Summary
Endoteliala cellens mitokondrier är kritiska för att upprätthålla blod-hjärn-barriären integritet. Vi introducerar ett protokoll för att mäta bioenergetiska funktion i cerebrala vaskulära endotelceller.
Abstract
Integriteten hos blod-hjärn-barriären (BBB) är kritisk för att förhindra hjärnskada. Cerebral vaskulär endotelial (CVE) celler är en av de celltyper som utgör BBB; Dessa celler har en efterfrågan mycket hög energi, vilket kräver optimal mitokondriefunktion. I fallet med sjukdom eller skada, kan den mitokondriella funktionen i dessa celler ändras, vilket resulterar i sjukdom eller öppnandet av BBB. I detta manuskript, presenterar vi en metod för att mäta mitokondriefunktion i CVE-celler genom att använda hela, intakta celler och en Bioanalyzer. En mito-stress analys används för att utmana de celler som har perturbed, antingen fysiskt eller kemiskt, och utvärdera deras bioenergetisk funktion. Dessutom ger denna metod också ett bra sätt att screena nya läkemedel som har direkta effekter på mitokondriefunktion. Vi har optimerat celldensiteten som krävs för att i utbyte ge syreförbrukningshastigheter som möjliggör beräkning av en variation av mitokondriell parameter, inklusive ATP-produktion, maximal andning och ledig kapacitet. Vi visar också känsligheten hos analysen genom att visa att införandet av mikroRNA, miR-34a, leder till en uttalad och detekterbar minskning i mitokondriell aktivitet. Medan de data som visas i detta dokument är optimerad för bEnd.3 cellinje, har vi också optimerat protokoll för primära CVE celler, ytterligare antyder användbarheten i prekliniska och kliniska modeller.
Introduction
Det är allmänt känt att blod-hjärn-barriären (BBB) bildas av cerebral vaskulär endotel (CVE) celler har mycket distinkta och unika funktioner avgörande för vaskulär biologi. Dessa endotelceller använda mitokondrier för att generera det mesta av det cellulära leverans av adenosintrifosfat (ATP) som en källa till kemisk energi. Förutom att tillhandahålla ATP för CVE celler, mitokondrier reglerar olika cellulära processer i vaskulära endotelceller, såsom cellulära signalerings 1-4, apoptos 5, och kontroll av cellcykeln och celltillväxt 6. Dysreglering av mitokondriell bioenergetisk funktion i CVE celler kan påverka mitokondriell biogenes, vilket leder till försämrad kärlendotel aktivitet, och förvärra cerebrovaskulära sjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar, t.ex. stroke 7,8 och Alzheimers sjukdom (AD) 9. Vi har visat att förolämpningar till CVE celler efter exponering för lipopolysaccharide (LPS) försämrar mitokondriefunktion i CVE-celler och förvärra stroke utfall 7. Tert-butylhydrokinon (tBHQ) ökar stroke dödligheten genom att störa oxidativ fosforylering i CVE-celler 10. Därför kvantitativ modell av bioenergetisk funktion i CVE-celler inte bara piloter en serie mekanism relaterade studier för centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar, men ger också ett genombrott i läkemedelsscreening av läkemedel inriktade på mitokondriefunktion i vaskulär biologi.
Isolerade mitokondrier har använts för att mäta bioenergetisk funktion. Vi 7 och andra 11 har rapporterat bedömningar av cellulära bioenergetik i intakta CVE-celler genom att använda ett extracellulärt flöde Bioanalyzer. Analysatorn ger fördelen av endogen cellulär bioenergetisk bedömning. Denna känsliga och konsekvent analys mäter mitokondriell metabolism av CVE celler och kan användas för att utvärdera bioenergetiska försämring av stimuli, undersöka mekanismerna för mitokondriell signaleringsvägar, och skärm läkemedel eller behandlingar som påverkar mitokondriefunktion i CVE-celler. Syreförbrukningen Rate (OCR) registreras av Bioanalyzer hjälp av en farmakologisk profilering strategi genom att kombinera användning av fyra mitokondriella störande: oligomycin, karbonyl cyanid-4 (trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP), rotenon och antimycin A. I detta protokoll, vi detalj en optimerad metod som gör det möjligt för mätning och beräkning av mitokondrie funktionella parametrar i CVE-celler, inklusive basala mitokondrie andning, ATP produktion, proton läcka, maximal andning och reservlungkapacitet, i en enda analys.
