラットのモデルは結果より良い操作性、したがってより少ない可変性という利点を有します。ラットは、生理学的および遺伝的にマウス11,12よりヒトに類似しています。さらに、ほとんどの野生型マウスは、IIエラーを入力しやすいマウスモデルを作る限定myointima 13を 、開発します。このような下大静脈などの主要なマウスの静脈の組織学は、わずか数細胞層で構成され、13難しい早期評価をレンダリングします。さらなる欠点は、移植片回収後のその後の分析のために利用可能な組織の少量です。
このビデオで説明したモデルは、再現可能な、安価、かつ実施が容易であり、迅速かつ確実に確立することができます。このようなウイルスベクターのような高価な実験的な治療薬を評価するために特に適しています経済的な様式で、遺伝子治療のために。
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Protocol
動物は、実験動物資源研究所が作成し、国立衛生研究所が発行し、実験動物の原則のためのガイドに準拠した人道的なケアを受けました。全ての動物プロトコルは責任を負う地方自治体（「AMTのエリーゼお大事にウントVerbraucherschutz、Hansestadt（保健・消費者保護のためのオフィス）ハンブルグ」）によって承認されました。
1.動物ケア
- 実験動物研究所から300〜350グラムの重さのLewisラット（LEW / CRL）ラットおよびROSA /ルシフェラーゼ - LEWトランスジェニックラットを入手します。
- 換気キャビネットに従来の条件の下でラットを維持し、それらを標準ラット飼料およびオートクレーブ処理水を自由に食べます。
- ドナーとレシピエントとして同系LEW / CrlをラットなどROSA /ルシフェラーゼ - LEWトランスジェニックラットを用いて、移植片移植を行います。
ドナーラットの作製
- 入会を使用してくださいイソフルラン（2.5から3パーセント）でラットをanaesthetizeするイオンチャンバー。
- その背中にラットを置き、口と鼻を覆うフェイスマスクで麻酔を維持します。後肢の足をつまんや反射の不在を確認することにより、麻酔の十分な深さを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目にいくつかの獣医軟膏を適用します。
- 後ろ足を広げ、テープを使用して自分の位置を固定します。
- ヘアトリマーと鼠径部の毛を剃ると、80％エタノールに続いてポビドンヨードを使用して領域全体を消毒。二回消毒手順を繰り返します。
注：手術領域、ガーゼ、および手術器具を滅菌する必要があります。作業中は無菌領域を維持し、単回使用、無菌手術用手袋、マスク、帽子を着用してください。 - 顕微鏡下で、リネアの鼠径沿って垂直切開を行います。優しく皮下組織を分離するために2つの鉗子を使用し、そのORIから浅腹壁静脈を公開大腿静脈にジン。慎重に周囲の組織から浅腹壁静脈を分離します。
- 2つのマイクロクランプを使用して、浅腹壁静脈の血流を停止します。
- 慎重にピンセットで分離された静脈を持ち上げ、microscissorsで血管を切断することにより、静脈の約0.5〜1センチセグメントを収穫。血液の損失を防止するために、容器の切り株上のマイクロクランプを残します。滅菌ガーゼ上の静脈の除去された作品を配置します。注意深く採取静脈の一端の内側に30 G針を配置し、ヘパリンと容器（50単位/ ml）をフラッシュします。
注：注意して静脈を処理し、持ち上げる時の損傷を避けるため、切削、フラッシング。ヘパリンの適切な量の移植片をフラッシュすることを確認します。 - 血管のけいれんを防ぐために、レシピエントラットに移植するまで氷上で1％のリドカインに血管部分を保管してください。
- 5％イソフルランに麻酔を増加させることにより、ドナーラットを安楽死させます。 2-3分後、オペアンプ白線に沿って腹部途中、横隔膜を切断し、循環を停止するように心を取り除きます。
受信者のラットの調製
- ドナーラットと同様に、受信者のラットを麻酔し、固定します。
- ヘアトリマーと脚の内側を剃るし、ポビドンヨードおよび80％エタノールで3回消毒。
- 麻酔深度を監視し、それが後足をつまんときに反射がないことを確認することによって十分であることを確認してください。
- 鼠径倍に膝から正中大腿切開を行います。顕微鏡下で、その周囲から大腿動脈を分離するために2鉗子を使用しています。
- 血液の流れを止めるために、マイクロクランプを使用してください。遠位クランプ続いて第1の近位のクランプを配置します。
- microscissorsとクランプ大腿動脈の短いセグメントを切り取って、それを捨てます。あるギャップを作成し、microscissorsと残りの動脈断端を短くしてください静脈グラフトよりも大きい1〜2ミリメートル。 30 Gの針を用いてヘパリンを動脈切り株をフラッシュします。
注：外膜がわずかに血管断端を越えて突出している場合は、容器の端の上にわずかにそれを引っ張って曲を削除するために鉗子を使用しています。 - 動脈断端との間にステップ2.8から採取した静脈を置き、隙間に適切に収まるように長さを調整します。静脈の方向に注意してください。
