Protocol
EBLモールドからPDMS金型の1レプリケーション
- シリコン型29を製作
- スピンコートは、200μlのポリメチルメタクリレート（PMMA）、1分間2,500 rpmで1×1cmのシリコン（Si）基板上に溶液が薄膜を形成します。
- 2分間180℃でSi基板上にPMMA膜を焼きます。
- 300μC/ cm 2の面積の用量で集束電子ビームを用いて、PMMAフィルム上に設計されたナノパターンを書きます。
- 80秒間現像液中でのPMMAナノパターンを開発します。
- 10 kVで、0.5 mAで放出電流及び0.5オングストローム/秒の蒸着速度の出力電圧で電子ビーム蒸発器を使用して、厚さ50nmのニッケル層とPMMAのナノパターンを堆積させます。
- 80℃で20分間20ミリリットルリムーバーでPMMA部分を持ち上げ。
- 反応性イオンエッチング（RIE）Si基板にナノパターンを所望の深さのシリコンモールドを取得します。
注：のTetRのガス混合物afluoromethane（CF 4）、150 W、400 WとRIE電力の誘導結合プラズマ（ICP）電源投入時/酸素（O 2）（90％/ 10％）は、560ナノメートルの深さにSi基板をエッチングするために使用されます。
- SilanizeのSiモールド
- 100ミリメートルPSペトリ皿にカバーガラスとSiモールドを入れて、換気フード内に配置ガラスデシケーターでそれらを転送します。
- カバースリップ上に10μlの1H、1H、2H、2H-Perfluorooctyltrichlorosilaneをドロップします。
注意：1H、1H、2H、2H-Perfluorooctyltrichlorosilaneは皮膚腐食性および重篤な眼の損傷を引き起こす可能性があります。適切な個人保護具（PPE）を着用してください。 - 部分的にペトリ皿をカバーしています。
- シリコン金型のシラン化を完了するために、ドラフト内で5時間、真空下でデシケーターを保管してください。
- PDMSプレポリマーを準備
- 使い捨ての計量ボートに10gのPDMS樹脂1.05グラムの硬化剤を秤量します。
- プラスチック製のスプーンを使って徹底的にPDMSプレポリマーを混ぜます。
- 透明な混合物が観察されるまで約20分間真空下でプラスチック製デシケーター中でPDMSプレポリマーを脱気。
- PDMS金型を複製します
- 60ミリメートルペトリ皿にシラン化したSiモールドを置きます。
- ペトリ皿中のSiモールドにPDMSプレポリマーを注ぎます。
- すべての気泡が消えるまで約10分間プラスチック製デシケーターと脱ガスにペトリ皿を置きます。
- ホットプレートにペトリ皿を移し、4時間70℃でPDMSプレポリマーを硬化させます。
- 慎重にピンセットを用いて、シリコンモールドからPDMSモールドをはがし。
注：PDMS型は最大1週間、周囲条件で保存することができます。硬化後、PDMS金型30の一部の未架橋のPDMS樹脂分子と残留硬化剤があります。低分子量の分子が徐々に外に拡散し、時間の経過とともに表面に蓄積します。これは、PDMS表面31の地形学的および機械的特性に影響を与えます。 DIF融合は、1週間以内に重要ではありません。
大型、シングルモールドにPDMS金型の2ステッチ
- ステップ1.4を繰り返して、複数のPDMS金型を準備します。
注：PDMS混合物の同じ量、同じ厚さのPDMSモールドを得るたびに秤量します。 - 光学顕微鏡下で、このようなnanogratingsなどの異方性のPDMSナノパターンの向きを決定し、マーカーペンでPDMSモールドの裏面にマークします。
注：それはそのようなナノピラー等方性ナノトポグラフィの向きをマークする必要はありません。 - ドラフト内でエタノールとSi基板をきれいにし、圧縮空気で乾燥させました。
- ブレードで各PDMSモールドのパターン化されていない部分を切り落とします。
注：ステッチ金型の周囲に配置されますPDMS金型については、他の人と接触している唯一のパターン化されていない領域がトリミングされるべきです。 - 上のナノフェイスダウンでトリミングPDMSモールドを配置その後、ミラーSi基板の側との近くに他の金型を揃えるが、周囲の金型（複数可）には触れていません。
- PDMS接着剤層を調製します
- 厚さ0.5mmの層を形成するために清浄なガラススライドインチ（2.5cm×7.5センチ）の1gをPDMSプレポリマー（1.05：10 PDMS樹脂と硬化剤の比率）を脱気キャスト。
- 3-5分間ホットプレート上で100℃でPDMS層焼きます。層をタッチして、層が部分的にではなく、完全に硬化されることを保証するために針を使用してください。
注：部分的に硬化したPDMSは、未硬化PDMSプレポリマーのように流れることができないが、それは硬化PDMSと比較して粘着性です。