Protocol
OBS: Systemet av protokollet visas i figur 1, inklusive en tidslinje av förfarandena.
1. Kultur och Passage av CVE celler
- Kultur CVE celler (bEnd.3 celler) i komplett tillväxtmedium (hög glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium, DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin i en T75 cm 2 vävnadsodlingskolv. Växa vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Ta bort och kasta cellodlingsmediet. Skölj cellskiktet med 0,25% trypsin-0,03% EDTA-lösning, och sedan lägga till 1 - 2 ml Trypsin-EDTA-lösning till kolven och hålla kolven vid 37 ° C under 3-5 min. Observera cellerna under ett inverterat mikroskop tills cellskiktet är fristående. Tillsätt 10 ml komplett tillväxtmedium och aspirera cellerna genom att försiktigt pipettera.
- Dekantera vätskan och cellerna i en 15-ml centrifugrör och centrifugera vid 700 xg under 5 minuter för att avlägsna cellrester. Kassera supernatanten från centrifugröret. Tillsätt 10 ml komplett tillväxtmedium och återsuspendera cellpelleten. Snurra cellerna vid 700 xg under 5 min.
- Kassera supernatanten från centrifugröret. Återsuspendera cellpelleten i fullständigt tillväxtmedium vid en koncentration av 2,0 x 10 5 celler / ml (bestämt genom räkning med användning av en hemocytometer; utesluta döda celler genom Trypan-blå-färgning).
OBS: Freshly-upptinade cellerna subodlas under minst 3 passager för experiment.
2. utsäde och behandla Celler på cellodlingsplattor
- Utsädes celler på en 96-brunnars extracellulär flux cellodlingsplatta: 80 | il / brunn. Placera cellodlingsplatta vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Obs: 16 x 10 3 celler per brunn kommer att nå 60-80% konfluens inom 24 timmar.
- Om cellerna exponeras för en kemikalie, tillsätt de behandlingar en gång cellerna är fästa till plattan botten (8 - 24 h efter seding).
OBS: För transfektionsexperiment, inte lägga till antibiotika i fullständigt odlingsmedium.
3. Bedömning av mitokondrie-funktionen Använda Bioanalyzer
- Före starten av analysen, hydratisera en extracellulär flödessensorhuvudet med kalibrerings genom att tillsätta 150 mikroliter av extracellulär flux kalibreringslösning till plattan och inkubering O / N vid 37 ° C utan CO2.
- Med hjälp av plattvättare stationen, ändra cellodlingsmedium in pH 7,0 extracellulär flux analysmediet. Inkubera cellerna vid 37 ° C utan CO2 under 30-60 min.
- Bered arbetslösningar av 8 iM oligomycinkänslig, 4,5 iM FCCP, 10 iM rotenon, och 10 ^ M antimycin A i DMEM. Belastning 25 mikroliter av stamlösningarna till patroninjektionsportar: Port A, oligomycin; Port B, FCCP; Port C, rotenon och antimycin A med extracellulärt flödesanalysmedium. Genomföra analysprotokollet som beskrivs i tabell 1.
- Ladda hydratiserade patronen i Bioanalyzer och utföra kalibreringen genom att klicka på "Start" -knappen. När kalibreringen är klar, ta bort patronen bottenplatta och ladda cellplattan genom att klicka på "Ladda ur kassett" prompt. Fortsätt analysen fram till slutet av alla mätningar.
- Öppna datafilen och få frekvensvärden från Bioanalyzer. Exportera data till ett kalkylark.
4. Dataanalys
OBS: Beräkningarna för dataanalyser formuleras nedan. Värdena erhålls från Bioanalyzer instrumentet som OCR presenteras i Figur 2.
- För att beräkna Basal andning, subtrahera den icke-mitokondriella andning (mätningar 10 - 12) från basvärdet (mätning 3).
OBS: Basal andning = Basal - icke-mitokondriell andning = Rate ③ - Pris ⑩ ~ ⑫. - För att beräkna ATP productipå, subtrahera ATP-kopplade andning (mätningar 4 - 6) från basvärdet (mätning 3).
