Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Her beskriver vi en nyutviklet hepatitt B-virus (HBV) reporter system for å overvåke de tidlige stadier av HBV-livssyklusen. Denne forenklede in vitro-system skal hjelpe til screening av anti-HBV-midler ved hjelp av en high-throughput-strategi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kronisk infeksjon med hepatitt B-virus (HBV) er en viktig risikofaktor for kroniske leversykdommer 1. Selv om dagens terapeutiske strategier er basert på nukleotid-analoger som hemmer HBV pol funksjon og / eller administrering av type I interferon som aktiverer immunresponser hos infiserte individer, så vel som indirekte å undertrykke HBV spredning gjennom interferon-stimulerte genfunksjoner 2, kan disse behandlingene ikke eliminere HBV DNA helt tre. Videre fremveksten av HBVs som er resistente mot anti-pol midler er av interesse 4. Administrasjonen av kombinerte antivirale midler direkte rettet mot de ulike trinnene i humant immunsviktvirus (HIV) eller hepatitt C virus (HCV) livssyklus ble vist å kunne undertrykke eller utrydde viruset (es). I likhet med denne ideen, utvikling av anti-HBV middel (e) som virker direkte på de ulike stadier av HBV livssyklus er viktig for å etablere fremtidige HBV-terapier.

Generelt, etablering av en enkel in vitro kultursystem av målet viruset forenkler utviklingen av antivirusmidler. Det er imidlertid minst to barrierer for utvikling av in vitro kultursystemer for å screene anti-HBV-midler. Den første er mangelen på en enkel in vitro-cellekultursystem for HBV-infeksjon / proliferasjon. I motsetning til andre virus, slik som HIV og HCV, som forplanter seg i etablerte cellelinjer, er det vanskelig å dyrke HBV in vitro på grunn av eksperimentelle begrensninger, inkludert et snevert vertsområde. Bruken av spesifikke cellekultursystemer som for eksempel den humane hepatom-cellelinje HepaRG, som er utsatt for HBV-infeksjon, 5, 6, 7 er blitt utviklet for å overvinne disse problemene. Videre PXB celler, isolert fra urokinase-type plasminogen aktivator transgene / SCID mus inokulert med primære humane hepatocytter (PHH), viste seg å være utsatt for HBV-infeksjon og replikasjon 8. Men HBV replikasjonsnivået i HepaRG er avhengig av cellulær differensiering tilstand etter kultur, noe som kan føre til inkonsistente og uforklarlige resultatene av HBV infeksjon / replikering nivåer. PXB er ofte brukt for HBV smitteforsøk, men er begrenset av sin tilgjengelighet. En tetracyklin-induserbar ekspresjon av HBV-cellelinje, HepAD38, har også blitt mye brukt til å studere HBV replikasjon, men dette systemet tillater bare evaluering etter transkripsjon, og ikke på inngangstrinnet av HBV-infeksjon 9. Nylig har identifikasjon av natriumtaurocholat cotransporting polypeptid (NTCP) som en funksjonell reseptor for HBV er tillatt utviklingen av en variabel HBV kultursystem 10. Faktisk NTCP uttrykk i ikke-følsomme hepatokarsinom celler som Huh7 ogHepG2 gjør det mulig for HBV-infeksjon 10 og dermed har valget av HBV mottagelig cellelinjer blitt utvidet, løse mange av de eksperimentelle begrensninger. Det andre problem er mangelen på en enkel bestemmelsessystem for å evaluere HBV-infeksjon og replikasjon. Evaluering av HBV-infeksjon blir vanligvis utført ved å analysere HBV DNA, RNA og proteiner. Imidlertid kvantifisering av disse virus markørene er tidkrevende, kostbart og ofte ikke alltid er enkelt. Derfor er utviklingen av et enkelt assay-system, for eksempel ved hjelp av et reporter-gen, kan overvinne problemene forbundet med HBV analysesystemer.