- 整列PDMSモールドの裏面にPDMS層を配置し、すぐにこのアセンブリを反転し、ホットプレートに移します。
- PDMS接着剤層とPDMSモールドの裏面との間の良好な接触を確実にし、1時間100℃でPDMS接着剤層を硬化させるために、アセンブリの上に金属ブロックを用いて、圧縮力（5キロパスカル）を適用します。<BR />注：慎重にアセンブリの傾きを避けるために、金属ブロックの位置を調整します。
- 金属ブロックを削除し、Si基板からのシングル、ステッチPDMSモールドを剥がします。
PS基板上のマスターモールドの3世代
注：スライドガラス上に固定化されたステッチPDMSモールドは、PS版や作業ナノ基材を製造することが可能なPS薄膜上にマスターモールドを生成するために使用することができます。
- PS版上のマスターモールドを生成します
- PS版を準備
- 二日間80℃の真空オーブン中でPSペレットを乾燥させます。
- 230℃でプレス機を予熱。
- 下から上へ順に、アルミニウム板、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）シートとアルミニウムスペーサーを組み立てます。
- 3センチメートル（L）×3センチメートル（W）×0.3センチメートル（H）の正方形の開口部を有するアルミニウムスペーサーで負荷3.5グラムのPSペレット。
注：スペーサーがほぼ0です。1 PDMSモールドよりも厚くcmであり、従って、最終的なナノPSは、基板は、約0.1センチメートルの厚さです。 - アルミスペーサー上の別のPTFEシートとし、別のアルミニウム板を置きます。
- プレス機械にアセンブリを配置します。
- 30分間230℃でPSペレットを予熱。
- 5分間のアセンブリ上の圧縮圧力（0.1MPaに）適用します。
- 圧力を解放した後、アセンブリ上に圧力0.5MPaの圧縮圧力を再適用します。
- 1.5 MPaでの望ましい圧力まで圧力0.5MPaの増加に伴って繰り返しステップ3.1.1.9に到達します。
- プレス機のヒーターの電源をオフにして、1.5 MPaでの一定の圧力で70℃以下に冷却します。
- アセンブリを取り出し、PS版を再入力から水分を防ぐために、80℃の真空オーブン中でPS版を保存します。
- PS版へのナノインプリントステッチPDMSモールド
- アルミスペーサーでPS版を置き3インチのSiウェハ上に設定。
注：スペーサの内側の寸法は、PS版と同じであるので、PS版は、右スペーサに収まります。 - 30分間250℃でホットプレート上でPS版を加熱します。
- 溶融したPS版上のナノパターンのフェースダウンで縫製PDMSモールドを置きます。
注：PDMSモールドの片側は最初のPS版の表面と接触して置かれ、他方は、界面での気泡の形成を回避するために、PSの表面に接触して徐々に低下します。
注意：ホットプレートの表面が高温になっています。ナノインプリントプロセス中thermoglovesを着用してください。 - ステッチPDMSモールドのスライドガラス上にアルミ板を置きます。
- アルミ板上に金属ブロックを使用して圧縮圧力（12.5キロパスカル）を適用し、3分間待ちます。
注：アルミニウム板が傾いていないことを確認してください。 - 持ち上げて、アルミ板から金属ブロックを交換し、私25キロパスカルに圧縮圧力をncrease。
- 圧力とを繰り返し、ステップ3.1.2.6は50キロパスカルまで上昇しました。
注：この手順は、PDMSモールドとPSプレートとの間に閉じ込められた空気を除去することです。 - 15分間、50 kPaでの一貫した圧力下240と250℃の間のホットプレートの温度を維持します。
- ホットプレートの電源をオフにして、全体のセットアップをクールダウン。
注：ファンは、冷却プロセスを促進するために使用することができます。 - PS版からステッチPDMSモールドを剥がし慎重に温度が50℃以下になった後の金属ブロックを削除し、。
注：PS基板が逆ナノパターンを有し、作業PDMS基板を製造するためにマスターモールドとして使用することができます。
- アルミスペーサーでPS版を置き3インチのSiウェハ上に設定。
- PS版を準備
- PS薄膜上にマスターモールドを生成します
- PS薄膜を作製
- ドラフト内で10ミリリットルのトルエン中の1グラムPSを溶解させます。
注意：トルエンは皮膚を引き起こす可能性がありますirritationおよび重篤な眼の損傷、および長期または反復暴露による臓器の障害を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。 - 1分間2500 rpmでのウエハ2で上にスピンコート1ミリリットルのPS溶液を、〜1μmの厚さのPS薄膜を形成しました。
- 3日間、ドラフトのSiウェハ上のPSフィルムを設定することにより、膜からトルエンを蒸発させます。