OBS: ATP-produktion = Basal - ATP-kopplade andning = Rate ③ - Pris ④ ~ ⑥. - För att beräkna maximal andning, subtrahera den icke-mitokondriella andning (mätningar 10 - 12) från den maximala andning (mätningar 7 - 9).
OBS: Maximal andning = Maximal andning - icke-mitokondriell andning = Pris ⑦ ~ ⑨ - Pris ⑩ ~ ⑫. - För att beräkna Ledig kapacitet, subtrahera basvärdet (mätning 3) från Högsta andning (mätningar 7 - 9).
OBS: Ledig kapacitet = Maximal andning - Basal = Pris ⑦ ~ ⑨ - Rate ③. - För att beräkna Proton läcka, subtrahera den icke-mitokondriella andning (mätning 10-12) från ATP-kopplade andning (mätning 4).
OBS: Proton läcka = ATP bunden andning - icke-mitokondrierl andning = Rate ④ - Pris ⑩ ~ ⑫.
Representative Results
För att bedöma bioenergetiska funktion CVE celler som svar på oxidativ stress, valde vi den murina hjärnan mikrovaskulära endotel cellinje bEnd.3, som visar samma jämförande barriäregenskaper som primär hjärn mikrovaskulära endotelceller 12. Med tanke på att kinetik och relativ intensitet svar varieras mellan de olika celltyper, var den första serien av experiment som syftar till att få mätbara OCR nivåer genom att identifiera det optimala antalet bEnd.3 celler att använda i analysen för metabolisk profilering, som visas i Figur 2. Efter utvärderingen är data kvantifieras och presenteras i Figur 3. Basal andning, maximal andning och reservlungkapacitet visade en proportionell reaktion med celltätheten. Men ATP-produktion minskade när 64 x 10 3 celler per brunn valdes, vilket tyder på att över konfluenta cellkultur ärinte lämpar sig för detta experiment. De optimala celldensiteter uppstår mellan 8-32 x 10 3 celler per brunn, baserat på svar på mitokondriella störande.
För efterföljande experiment, var en såddtäthet av 16 x 10 3 celler per brunn som används för att göra det möjligt för optimal detektering av förändringar i OCR. Använda 16 × 10 3 celler per brunn, observerade vi förväntade svar i OCR och visade att mikroRNA MIR-34a minskar mitokondriefunktion i CVE-celler (Figur 4). Vi har tidigare rapporterat att MIR-34a reducerad oxidativ fosforylering i dessa celler 13. De upprepade experiment visade också att maximal andning och ledig kapacitet signifikant minskat med överuttryck av MIR-34a i CVE vid 24 timmar efter transfektion, trots att basrespiration, ATP-produktion, och proton läcka hade inga signifikanta förändringar (Figur 4) . dessa datademonstrera känsligheten hos Bioanalyzer att upptäcka förändringar i mitokondriell funktion i CVE.
Figur 1. strategisk planering för experimentet. Tidsspannet för cellen, plåt, och förberedelse patron anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant Rådata av bioenergetisk funktion i CVE-celler med olika celldensiteter. Syreförbrukning mättes i CVE-celler med olika celldensiteter. Data representerar medelvärde ± SD (n = 5); OCR: syreförbrukningshastigheten; FCCP: karbonyl cyanid-4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Rot / Anti-A: rotenon och antimycin A. ①, ② och ③ indikerar basrespiration; ④, ⑤ och ⑥ visar ATP kopplade andning; ⑦, ⑧ och ⑨ anger maximal andning; ⑩, ⑪ och ⑫ tyda på bristande mitokondriell andning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat av bioenergetisk Funktion i CVE-celler med olika celldensiteter. Basrespiration, ATP-produktion, maximal andning och reservkapaciteten beräknas från rådata som genereras av bioenergetik funktionsanalys i figur 2 med hjälp av formlerna som anges i avsnitt 4 . Data representerar medelvärde ± SD (n = 5); OCR: syreförbrukningen. f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat av minskad bioenergetiska Funktion av MIR-34a (A) Rådata för mitokondriell funktion efter överuttryck av MIR-34a vid 24 timmar efter transfektion.. (B) Basal andning, ATP-produktion, maximal andning och ledig kapacitet beräknas från rådata som genereras av bioenergetik funktionella analys i figur 4A; parametrarna beräknas med formlerna som anges i avsnitt 4. Uttryck av MIR-34a minskar mitokondriefunktion i CVE-celler vid 24 timmar efter transfektion. Data representerar medelvärde ± SD (n = 5); OCR: syreförbrukningen. ****, P <0,0001.filer / ftp_upload / 54.847 / 54847fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Instrument Run Protokollet.