- 第10-0プロレン縫合糸を使用して、近位吻合を実行します。 （ 図1D）に示すために、単一のステッチを実施します。腹側に3以上の縫合糸を追加する前に、各横側に縫合糸で起動します。その後、吻合を完了するために、容器の背側にある3つのステッチを配置します。
- ステップ3.8で説明した近位吻合についてと同じ技法を使用して移植片と遠位血管を接続します。ここでも、各横側に縫合糸で起動し、腹sidの上の3つの縫合糸を配置eと背側。
- フィブリン糊成分1及び2と負荷2 1 mLのシリンジは慎重にピンセットで移植片を持ち上げ、コンポーネント2に続いて、移植片の下にフィブリン糊成分1の約100μLをドロップします。
注：1の比率：コンポーネント1と2が1に適用されていることを確認します。 - バックの位置に移植片を配置し、移植片の上に部品1および2の追加の100μLをドロップします。接着剤は、移植片と吻合不全および静脈グラフトの過膨張を防ぐために吻合の両方をカバーすることを確認してください。
- 慎重に近位に続いた遠位クランプを開きます。
- 移植静脈グラフトの遠位の動脈に可視パルスをチェックして手術の成功を確認してください。
- 皮膚閉鎖を妨げる過剰な接着剤を、削除します。硬化した接着剤を持ち上げ、microscissorsと過剰分を除去するために鉗子を使用してください。 5-0プロレン縫合糸で皮膚層を閉じます。
- 4〜5メートルを注入グラム/キログラムカルプロフェン皮下ラットが目を覚ますを許可する前に。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。それは完全に回復するまで、単一のケージに動物を保管してください。
- 次の3日間、鎮痛薬としての飲料水（100ミリリットルあたり50mgのメタミゾール）にメタミゾールを追加し、毎日動物を監視します。
4.二重超音波検査
注：使用したラット14で非侵襲的に血液の流れを可視化するduxplex超音波検査。
- 導入室（イソフルラン2％）にラットをAnaesthetize。その背中にラットを置き、鼻をカバーするフェイスマスクで麻酔を維持します。
- 太ももの領域の周りの毛を除去するために、バリカン及び脱毛クリームを使用してください。
- 太ももに超音波ゲルを適用します。気泡がないことを確認します。 MS 400変換器を使用して、二重超音波検査画像を取得（中心周波数：30 M230〜400フレーム/秒のフレームレートでヘルツ）。
5.組織病理学
注：形態学的分析15のためのマッソンの三重染色で容器を収穫し、染色します。
- 一晩、4％パラホルムアルデヒドで収穫された容器を修正し、エタノールの濃度を増加させ、それを脱水。パラフィン中にサンプルを埋め込み、ミクロトームを用いて5μmの厚さにスライスにカット。
注：パラホルムアルデヒドは毒性があり、特別な注意を払って取り扱ってください。 - トリクローム染色液でそれらを染色する前に、スライドを脱パラフィン。 、染色したスライドを脱水キシレンでそれらをクリアし、メディアをマウントするには、それらをマウントします。スライドを乾燥させた後、顕微鏡でサンプルを表示します。
6.生物発光イメージング（BLI）
注：術後の移植片は、生物発光信号1を測定することにより、生体内で時間をかけて追跡しました6。
- PBS 22 ml中にD-ルシフェリンカリウム塩1gを溶解し、腹腔内ラット（375 mg / kg体重）にそれを注入します。ルシフェリンは、動物において循環するために15分を待ちます。
- リアルタイム生物発光定量システムにラットを置き、生物発光信号にアクセスします。
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Representative Results
ラット静脈介在モデルはmyointima過形成および静脈グラフト不全の発達を研究するのに適しています。動物は手術からよく回復し、優れた物理的条件ポスト動作を示しています。 図1は、キーの外科的手順を示しています。リネアの鼠径沿って皮膚切開後、心窩部表在静脈と大腿動脈（ 図1A）が同定されています。これは初期の移植不全と開存性の損失につながる可能性として移植片の収穫は、移植片（ 図1B）を損傷することなく、慎重に行うべきです。レシピエント動物（ 図1C）に移植片を位置決めした後、吻合ステッチは、図1（d）に示す順序で実行されています。完成した静脈介在移植片は、淡い（ 図1E）を表示され、赤になり、再灌流（ 図1F）後の脈動を示すべきです。
成功integrati移植後の大腿動脈とグラフト開存に静脈の上に二重超音波検査（ 図2A）を使用して非侵襲的に確認することができます。同系リュック陰性ラットにリュック陽性ラットの静脈に移植することにより、生物発光イメージングは時間（ 図2B）上にグラフト存在をモニターするために使用することができます。