- 一晩80℃の真空オーブン中でPS薄膜をアニールします。
- ドラフト内で10ミリリットルのトルエン中の1グラムPSを溶解させます。
- ナノインプリントPS薄膜上にPDMSモールド
- ホットプレート上で設定されているPS薄膜、上のナノトポグラフィフェースダウンで縫製PDMSモールドを置きます。
- PDMSモールドのガラス側の金属ブロックを使用して、PDMSモールドに12キロパスカルの圧縮圧力を適用します。
- 180℃にホットプレートの温度を上昇させ、15分間それを維持します。
注意：溶融PSフィルムは、潤滑剤として機能することができます。滑り落ちるから金属ブロックを防ぐために注意を払います。 - ホットプレートの電源を切り全体のセットアップをクールダウン。
注：ファンは、冷却プロセスを促進するために使用することができます。 - 温度が50℃以下に低下した後、金属ブロックを外し、慎重にPSフィルムからステッチPDMSモールドを剥がします。
注：ナノPSフィルムは、作業PDMS基板を製造するためのマスター型として機能します。
- PS薄膜を作製
細胞の挙動の4 Nanotopographical変調
注：ヒト上皮細胞は、細胞拡散のnanotopographical変調を実証するために、代表nanotopographies上で培養されます。
- 用途に応じて、ステップ3.1または3.2のいずれかから生成されたマスターモールドからPDMS作業基板をキャストします。
- 中空鋼アーチパンチを使用して、特定のマルチウェルプレート（ 例えば 、24ウェルプレート）の構成に合わせてディスクにナノPDMS基板をカット。
- OウェルにPDMSディスクを配置するためにピンセットを使用して、FAマルチウェルプレート。
- 、30分間毎に70％エタノール、次いで、UV露光を使用してPDMS基板を滅菌します。
- 1X滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で3回PDMS基板を洗浄します。
- コート室温で30分間、細胞外マトリックスタンパク質（ すなわち 、20 / mlのフィブロネクチン）を有するPDMS基板。
- 5分間PDMS基板を滅菌PBSで3回、それぞれを洗い流します。
- 10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、ヒト肺癌細胞A549を中断し、血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 一日、5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃でPDMS基板と培養それらを2,000細胞/ cm 2の播種密度で細胞をプレート。
- PBSで細胞を3回洗浄します。
- 4時間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドの混合物中の細胞を固定し、CO 2の重要なPOを用いて細胞を脱水電子顕微鏡観察29を走査するための int型乾燥機。
注意：パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、重篤な皮膚の薬傷・眼の損傷を引き起こす可能性があります。化学フード内で動作し、適切なPPEを着用してください。
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Representative Results
ステッチ技術は、高い忠実度でナノ基板の大面積を生成することができます。 図1aは、それぞれ、Si基板上のPS版とPS薄膜に縫い付けPDMS型から転送ナノ大きな領域を表示1B。元EBL-書かれた金型（ 図1c）と、最終的なPDMS作業基板（ 図1D）との比較は、EBL-書かれたナノパターンを忠実に作業基板に転写することができることを確認します。様々な幾何学的形状および寸法のナノトポグラフィーは、細胞の挙動を調節するために使用することができます。モデル細胞としてadenocarcinomic基底上皮細胞株は、A549で、図2に示されているように、異方性nanogratingsは、A549細胞は、等方性ナノピラーに表示多形態と比較nanograting方向に沿って細胞を長くすることができます。