Discussion
Detta protokoll utgör en metod för utvärdering av bioenergetiska fenotyp i cerebrala vaskulära endotelceller. Den fungerar som en grundläggande analys för endotelceller mitokondriell utvärdering, och det är optimalt för experiment utformade för att studera mekanismerna av stimuli som kan påverka den mitokondriella signalväg i CVE-celler. Det ger också en metod för att testa potentiella läkemedel för BBB-avbrott-relaterade sjukdomar.
Kritiska steg i protokollet
Extracellulära flödes bioanalyzers har förmågan att mäta OCR i realtid. I denna analys, som identifierar den lämpliga celldensiteten är kritisk. Om celltätheten är lägre än 8 x 10 3 celler per brunn, är den basala OCR för låg för att analyseras (Figur 2 och Figur 3); Om celltätheten är högre än 32 x 10 3 celler per brunn, inte cellerna inte svarar på Oligomycin eller FCCP treatments (figur 2 och figur 3). Den optimala celldensiteten för denna cellinje i vår experimentella modell är 16 x 10 3 celler per brunn, vilket visar reproducerbara resultat och känslighet för stimuli 7 och behandlingar 10,14. Om en 24-brunnars Bioanalyzer används skulle nya titreringar av celltätheten krävas för analysen.
Det är dokumenterat att CVE har en stor volym av mitokondrier jämfört med andra endotelceller eller vävnadstyper 15,16, vilket tyder på behovet av ökad produktion och färre celler för att mäta bioenergetics ämnesomsättning energi. Vi har testat flera olika typer av hjärn endotelceller, såsom primära och immortaliserade murina cerebrovaskulära endotelceller 7 och förevigat mänskliga cerebrovaskulära endotelceller (opublicerade data). Dessa celler krävs liknande celldensiteter att nå acceptabel OCR (basrespiration OCR inom 40-160 pmol / min för96-brunnsplattor och 50-400 pmol / min för 24-brunnsplattor) när bioenergetik analysen utfördes. Kaczara et al. Rapporterade uppmätta bioenergetisk metabolism i humana navelvenendotelceller (HUVEC), som använde en högre celltäthet 17.
Vår grupp inte utvärdera kärlceller från andra vävnader eller organ. Teoretiskt skulle Bioanalyzer potentiellt användas på vilken celltyp som helst, men det kräver att optimera analysen för celltätheten, cellkulturmedium, och odlingsbetingelser (vissa specifika celler kan kräva belagda plattor att växa bra). Det krävs att de experiment är slutförda för att säkerställa att OCR frekvensen ligger inom det acceptabla intervallet. Om OCR i endotelceller från andra organ är lägre än CVE från hjärnor, vilket ökar celltätheten kan hjälpa till att få inom ett acceptabelt OCR intervall. Alternativt, om cellerna inte använder oxidativ fosforylering som sin huvudsakliga energikälla, den Bioanalyzer skulle inte vara ett optimuml-analysen.
Den Bioanalyzer möjliggör den sekventiella störningar av elektrontransportkedjan, baserad på den ordning i vilken reagensen anbringas. Först oligomycinkänslig tillämpas, vilket hämmar mitokondrie Complex V (ATP-syntas). För det andra, FCCP, en elektronkopplare, tillämpas, vilket leder till störningar av proton lutning. Slutligen, rotenon och antimycin A, som hämmar mitokondriekomplex I och III, respektive, appliceras leda till en total hämning av elektronflöde. Ordningen på läkemedelsexponering är viktigt eftersom de läkemedel blockerar den specifika elektrontransportkedjan reaktion och de sekventiella förändringarna kan mätas för att återspegla den mitokondriefunktion.