Myointima過形成は、時間の経過とともに、移植片に漸進的に開発しています。マッソンの三重との組織学的染色は、内弾性板（ 図2C）の内部myointima形成を示しています。 （内弾性板内の面積で内腔の断面積を分割）管腔閉塞の計算は、このようにmyointima過形成の再現性のダイナミクスを確認し、28日目、手術後の7日目からグラフト開存の漸進的な損失を明らかにしましたこのラットモデルにおける（ 図2D）。
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図1：手術の手順の詳細なスキーム。 （A）鼠径部の解剖学。 （B）上腹部、表在静脈グラフトを収穫。レシピエント動物の動脈断端の間の静脈グラフトを配置する（C）。 （D）吻合ステッチの順序。静脈グラフト建設後（E）サイト。静脈介在移植片の再灌流後（F）サイト。黒の矢印は、上腹部表在静脈をマーク。スケールバー= 5ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：動物モデルの特徴。静脈介在グラフトIMMEDの（A）二重超音波検査 iately移植（0D）および28日後の動作（28D）の後。 （B）0日と手術後28日目にリュック陰性ラットに移植リュック陽性移植片からBLI。 （C）代表グラフト断面が日7、14、21、および28の後に収穫し、マッソンの三重で染色しました。 （上パネル：スケールバー= 400μmで、下のパネル：スケールバー= 100μm）と（D）の割合で管腔閉塞は、前者の内腔から新しい内部ルーメンを割ることによって計算されます。群間の差異は、ボンフェローニのポストホック検定で一元配置分散分析（ANOVA）によって評価しました。 P <0.01。エラーバーは、標準偏差（SD）です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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補足ファイル1：手術手順の概略図。リネアの鼠径沿って縦切開を下腹壁静脈を露出させ、ドナーラットに対して行われます。血流が2つのマイクロクランプで止め、0.5-1.0センチ静脈セグメントが回収されます。レシピエントラットにおいて、メディアン大腿切開を大腿静脈、動脈、および神経を露出行われます。大腿動脈をクランプした後、血管セグメントを除去し、回収した静脈グラフトで置き換え。 補足ファイル1を見るにはこちらをクリックしてください（またはダウンロードするには右クリック）。
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Discussion
このビデオでは、静脈グラフトの損失を調査するための基礎となる病理学的プロセスの探求、新しい薬や治療法の選択肢のテストを可能にするために、ラットの静脈介在モデルを示しています。
麻酔は外科的処置の重要な側面です。これは、特に長時間の操作中に、安全で簡単な方法であるような連続吸入麻酔システムは、推奨されます。この操作は1時間以上を要する場合には、トレーニング段階中に非常に重要であることができます。
外科手術に関しては、収穫し、移植17の間に静脈グラフトを損傷しないように重要です。血管の外膜を把持すると、静脈グラフトの損傷を防止し、その後の血栓形成および移植の失敗を回避することができます。移植片の開存性は、静脈グラフトまたはDISTAの血流の脈動の観察により直ちに静脈グラフト構成後に決定することができますリットル動脈だけでなく、二重超音波検査を経て。
手順のもう一つの重要な側面は、静脈グラフトの過膨張を防止するためです。動脈圧システムに静脈グラフトの突然の暴露が増加し、壁張力、過膨張後に、フローパターンの変化をもたらします。これらは、血栓症、吻合不全、および早期グラフト不全の源です。フィブリン糊付き静脈グラフトをサポートすることが制御されていない風船を防止し、機械的破壊から内膜とメディアを保護することができます。吸収性コラーゲンカバーは、フィブリン糊の代替であり、静脈周囲18を覆うように使用することができます。
このプロトコル内で最も重要なステップは、間違いなく静脈グラフトと動脈間吻合です。これは、移植片の初期故障につながる可能性がある、吻合部の狭小化につながるようにケアは、容器の二つの壁を貫通しないように注意する必要があります。また、特別attentionが縫合糸の局在に支払わなければなりません。動脈と静脈における縫合位置の一致は、グラフト開存を保証し、不足を防ぐことができます。これを容易にするために、縫合糸は、 図1（d）に示す順序で実行することができます。
初心者が最初に顕微機器や解剖学的構造の小さなサイズに慣れなければならないため、技術的な難易度は、技術の限界とみなすことができます。しかし、使用される他のモデルは、同じ困難を呈し、そして私たちは、このビデオは、短い時間内にこのテクニックをマスターする初心者外科医を助けると信じています。