Imidlertid, fordi den genomstørrelse som kan pakkes inn i en HBV kapsid er begrenset - mindre enn 3,7 kb 11 - størrelsen på et reportergen bør være så kort som mulig. Videre, tilstedeværelsen av flere cis-elementer er spredt over hele genomet, som er essensielle for virusreplikasjon, begrenser de stillinger som er tilgjengelige for i sertion av reportergenet i genomet. Flere rapporter har forsøkt å sette inn fremmede gener, inkludert HIV-1 Tat, grønt fluorescerende protein, og DsRed, inn i HBV-genomet 11, 12, 13. Men disse rekombinante HBVs ikke er nyttige for screening av HBV-infeksjon / replikasjon, eller for high-throughput screening av faktorer som påvirker HBV-infeksjon / replikasjon. Dette er hovedsakelig på grunn av den lave produktivitet av rekombinante virus og den reduserte intensitet av reportergenekspresjon skyldes ineffektiv virusproduksjon.

For å overvinne disse problemene, konstruerte vi et reporter HBV med et høyt utbytte av virusproduksjon. Dette viruset er svært følsom for overvåking av de tidlige stadiene av den HBV-replikasjonssyklus, fra inngang til transkripsjon. For å oppnå dette, ble NanoLuc (NL) valgt som et markør-gen, fordi det er en liten (171 aminosyrer) konstruert luminescerende reporterclass = "xref"> 14. Videre er NL ca 150 ganger lysere enn ildflue eller Renilla luciferase, og den selvlysende reaksjonen er ATP-uavhengig, noe som tyder på at den falske hit rate vil være lav for høy gjennomstrømming screening. Den produksjonseffektivitet av det rekombinante HBV er omtrent 1/5 av den overordnede HBV, og tilsvarende nivå som er rapportert for tidligere HBV rekombinante virus; imidlertid, vil lysstyrken NL overvinner virus produktivitets problemer slik at den kan brukes for masse screening av anti-HBV-midler.

Screening av anti-HBV-midler ved hjelp av primære hepatocytter kan HepaRG, HepAD38 og NTCP-transduserte hepatocytter være nyttige for screening av anti-HBV-midler ved konvensjonell metode (r). Imidlertid er systemet som er beskrevet her har en rekke fordeler som enkel håndtering, høy følsomhet og lav kostnad for screening. Disse fordelene er egnet for høy gjennomstrømning analyser for å utvikle og identifisere nye HBV midler til terapeutiske formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Produksjon av rekombinant HBV Koding Reporter Protein

  1. Utarbeidelse av HepG2 celler
    1. Fremstille cellekulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 100 U / ml ikke-essensielle aminosyrer).
    2. Plate 4 x 10 6 HepG2-celler i en 10-cm kollagen-belagte fatet i 10 ml kulturmedium dagen før transfeksjon. Inkuber HepG2 celler ved 37 ° C i en fuktig 5% CO2 inkubator.
      MERK: Når ca. 4 x 10 6 HepG2-celler blir sådd ut i en 10 cm kollagenbelagt fatet i 10 ml kulturmedium, vil de være 70-90% konfluent den neste dag.
  2. transfeksjon
    1. Transfektere HepG2 celler med 5 mikrogram pUC1.2HBV delta epsilon 15 og 5 mikrogram pUC1.2HBV / NL 15 ved hjelp av en transfeksjonreagens i henhold til produsentens anvisninger.
    2. Neste dag, fjerne kulturmedium og legge til 10 ml friskt kulturmedium.
    3. En uke etter transfeksjon, overføre kulturmediet inneholder rekombinant HBV til en 50 ml-tube og fortsett til trinn 1.3.1. Tilsett 10 ml friskt kulturmedium til platen som inneholdt de transfekterte celler.
      MERK: Fremstilling av det rekombinante HBV ble opprettholdt i 4 uker. Kulturmediet inneholdende rekombinant HBV kan lagres ved 4 ° C i en måned.
  3. Rensing av rekombinant HBV
    1. Fjerne cellerester fra dyrkningsmedium inneholdende rekombinant HBV ved sentrifugering (2300 xg i 5 min).
    2. Bestå av supernatanten gjennom et 0,45 um membranfilter.
    3. Legge til et likt volum av 26% PEG / 1,5 M NaCl (polyetylenglykol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 og 5 ml 1 M HEPES, pH 7,6 i 500 ml) i dyrkningsmediet inneholder rekombinantHBV og bland forsiktig. Inkuber over natten ved 4 ° C.
    4. Sentrifuger ved 2300 xg i 20 min ved 4 ° C.
    5. Kast supernatanten og oppløse pelleten i 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Fjerne avfall ved sentrifugering ved 2300 xg i 5 min.
    7. Belastning 0,5 ml TNE inneholdende rekombinant HBV på 0,8 ml 20% sukrose i TNE.
    8. Sentrifuger ved 100 000 x g i 3 timer ved 15 ° C.
    9. Kast så mye av supernatanten som mulig, og lagre pellets. Resuspender den i 1 ml serumfritt DMEM pr 40 ml startkulturmedium.
    10. Inkuber over natten ved 4 ° C.
    11. Filtrer gjennom et 0,45 um filter. Forbered 0,5 ml prøver og oppbevar ved -80 ° C.
      MERK: Hvis reporteren protein forurensning av den opprinnelige virusprøve er observert, rense viruset ved densitetsgradient-ultrasentrifugering av 5-30% sukrose i TNE ved 100.000 xg i 2 timer, eller CsCl densitetsgradient sentrifugering ekvilibrert from 1.1 til 1.6 g / ml ved 150 000 xg i 50 timer.