Ändringar och felsökning
För att utvärdera mitokondriella respons på stimuli i CVE celler, är det rekommenderat att de stimuli appliceras på cellerna efter det att cellerna vidhäftar till cellodlings plattans botten (se tidslinjenvisas i figur 1; det vanligtvis tar minst 6 timmar). För att erhålla reproducerbara resultat genom behandlingar, är det ytterst viktigt att hålla celltätheten konsekvent. Om förbehandlingar är utformade före cellsådd, bör celltätheten för varje förbehandling noggrant mätas, exklusive döda celler för sådd. Om transfektion ingår i experimentell design, hänvisas till tillverkarens transfektion protokoll. Demonstreras i data som presenteras i Figur 4, MIR-34a transfekterades i CVE cellerna med hjälp av en lipofektamin transfektion kit, som kräver antibiotikafritt cellodlingsmedium och en mito-stresstest för att bedöma förändringar i metabolisk funktion med överuttryck av MIR-34a . Doserna av plasmiden kan också optimeras, som tidigare publicerats 13. En annan förändring som kan göras med det protokoll som förändras koncentrationerna av reagensen. En titreringskurva av oligomycin, FCCP, och / eller rotenon och antimycin A kan vara kompletted.
Dessutom, om denna analys används för hög genomströmning analyser av olika läkemedel, föreslås det att inkludera en parallell analys för att mäta cellviabilitet och cellproliferation, som beskrevs i våra tidigare publikationer 7,13. OCR-värdena påverkas avsevärt av antalet celler (figurerna 2 och 3), och cellproliferationen och viabilitetsanalyser gynnar en normalisering av data. Men slutförandet av dessa analyser är gottfinnande av varje enskilt laboratorium.
Begränsningar av tekniken
Den huvudsakliga begränsningen med detta protokoll är att vi endast används en in vitro cellkulturmodell i studien. För närvarande finns det inga lediga ex vivo-modeller eller djurmodeller som kan ta itu med endotelcell mitokondriefunktion. Nya modeller förväntas tas fram för utvärdering av bioenergetisk funktion in vivo och En annan begränsning är en förlängning av barriär bedömningar efter de bioenergetik åtgärder. Experimenten kan inte utföras eftersom, för det första, efter slutförandet av de bioenergetiska mätningar, cellviabiliteten minskas efter fullständig upplösning av elektrontransportkedjan; andra är specifika cellodlingsplattor och skär krävs för att detektera bioenergetik värderingar och inte passar skär för bedömningar barriär. Därför finns det inte många funktionella analyser som kan genomföras efter bioenergetik analysen. Emellertid förväntas det att särskilda anordningar kan utvecklas för att utföra funktionella analyser före den bioenergetik analysen. Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder Tidigare tekniker för att utvärdera mitokondriell funktion necessitated isolering av mitokondrier från cellerna 18. detta new teknik använder Bioanalyzer möjliggör mätning av mitokondriell aktivitet i intakta celler, som bevarar mer av den cellulära miljön än att utvärdera isolerade mitokondrier. Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik Detta protokoll är designad och utvecklad för bEnd.3 cellinje, men det är också kompatibel med primär cerebral vaskulär endotel (pCVE) celler 7 eller annan endotel, och vi har visat detta i vår tidigare publikation använder pCVE celler 7. När andra typer av endotel används, kan beläggningen av odlingsplattan och användning av tillväxtfaktorer krävas. Emellertid titreringen assay rekommenderas för andra celltyper också. Detta protokoll ger en generell metod som antas i utvärderingen av bioenergetik av CVE-celler, och det kan appliceras vidare till mekanism studier eller terapeutiska svar på detta sätt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25 - 30 passages |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% final concentration |
| Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
| 0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM final concentration |
| Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM final concentration |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM final concentration |
| Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM final concentration |
| Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM final concentration |
| Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM final concentration |
| Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
| Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
| Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |
References
- Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).
- Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles. Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription. Sci Signal. 5, ra47 (2012).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).
- Sutendra, G., et al. The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).
- Doll, D. N., et al. Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier. Stroke. 46, 1681-1689 (2015).
- Ren, X., Simpkins, J. W. Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism. J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).
- Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).
- Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke. Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).
- Modis, K., et al. Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress. Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).
- Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells. Brain Res. 1130, 17-30 (2007).
- Bukeirat, M., et al. MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c. J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).
- Hu, H., et al. Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity. Aging Dis. 7, 14-27 (2016).
- Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).
- Oldendorf, W. H., Brown, W. J. Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle. Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).
- Kaczara, P., et al. Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels. Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. J Vis Exp. (96), e52350 (2015).