静脈移植不全のための多数の小動物モデルが文献に記載されています。しかし、ほとんどのモデルは、解析のみ13のための組織の非常に少量を提供しています。この方法の利点を得ることができる組織の比較的大きい量です。一グラフトは複数の部分に分割することができNDそれによって必要な実験動物の数を減少させる、別のアッセイに使用しました。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術における最近の進歩は、ノックアウトラット19の生成を可能にしました。適切なノックアウトラットを選択することにより、移植片の開存性の喪失は、異なる疾病状態で研究することができます。例えば、レニンノックアウトラットは高血圧20を研究するために利用することができます。これらの遺伝的背景が異なる設定での静脈グラフト不全のメカニズムのかmyointima過形成の発達における特定の遺伝子の影響に関する情報を収集するために、この動物モデルと組み合わせることができます。
結論として、このビデオで説明したモデルは、再現可能な、安価、かつ実施が容易であり、迅速かつ確実に確立することができます。静脈グラフト不全の主な原因であるMyointima過形成は、進行性の管腔閉塞の結果、4週間にわたって急速に発展します。正常にテスト治療このモデルのオプションは、さらに大型動物モデルにおいて確認することができます。
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Acknowledgments
著者は、彼女の技術支援のためのクリスティPahrmannに感謝します。この研究は、ドイツ財団fuer Herzforschung（F / 28/14）で賄われていました。 DWは、心臓や肺移植のための国際社会からの旅行賞によってサポートされていました。 TDはエルス・クローネ - フレゼニウス・財団（2012_EKES.04）からエルスクローネ優秀給付金を受け取りました。 SSはドイツ学術協会（; DE2133 / 2-1、TDおよびSCHR992 / 3 1、SCHR992 / 4-1、SS DFG）からの研究助成金を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat LEW/Crl | Charles River | Stock number 004 | |
| Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk |
Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan | NBPR rat number 0299 | http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/ |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | AbbVie | PZN 10182054 Art.Nr.: B506 | Isoflurane |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| hair removal creme | Rufin cosmetic | 27618 | |
| Povidone-Iodine | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Heparin | Rotexmedica | PZN: 3862340 | 25.000 I.E./ ml |
| Xylocain 1% | AstraZeneca | PZN: 1137907 | Lidocain |
| EVICEL | J&J Med.Ethicon Biosur | PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE | fibrin glue |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system | VisualSonics | duplex sonography | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-med | 30GB | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth | L-8220 | |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Xenogen Ivis 200 | Perkin Elmer | bioluminescence imaging | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Resorcine-Fuchsine Weigert | Waldeck | 2.00E-30 | Trichrome staining |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 | |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
References
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