2. Infeksjon av rekombinant HBV

  1. Kultur HepG2-celler som stabilt uttrykker NTCP (HepG2 / NTCP) 15 som er utsatt for HBV-infeksjon i DMEM supplementert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 250 ug / ml G-418 og 100 U / ml ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C i en fuktig 5% CO2 inkubator.
  2. Én dag før infeksjon, platen ca 5 x 10 4 HepG2 / NTCP celler 14 inn i en 96-brønners kollagen belagt plate i 0,1 ml kulturmedium.
  3. Tine rekombinant HBV i et 37 ° C vannbad inntil det er en liten bit av is som er igjen i flasken.
  4. Klargjør medium for smitte ved å kombinere de følgende: 10 ul av 40% PEG8000 i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), 2 ul dimetylsulfoksid (DMSO), 10 ul rekombinant HBV og 78 ul av frisk kulturmediumper brønn av en 96-brønns plate.
  5. Tilsett 100 ul av rekombinant HBV-løsning til en brønn av 96-brønns plate.
  6. En dag etter infeksjon, vasker de infiserte cellene 3 ganger med 300 ul PBS per brønn for å fjerne det forurensende reporter protein fra viruset fraksjon.
  7. Inkuber infiserte celler i 200 ul kulturmedium inneholdende 2% DMSO i en uke eller mindre.

3. Analyse

  1. En uke etter infeksjon, vasker den infiserte cellene 3 ganger med PBS.
  2. Tilsett 50 pl av lyseringsbuffer til de infiserte cellene.
  3. Rock kulturplaten i 5 min, og deretter sentrifuger ved 2000 xg i 5 min.
  4. Tilsett 50 pl av reporteren substratet i luminometeret plate.
  5. Tilsett 20 ul cellelysat i et luminometer plate inneholdende reporter substratet. Bland ved å virvle kort.
  6. Sett platen i luminometeret og initiere lesing 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av HBV-genomet, transkriberte RNA, virusproteiner og deres kodende område i genomet. Reporteren genet og dens plassering i genomet er også indikert. Figur 2 viser HBV reporter plasmid og hjelper-plasmid som inneholder reportergenet. Den pUC1.2HBV / NL reporter ble konstruert ved å slette nukleotidposisjoner 223-811 fra transkripsjons-initierings-setet av den Precore mRNA av pUC1.2HBV 16 og deretter sette inn rapportørgenet. Den pUC1.2HBVdelta med punktmutasjoner i encapsidation signalsekvensen ble generert ved seterettet mutagenese PCR. Reporter plasmid (pUC1.2HBV / NL) og hjelper-plasmid (pUC1.2HBVdelta) ble spaltet med Hindlll og EcoRI, og deretter underkastet gel-elektroforese. De forventede bånd, som er 3,0 kb for pUC-plasmidet og 3,5 kb for 1.2HBV / NL eller 1.2HBVdelta, er vist i figurure 2B. Figur 3 viser HepG2-celler som uttrykker NTCP infisert med rekombinant HBV. Å etablere HepG2 celler som stabilt uttrykker NTCP, ble HepG2 celler transfektert med pCAN-NTCP-myc koding NTCP-myc og en neomycin motstandsdyktig genet. G418-resistente cellekloner ble selektert og utvidet. Den HepG2-NTCP-myc-clone22 er utsatt for HBV-infeksjon. Lysatene av HepG2 eller HepG2-NTCP-myc-clone22 ble utsatt for western blotting. NTCP er et glykoprotein av 349 aminosyrer, med en ekstracellulær N-terminus inneholder to N-bundne glykosyleringsseter (Asn5 og Asn11). Den 43 kDa bånd av ikke-glykosylerte NTCP og 65 kDa band av glykosylert 10 er vist i figur 3A. HepG2-NTCP-myc-clone22 celler som uttrykker NTCP, men ikke HepG2-celler, var følsomme for rekombinant HBV-infeksjon. Figur 4 viser kinetikken til reportergenet (A og B), virus RNA og DNA (a) -nivåer hos rekombinant HBV-infisert HepG2-NTCP-myc-klon22 (A) eller humane primære hepatocytter (PHH) celler (B). Nivåene av HBV RNA og reporter aktivitet ble forhøyet i 3 dager etter smitte i HepG2-NTCP-myc-clone22 eller PHH celler. I motsetning til dette var det ingen endring i DNA-nivåer på 9 dager etter infeksjon på grunn rekombinant HBV er mangelfull for funksjonell kjerne og pol som har en viktig rolle i intracellulær DNA replikasjon pathway. Figur 5 viser inhibering av rekombinant HBV av hepatitt B-immunglobulin (humant), heparin og IFN-β. Entry inhibitorer så som HBIg og heparin undertrykkes sterkt rapportøraktivitet, ved mindre enn 10% ved 75 U / ml og 150 U / ml, respektivt, mens IFN-β trykkes rapportøraktivitet med mindre enn 50% ved 1000 U / ml. Den inhiberende virkning av disse inhibitorene var doseavhengig. Figur 6 viser livssyklusen til HBV.