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ステッチ技術を使用してナノ基板の大面積の 1 世代図 。 （b）は、ナノパターンの光学像は、それぞれ、PS版とPS薄膜に移しました。矢印は、ステッチPDMS金型の隙間におけるポリマー昇給を示しています。 （C、D）EBL型、それぞれ基板を加工最後のPDMS上のナノパターンのSEM像。スケールバーは1μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2 NanotopographicalはA549細胞の細胞拡散変調しました。 >（a）は、線幅500nmのnanogratings、間隔が500ナノメートル、高さ560ナノメートル、直径500nmの（b）のナノピラー、450nmのエッジ間の間隔で、高さ560 nmの上に成長させたA549細胞、それぞれ。スケールバーは10μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々は、ナノパターン基板の大面積を生成するために、簡単な手頃な価格の、まだ汎用性の高い方法を提示します。忠実に非常に定義されたナノパターンを展開するには、細心の注意は、いくつかの重要なステップに支払われるべきです。第1は、複数のPDMS金型をトリミングすることです。 PDMSモールドのパターン化されていない領域を除去する必要があります。また、金型の側壁には、金型の間のギャップを最小にするために垂直方向にできるだけ完璧なカットする必要があります。集合的に、最後のステッチ型でパターン化されていない領域の一部を低減することができます。第二に、このPDMSモールドのナノパターン化表面は、シリコン基板上に歪みなしで位置合わせする必要があります。 PDMSナノ構造体が変形しやすいので、（PDMSモールドとシリコン表面との間に空気を捕捉避ける）穏やかに均等にシリコン基板のミラー面に対するナノ面を配置することが重要です。 PDMSモールドは、しかしネイに触れないようにできるだけ近くに整列されますさらに、最終的なステッチモールドのパターン化されていない部分を最小限にするために金型をghboring。それ以外の場合は、タッチしたナノ構造は、ナノインプリント中に変形します。第三に、PDMSモールドの厚さは、バッチからバッチに変化してもよいし、したがって、PDMSキャスティング前に完全に小さなシリコンモールドを平準化することにより、各金型に均一の厚さを作るに加えて、厚さを均一にすることが重要です。 PDMS鋳型を横切る厚さのばらつきは、スライドガラス上にキャスト層PDMSプレポリマー（接着剤）の厚さを調整することによって補償することができるが、厚さのプレポリマー層が問題となり得ます。プレポリマーは、毛管力によってパターニングされた表面へのPDMS金型との間の隙間を通って引っ張られ、その結果、ナノに損傷を与えることができます。厚さの変動はEBL鋳型から鋳造時PDMS混合物の同じ量を調製することにより最小限に抑えることができます。その結果、薄いPDMSプレポリマー層が使用され得ます。また、部分的にprepolymeを硬化させますR層は、その粘度を増加させ、したがってその上昇を低減し、最終的にナノ表面の損傷の可能性を排除します。
ステッチ技術は、PDMSのエラストマーの性質によって制限されます。ソフトリソグラフィは、原理的には、0.5nm未満18の分解能に達することができるように小さく、32 nmの2通りの特徴サイズを複製するために適用されているが、幅に対する高さのアスペクト比が過度である場合、ナノスケールPDMS機能が完璧に複製することができません高い（> 2）または低すぎる（<0.2）。ナノ構造は、アスペクト比が高すぎると崩壊、または<0.2比のPDMSスタンプ33を用いた場合に不十分な救済をもたらすことができます。また、複数のPDMSモールドが原因隙間とPDMS金型の不完全なトリミングをシームレスにステッチすることができず、したがって、（例えばnanogratingsような連続ナノパターンに特に）パターン化されていないとずれて領域があります。亡命の小さな割合を考えます面積は、全表面積の上、ステッチの技術はまだナノ基板の大面積を生産するためのシンプルで手頃な方法を提供します。また、ステッチモールドをポリマー基材にナノインプリントされたとき、溶融ポリマーは、不均一な表面（ 図1a）、その結果、隙間に流れ込む可能性があります。凹凸面は、それが困難な細胞性または分子の生物学的分析のためのサンプルを収集することができます。マイクロチャネルは、パターニングされた基板に対して密閉されている場合、マイクロ流体の用途では、昇給も不完全なシーリングを引き起こします。凹凸の問題は容易に膜厚を調整を通じて上昇を最小限に抑えるために、ポリマー薄膜技術を適用することによって解決することができる（ 図1B）。
ステッチ技術は拡張のために定義されたマスターモールドを必要とするが、そのようなステップ・アンド・フラッシュ・リソグラフィ及びロールツーロールナノインプリントlithograのような他の技術と比較して、シンプルで手頃な価格ですPHY。ステッチ技術は、ホットプレートやステッチやナノインプリント工程中に圧縮力を発揮する方法ではなく、高価な機器のみを必要とします。また、ステッチ処理は必ずしも必要ではないが、クリーンルームで、クリーンな環境で行うことができます。
ステッチ技術は、多目的です。大面積と同じナノパターンを拡大することに加えて、ステッチの技術は、様々な形状、寸法及び配置のミクロ及び/又はナノスケールの特徴からなる金型に適用することができます。この点に、マイクロ/ nanotopographiesのコンビナトリアルライブラリーは、細胞地形の相互作用を研究するためのハイスループットプラットフォームを提供するために構築することができます。この、シンプルな、手頃な価格で汎用性の高いステッチ技術は、潜在的にハイブリッドコンポーネントとマイクロ/ナノスケールのデバイスを作成するために拡張することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEOL field emission SEM | JEOL | JSM-7600F | EBL |
| E-beam evaporator | Kurt J. Lesker | Model: LAB 18 e-beam evaporator | nickel deposition |
| Trion Minilock III ICP/RIE | Trion technology | Model: Minilock-phantom III | |
| Press machine | PHI Hydraulic Press | Molde: SQ-230H | |
| Spin coater | Laurell Technologies | Modle: WS-400A-6NPP-LITE | |
| CO2 critical dryer | Tousimis | Modle: Autosamdri-815 | |
| Silicon wafer | University Wafer | 1080 | |
| Aluminum plates | McMaster-carr | 9057K123 | |
| Teflon sheets | McMaster-carr | 8711K92 | |
| 100 mm Petri dish | FALCON | 353003 | |
| 60 mm Petri dish | FALCON | 353004 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-34 | |
| Disposable weighing boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| Glass desiccator | Fisher Scientific | 02-913-360 | |
| Plastic desiccator | Bel-Art Products | F42025-000 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110049SH | |
| Tweezer | Ted Pella, inc. | 5726 | |
| Blade | Fisher Scientific | S17302 | |
| Metal blocks | McMaster-carr | ||
| Punch | Brettuns Village Leather Craft Supplies | Arch punch | |
| Poly(methyl methacrylate) | MicroChem | 495 PMMA A4 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | |
| Polystyrene | Dow Chemical | Styron 685D | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane | Oakwood Chemical | 7142 | |
| Developer | MicroChem | MIBK/IPA at 1: 3 ratio | |
| Remover | MicroChem | Remover PG | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Toluene | Fisher Scientific | T324-500 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microsopy Science | 15712-S | |
| Glutaraldehyde | Fisher Chemical | G151-1 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL-185 |
References
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