Figur 1
Fi gur 1: Skjematisk av HBV-genomet og relativ plassering av virus RNA og proteiner på genomet. HBV DNA er vist ved en bue i svart. Plasseringen av enhancer og promotorer for transkripsjon av viruset RNA i lysbuen er vist i gult. Plasseringen av viral RNA og proteiner på genomet er representert ved pilene med stiplede linjer blå (RNA) og med fargede pilene (proteiner), henholdsvis. Virus RNA blir diskriminert av størrelse: 3,5 kb og 3,4 kb mRNA indikere Precore / C og pregenomiske RNA / Core, henholdsvis 2,5 og 2,1 kb RNA representerer henholdsvis preS1 og preS2 / S, og 0,8 kb RNA viser X-gen 17. Et reportergen er substituert med den aktuelle størrelse av kjerne kodende sekvens. Reportergenet blir drevet av en kjerne inneholdende promoter enhancer II. Pro: Arrangøren, EnhI / pro: Enhancer I / promoter, EnhII / Pro: EnhancerII / promoter, Pol: Polymerase, S: Surface antigen. target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Skjematisk for generering av rekombinante HBV. (A) Blå linjer viser pregenome RNA. "A" representerer strekning poly A ved 3'-terminus. Blå boksene angir den kodende region for hvert virus protein. Den røde boksen indikerer en reporter gen oversatt fra sitt eget initieringskodon. Reporteren plasmid kan ikke produsere Precore og Pol, og hjelperen plasmidet inneholder 2 mutasjoner i encapsidation signal (CTGTGCC til CTATGTC) uttrykker alle HBV proteiner. E: encapsidation signal. (B) Reporteren plasmid, helper plasmid og pUC plasmid ble fordøyd med Eco RI og Hindlll. Disse fordøyde plasmider ble underkastet gel-elektroforese.ad / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Rekombinant HBV infiserer HepG2 uttrykke NTCP. (A) En stabil cellelinje som uttrykker NTCP ble etablert ved transfeksjon av HepG2-celler med et plasmid som koder for Myc-tagged NTCP etterfulgt av seleksjon med 500 ug / ml G418 i 3 uker. Nivået av NTCP-Myc i HepG2-celler som stabilt uttrykker NTCP (HepG2-NTCP-Myc-clone22) celler ble bestemt ved Western-blotting ved anvendelse av anti-myc antistoff (1: 1000 fortynning). (B) HepG2-NTCP-Myc-clone22-celler ble infisert med rekombinant HBV i nærvær av 2% DMSO og 4% PEG8000. Ved 72 timer etter infeksjon, ble nivået av rapportøraktivitet bestemt ved reporter assay. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter, og feilSøylene viser the standardavvik av midlene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Tidsforløp av rekombinant HBV-infeksjon. (A) HepG2-NTCP-Myc-clone22-celler ble infisert med rekombinant HBV i nærvær av 2% DMSO og 4% PEG8000. Nivået av HBV-infeksjon ble bestemt ved reporter aktivitet (sort linje) ved 3, 6 eller 9 dager etter infeksjon. Nivåer av HBV RNA (blå linje) og DNA (oransje linje) ble samtidig målt ved hjelp av RT-PCR og PCR 15, henholdsvis, i hver infeksjon tidspunkt. (B) Primære humane hepatocytter (PHH), isolert fra urokinase-type plasminogen aktivator transgene / SCID mus inokulert med PHH, ble infisert med rekombinant HBV i presence 2% DMSO og 4% PEG8000. Nivået av HBV-infeksjon ble bestemt ved rapportøraktivitet, ved 3, 6 eller 9 dager etter infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Effekt av kjente anti-HBV-midler for rekombinant HBV-infeksjon. HepG2-NTCP-Myc-22-celler ble infisert med rekombinant HBV i nærvær av HBIg, heparin og IFN-β ved de doser som er angitt, så vel som 2% DMSO og 4% PEG8000. Nivået av HBV-replikasjon (A) og celle-levedyktighet (B) ble bestemt ved rapportøraktivitet, 6 dager etter infeksjonen. HBIg er et antistoff som nøytraliserer HBV-infeksjon, og heparin er en inhibitor for innkapslede virus. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter og feilstolper viser standardavvik av midler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Skjematisk av HBV livssyklus. HBV trer inn i cellene gjennom virusreseptorer inkludert NTCP. Kapsid-forbundet avslappet sirkulært DNA (rcDNA) er ubestrøket og konvertert til kovalent lukket sirkulært DNA (cccDNA) i kjernen. cccDNA fungerer som en templat for mRNA-transkripsjon. Det genomiske RNA er innkapslet for viruset kapsid ved montering med proteiner for kjerne og pol. Før ytterligere montering med HBS proteiner, er kapsid involvert i amplifisering av HBV-DNA ved en prosess som kalles cccDNA replikasjonsprosessen. Viruspartikler montert med HBS proteiner til slutt blir sluppet utenfor cellen.om / filer / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HBV-genomet har fire primære åpne leserammer (ORF) inkludert i kjernen, polymerase, overflate og X-ORF (figur 1). Transkripsjon av disse fire HBV ORF er strengt regulert av fire arrangører: den Precore / core promoter inneholder Enhancer II, S1 promoter, S2 promoter og X promoter inneholder enhancer jeg 18. 3,5 kb og 3,4 kb mRNA er oversatt til Precore og Core proteiner, henholdsvis. Den store innhylle protein (L) er produsert fra den største subgenomt mRNA (2,5 kb), og den midterste (M) og små overflateproteiner (e) er oversatt fra kortere transkripsjon (2,1 kb). Den 0,8 kb transkripsjon er malen for oversettelse av X protein 19, 20. 5'og 3'enden av pregenomiske RNA inneholder flere funksjonelle cis-elementer som inkluderer direkte gjenta en (DR1), DR2 og emballasje signal 21, 22. Disse funksjonelle elementene begrenser innføringen av rapportør eller markørgener inn i pregenomiske RNA. Vi har konstruert rekombinante HBV ved hjelp av transkomplementering av to vektorer, en overføringsvektor som inneholder reportergenet og en hjelper vektor. Den overføringsvektor ble konstruert ved utskifting av kjernen og pol- regionene med reporter-genet (figur 2).

NTCP ble identifisert som en cellulær reseptor for HBV entry 10. På grunn av at ekspresjonen av NTCP mRNA er meget lav på HepG2-celler, som ikke er utsatt for HBV-infeksjon, vi etablert en stabil HepG2-cellelinje som uttrykker NTCP-myc (figur 3A). Mens rekombinant HBV infeksjon av HepG2-celler viste ingen rapportøraktivitet, NTCP ekspresjon i HepG2 celler dratt mottakelighet for rekombinant HBV-infeksjon (figur 3B). Tidsforløpet analyse av rekombinant HBV-infeksjon vist at både rapportøraktivitet, og HBV RNA ble detectable innen 3 dager rekombinant HBV-infeksjon og nådde en topp på 9 dager postinfection; imidlertid økt HBV DNA-nivåer ble ikke observert (figur 4). Entry-hemmere, som HBIg eller heparin, hemmet rekombinant HBV-infeksjon (figur 5). Disse resultatene indikerte dette systemet kan brukes til å overvåke tidlig stadium HBV-replikasjon fra virus adgang til transkripsjon, men ikke DNA-replikasjon og re-infeksjon av virus frigjort fra infiserte celler (figur 6).

Siden reporteren proteinet ofte forurenser det rekombinante HBV fraksjon, vasking av de virusinfiserte celler med PBS mindre enn tre ganger kan resultere i en høy bakgrunn. Derfor er det viktig å kontrollere bakgrunnsnivået ved å måle reporter aktivitet i medium fra HBV-unsusceptible HepG2 behandlet med det rekombinante virus. Hvis bakgrunns er høy, legge til et vasketrinn (3 ganger vasking med 300 ul PBS per brønn i en 96-brønns plate) dagen befmalm trinn 3.1.

Hvis produksjonen av det rekombinante HBV er lav, transfeksjonseffektiviteten med en styre plasmid som uttrykker et fluorescent protein, slik som GFP eller DsRed. Generelt bør effektiviteten av transfeksjon av HepG2-celler være større enn 35%. Dersom transfeksjonseffektiviteten er lav, optimalisere spesifikke transfeksjon forhold for å oppnå høy transfeksjonseffektivitet. Hvis transfeksjon effektivitet er høy, sjekk om infeksiøs rekombinant HBV er produsert ved å bruke det til å infisere primære humane hepatocytter. Smittsomhet av HBV til primære humane hepatocytter er vanligvis høyere enn til hepatomcelle linjer som uttrykker NTCP. Dersom effektiv infeksjon av rekombinant HBV oppnås i primære, humane hepatocytter, er problemet ikke det rekombinante HBV men cellene å bli infisert. Etablere en rekke stabile HepG2 kloner uttrykker NTCP og velg svært smittsomme celle kloner. Lav cellesammenflytning i kulturen på tidspunktet for infeksjon kan også føre til dårlig jegnfectivity. Økning av antall celler i kulturen forbedrer effektiviteten infeksjon. For HBV-infeksjon, 80-95% konfluens for HepG2-celler som uttrykker NTCP ved tidspunktet for infeksjon gir en høy infeksjonsraten.

Utviklingen av flere rapportør HBVs har blitt rapportert av mange grupper 11, 12, 13, men de fleste av disse rapportør HBVs viser dårlig produktivitet. Dessuten er det rapportøraktivitet i infiserte celler ikke så høy, og vil være vanskelig å bruke for screening av anti-HBV-midler ved anvendelse av en high-throughput-analyse. I motsetning til dette produserer reporter HBV system en sterk reporter signal i de infiserte cellene som gjør det lett å gjennomføre masse screening for anti-HBV-midler ved anvendelse av en forholdsvis liten mengde av viruset i forhold til andre rapportørvirus er rapportert så langt.

Her, genererte vi en ny HBV reporter system for å overvåke de tidlige stadiene avHBV-replikasjonssyklus, og dette ble bekreftet ved måling av rapportørprotein aktivitet etter infeksjon. Den beskrevne fremgangsmåten er en enkel, rask og kostnadseffektiv HBV vektorsystem og vil være nyttig for identifisering av HBV vertsfaktorer, så vel som anti-HBV-forbindelser ved hjelp av high-throughput screening metoder. Ja, vi identifiserte HBV vertsfaktorer og anti-HBV-gener ved hel-genom RNAi teknologi 15. Av notatet, er dette system ikke egnet for evalueringen av de sene stadier av HBV-replikasjon, slik som DNA-replikasjon trinnet, kapsid, og virus montering, og spirende, fordi rekombinant HBV er mangelfull for fremstilling av en funksjonell kjerne og pol. Den videre utvikling av rekombinant HBV er nødvendig for å evaluere hele HBV livssyklus.

Oppsummert kan dette systemet bli brukt til å evaluere HBV-infeksjon ved måling av rapportøraktivitet. Derfor er det ikke nødvendig å gjennomføre kompliserte analyseteknikker slik som PCR, RT-PCR,HBV Core eller S antigen ELISA å evaluere HBV-infeksjon / replikering. Til slutt, fordi denne reporteren HBV-replikasjon er inkompetent, er det ingen risiko for infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter