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Immunology and Infection

Développement d'un système de virus de l'hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Nous décrivons ici un virus nouvellement mis au point contre l'hépatite B (VHB) système rapporteur pour surveiller les premiers stades du cycle de vie du VHB. Cette simplifiée système in vitro aidera dans le criblage d'agents anti-VHB en utilisant une stratégie à haut débit.

Introduction

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L' infection chronique par le virus de l' hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur pour les maladies chroniques du foie 1. Bien que des stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur des analogues de nucléotides qui inhibent la fonction du VHB pol et / ou l'administration d'interféron de type I qui activent les réponses immunitaires chez les individus infectés, ainsi que la suppression indirectement la prolifération du VHB par les fonctions des gènes d' interféron stimulées 2, ces traitements ne peuvent pas éliminer le VHB ADN complètement 3. En outre, l'émergence de HBVs qui sont résistantes aux agents anti-pol est préoccupante 4. L'administration d'agents anti-viraux combinés ciblant directement les différentes étapes du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou le virus de l'hépatite C (VHC) cycle de vie a été démontré avec succès pour supprimer ou éradiquer le virus (es). Semblable à cette idée, le développement d'un agent anti-VHB (s) qui agissent directement sur les différentes étapes du Hcycle de vie BV est important pour l'établissement de futures thérapies de HBV.

En général, la mise en place d'un simple système de culture in vitro du virus de la cible facilite le développement d'agents anti-viraux. Cependant, il existe au moins deux barrières au développement de systèmes in vitro de culture pour cribler des agents anti-VHB. La première est l'absence d'un système in vitro de la culture cellulaire convenable pour l' infection par le VHB / prolifération. Contrairement aux autres virus, comme le VIH et le VHC, qui se propagent dans des lignées cellulaires établies, il est difficile de cultiver le VHB in vitro en raison des limitations expérimentales , y compris une gamme d'hôtes étroite. L'utilisation de systèmes de culture de cellules spécifiques , telles que la lignée cellulaire d'hépatome humain HepaRG, qui est sensible à l' infection par le VHB, 5, 6, 7 ont été développées pour surmonter ces problèmes. En outre, les cellules PXB, isolées urokinase-type activateur du plasminogène transgénique / souris SCID inoculées avec primaire hépatocytes humains (PHH), ont été montrés pour être sensibles à l' infection HBV et la réplication 8. Cependant, les niveaux de réplication du VHB dans HepaRG dépendent de l'état de différenciation cellulaire après la culture, ce qui peut provoquer des résultats incohérents et non reproductibles de HBV niveaux d'infection / de réplication. PXB est couramment utilisé pour le VHB expériences d'infection, mais est limitée par la disponibilité. Une lignée cellulaire d'expression inductible du VHB à la tetracycline, HepAD38, a également été largement utilisée pour étudier la réplication du VHB, mais ce système ne permet qu'une évaluation après la transcription , et non à l'étape d'infection par le VHB 9 d'entrée. Récemment, l'identification d' un polypeptide du taurocholate de sodium cotransporting (PNT) en tant que récepteur fonctionnel pour le VHB a permis le développement d'un système de culture de VHB 10 variables. En effet, l'expression NTCP dans les cellules d'hépatocarcinome non sensibles tels que Huh7 etHepG2 permet l' infection par le VHB 10 et , par conséquent, le choix du VHB lignées cellulaires sensibles a été étendue, résoudre un grand nombre des limitations expérimentales. Le deuxième problème est le manque d'un système de test simple pour évaluer l'infection par le VHB et la réplication. L'évaluation de l'infection par le HBV est habituellement effectuée en analysant l'ADN du VHB, l'ARN et les protéines. Cependant, la quantification de ces marqueurs de virus est consommatrice de temps, souvent coûteux et pas toujours simple. Par conséquent, le développement d'un système de dosage simple, par exemple en utilisant un gène rapporteur, peut surmonter les problèmes associés aux systèmes de dosage du VHB.

Cependant, parce que la taille du génome qui peut être emballé dans une capside du VHB est limitée - moins de 3,7 kb 11 - la taille d'un gène rapporteur doit être aussi courte que possible. En outre, la présence de plusieurs éléments cis dispersés à travers le génome, qui sont essentielles à la réplication virale, limite les positions disponibles dans sertion du gène rapporteur dans le génome. Plusieurs rapports ont tenté d'insérer des gènes étrangers, y compris le VIH-1 Tat, la protéine fluorescente verte, et DsRed dans le génome du VHB 11, 12, 13. Cependant, ces HBVs recombinants ne sont pas utiles pour le criblage de l'infection par le VHB / réplication ou pour le criblage à haut débit des facteurs qui influent sur l'infection par le VHB / réplication. Ceci est principalement en raison de la faible productivité des virus recombinants et de l'intensité de l'expression réduite du gène reporter provoquée par la production du virus inefficace.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons construit un HBV rapporteur avec un rendement élevé de la production de virus. Ce virus est hautement sensible pour la surveillance des premiers stades du cycle de réplication du VHB, depuis l'entrée jusqu'à la transcription. Pour ce faire, NanoLuc (NL) a été choisi comme un gène marqueur, car il est un petit (171 acides aminés) conçus reporter luminescenteclass = "xref"> 14. De plus, NL est environ 150 fois plus brillante que luciole ou Renilla luciférase, et la réaction luminescente est ATP-indépendante, ce qui suggère que le taux de succès de faux sera faible pour le criblage à haut débit. L'efficacité de l'hépatite B recombinant de production est d'environ 1/5 du parent VHB et similaires aux taux indiqués pour les virus recombinants précédents du VHB; Cependant, la luminosité NL surmonte les problèmes de productivité du virus de sorte qu'il peut être utilisé pour le criblage de masse d'agents anti-VHB.

Dépistage des agents anti-VHB en utilisant des hépatocytes primaires, HepaRG, HepAD38 et hépatocytes NTCP-transduites pourrait être utile pour le criblage d'agents anti-VHB par la méthode (s) classique. Cependant, le système décrit ici présente divers avantages tels que la manipulation simple, une sensibilité élevée et un faible coût pour le dépistage. Ces avantages sont appropriés pour des essais à haut débit afin de développer et d'identifier de nouveaux agents de HBV à des fins thérapeutiques.

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Protocol

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1. Production recombinante de HBV codant pour la protéine reporter

  1. Préparation des cellules HepG2
    1. Préparer un milieu de culture cellulaire (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 100 U / ml d'acides aminés non essentiels).
    2. Plaques 4 x 10 6 cellules HepG2 dans un plat revêtu de collagène de 10 cm dans 10 ml de milieu de culture le jour avant la transfection. Incuber les cellules HepG2 à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO 2 incubateur.
      REMARQUE: Lorsque environ 4 x 10 6 cellules HepG2 sont étalées dans une boîte revêtue de collagène 10 cm dans 10 ml de milieu de culture, ils seront de 70 à 90% de confluence le jour suivant.
  2. transfection
    1. Transfecter des cellules HepG2 avec 5 ug de pUC1.2HBV delta epsilon 15 et 5 pg de pUC1.2HBV / NL 15 en utilisant une transfectionRéactif selon les instructions du fabricant.
    2. Le lendemain, retirer le milieu de culture et ajouter 10 ml de milieu de culture frais.
    3. Une semaine après la transfection, le transfert du milieu de culture contenant le HBV recombinant à un tube de 50 ml-et passez à l'étape 1.3.1. Ajouter 10 ml de milieu de culture frais à la plaque contenant les cellules transfectées.
      REMARQUE: La production de l'hépatite B recombinant est maintenue pendant 4 semaines. Le milieu de culture contenant de l'hépatite B recombinant peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois.
  3. Une purification du recombinant du VHB
    1. Éliminer les débris cellulaires à partir du milieu de culture contenant de l'hépatite B recombinant par centrifugation (2300 x g pendant 5 min).
    2. Passer le surnageant à travers un filtre de 0,45 um à membrane.
    3. Ajouter un volume égal de 26% de PEG / NaCl 1,5 M (polyéthylène glycol 6000: 130 g de NaCl, 49 g, 1 ml d'EDTA 0,5 M pH 8,0 et 5 ml de 1 M de HEPES, pH 7,6 dans 500 ml) au milieu de culture, contenant recombinantHBV et mélanger doucement. Incuber une nuit à 4 ° C.
    4. Centrifugeuse à 2.300 xg pendant 20 min à 4 ° C.
    5. Jeter le surnageant et on dissout le culot dans 0,5 ml de TNE (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
    6. Enlever les débris par centrifugation à 2300 g pendant 5 min.
    7. Charge 0,5 ml de TNE contenant HBV recombinant sur 0,8 ml de saccharose à 20% en TNE.
    8. Centrifugeuse à 100.000 x g pendant 3 heures à 15 ° C.
    9. Jeter autant de surnageant que possible, et enregistrer le culot. Remettre en suspension dans 1 ml de DMEM sans sérum par 40 ml de milieu de culture de départ.
    10. Incuber une nuit à 4 ° C.
    11. Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Préparer aliquotes de 0,5 ml et conserver à -80 ° C.
      REMARQUE: si la contamination de la protéine rapporteur de l'échantillon de virus d'origine est observée, purifier le virus en gradient de densité ultra-centrifugation de 5 à 30% de saccharose dans du TNE à 100 000 g pendant 2 h, soit une densité de CsCl en équilibre centrifugation from 1,1-1,6 g / ml à 150 000 xg pendant 50 h.

2. L'infection de HBV recombinant

  1. La culture des cellules HepG2 exprimant de manière stable PNAT (HepG2 / PNT) 15 qui sont sensibles à l' infection par le VHB dans un milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 250 pg / ml de G-418 et 100 U / ml acides aminés non essentiels à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO 2 incubateur.
  2. Un jour avant l' infection, la plaque d' environ 5 x 10 4 HepG2 / cellules NTCP 14 dans une plaque revêtue de collagène de 96 puits dans 0,1 ml de milieu de culture.
  3. HBV recombinant Thaw dans un bain d'eau C 37 ° jusqu'à ce que il y a un petit peu de glace restant dans le flacon.
  4. Préparer le milieu de l'infection en combinant les éléments suivants: 10 pl de 40% de PEG8000 dans 1 x tampon phosphate salin (PBS), 2 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO), 10 ul de HBV recombinant et 78 pi de milieu de culture fraispar puits d'une plaque à 96 puits.
  5. Ajouter 100 pi de solution de HBV recombinant à un puits de la plaque à 96 puits.
  6. Un jour après l'infection, les cellules infectées par lavage 3 fois avec 300 ul de PBS par puits pour éliminer les protéines contaminantes de la fraction reporteur à partir du virus.
  7. Incuber les cellules infectées dans 200 ul de milieu de culture contenant 2% de DMSO pendant une semaine ou moins.

3. Analyse

  1. Une semaine après l'infection, les cellules infectées par lavage 3 fois avec du PBS.
  2. Ajouter 50 ul de tampon de lyse des cellules infectées.
  3. Rock the plaque de culture pendant 5 min, puis centrifuger à 2000 xg pendant 5 min.
  4. Ajouter 50 ul du substrat reporter dans la plaque de luminomètre.
  5. Ajouter 20 pi de lysat cellulaire à une plaque de luminomètre contenant le substrat rapporteur. Mélanger par vortex brièvement.
  6. Placer la plaque dans le luminomètre et de lancer la lecture de 15.

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Representative Results

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La figure 1 montre une représentation schématique du génome du VHB, des ARN transcrits, protéines de virus et de leur région codante du génome. Le gène rapporteur et son emplacement dans le génome sont également indiqués. La figure 2 montre le plasmide rapporteur et un plasmide auxiliaire VHB contenant le gène rapporteur. Le pUC1.2HBV / NL reporteur a été construit en supprimant des positions de nucléotides 223-811 à partir du site d'initiation de transcription de l'ARNm de Precore pUC1.2HBV 16, puis en insérant le gène rapporteur. Le pUC1.2HBVdelta avec des mutations ponctuelles dans la séquence de signal d'encapsidation a été généré par mutagénèse dirigée par PCR. Plasmide rapporteur (pUC1.2HBV / NL) et le plasmide auxiliaire (pUC1.2HBVdelta) ont été digérés avec Hindlll et EcoRI, puis soumis à une électrophorèse sur gel. Les bandes attendues, qui sont 3,0 kb pour le plasmide pUC et 3,5 kb pour 1.2HBV / NL ou 1.2HBVdelta, sont présentés dans la figureure 2B. La figure 3 montre des cellules HepG2 exprimant NTCP infectés par le VHB recombinant. Pour établir des cellules HepG2 exprimant de manière stable NTCP, les cellules HepG2 ont été transfectées avec le codage PCAN-NTCP-myc NTCP-myc et un gène résistant à la néomycine. Des clones de cellules résistantes à G418 ont été sélectionnés et développés. Le HepG2-NTCP-myc-clone22 est sensible à l'infection par le VHB. Les lysats de HepG2 ou HepG2-NTCP-myc-clone22 ont été soumis à western blot. PNT est une glycoprotéine de 349 acides aminés, avec une extrémité N-terminale extracellulaire contenant deux sites de N-glycosylation (Asn11 et Asn5). Le 43 kDa bande de glycosylée NTCP et la bande de 65 kDa de glycosylée 10 sont représentés sur la figure 3A. les cellules HepG2-PNT-myc clone22 exprimant PNT, mais pas dans les cellules HepG2, ont été sensibles à l'infection par le HBV recombinant. La figure 4 montre la cinétique du gène rapporteur (A et B), de l' ARN viral et l' ADN (A) , les niveaux de VHB infectés par HepG2-PNT-myc-clone recombinant22 (A) ou des cellules humaines hépatocyte primaire (PHH) (B). Les niveaux de VHB ARN et l'activité du rapporteur ont été élevés à 3 jours après l'infection dans HepG2-NTCP-myc-clone22 ou cellules PHH. En revanche, il n'y a eu aucun changement dans les niveaux d'ADN à 9 jours après l'infection par le VHB car recombinant est déficient pour le noyau fonctionnel et pol qui ont un rôle important dans la voie de la réplication de l'ADN intracellulaire. La figure 5 montre l'inhibition de l' hépatite B recombinant par la globuline immune de l' hépatite B (IGHB), l' héparine et l' IFN-β. Les inhibiteurs d'entrée tels que IGHB et de l'héparine fortement supprimé l'activité de rapporteur de moins de 10% à 75 U / ml et 150 U / ml, respectivement, alors que l'IFN-β a supprimé l'activité du rapporteur de moins de 50% à 1 000 U / ml. L'effet inhibiteur de ces inhibiteurs est dose dépendante. La figure 6 illustre le cycle de vie du HBV.

Figure 1
Fi figure 1: Représentation schématique du génome du VHB et la position relative de l'ARN viral et de protéines sur le génome. L'ADN du VHB est représenté par un arc en noir. L'emplacement de l'activateur et les promoteurs pour la transcription d'ARN de virus de l'arc électrique est représenté en jaune. La localisation des ARN viraux et de protéines sur le génome sont représentés par des flèches en pointillés avec des lignes bleues (ARN) et avec des flèches colorées (protéines), respectivement. ARNs de virus sont discriminés par taille: 3,5 kb et 3.4 ARNm kb indiquent Precore / C et de l' ARN prégénomique / Core, respectivement, 2,5 et 2,1 ARNs kb représentent preS1 et preS2 / S, respectivement, et l'ARN de 0,8 kb indique le gène X 17. Un gène rapporteur est substitué par la taille correspondante de la séquence codante du noyau. Le gène rapporteur est entraîné par un promoteur de base contenant activateur II. Pro: Promoteur, EnhI / pro: Enhancer I / promoteur, EnhII / Pro: EnhancerII / promoteur, Pol: Polymerase, S: antigène de surface. target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Représentation schématique de la génération du HBV recombinant. (A) Les lignes bleues indiquent l'ARN pregenome. Le "A" stretch représente poly A à l'extrémité 3 'de. Les boîtes bleues indiquent la région codante pour chaque protéine virale. La boîte rouge indique un gène rapporteur traduit de son propre codon d'initiation. Le plasmide rapporteur ne peut pas produire Precore et Pol, et le plasmide auxiliaire contenant 2 mutations dans le signal d'encapsidation (CTGTGCC à CTATGTC) exprime toutes les protéines du VHB. E: signal d'encapsidation. (B) Le plasmide rapporteur, le plasmide auxiliaire et le plasmide pUC ont été digérés avec Eco RI et Hind III. Ces plasmides digérés ont été soumis à une électrophorèse sur gel.ad / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: HBV recombinant infecte HepG2 exprimant NTCP. (A) Une lignée cellulaire stable exprimant PNAT a été établie par la transfection des cellules HepG2 avec un plasmide codant pour Myc-tagged PNAT suivie d' une sélection avec 500 pg / ml de G418 pendant 3 semaines. Le niveau de la PNT-Myc dans des cellules HepG2 exprimant de manière stable PNAT (HepG2-PNT-Myc-clone22) des cellules a été déterminée par un transfert de Western en utilisant des anticorps anti-myc (1: 1000 dilution). (B) Les cellules HepG2-PNT-Myc clone22 ont été infectées par le HBV recombinant en présence de DMSO à 2% et 4% de PEG8000. À 72 h après l'infection, le niveau d'activité du rapporteur a été déterminée par un essai reporteur. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes, et les barres d'erreur indiquent ee écarts-types des moyennes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Évolution dans le temps de l' infection par le HBV recombinant. (A) Les cellules HepG2-PNT-Myc clone22 ont été infectées par le HBV recombinant en présence de DMSO à 2% et 4% de PEG8000. Le niveau d'infection par le VHB a été déterminée par l'activité du rapporteur (ligne noire) à 3, 6 ou 9 jours après l'infection. Les niveaux de VHB ARN (ligne bleue) et l' ADN (ligne orange) ont été mesurées simultanément par RT-PCR et PCR 15, respectivement, à chaque point de temps de l' infection. (B) des hépatocytes humains primaires (PHH), isolé à partir du type urokinase activateur de plasminogène transgéniques / SCID inoculées avec PHH, ont été infectés par le VHB recombinant dans le presence de DMSO à 2% et 4% de PEG8000. Le niveau d'infection par le VHB a été déterminée par l'activité du rapporteur à 3, 6 ou 9 jours après l'infection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Effet des agents connus anti-VHB sur l' infection par le HBV recombinant. HepG2-PNT-Myc 22 cellules ont été infectées par le HBV recombinant en présence d'IGHB, l'héparine et l'IFN-β aux doses indiquées, ainsi que 2% de DMSO et 4% de PEG8000. Le niveau de la réplication du VHB (A) et la viabilité cellulaire (B) a été déterminée par l' activité du rapporteur 6 jours après l' infection. IGHB est un anticorps qui neutralisent l'infection par le VHB et de l'héparine est un inhibiteur de virus enveloppés. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes, et les barres d'erreur montrer les écarts-types des moyens. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Représentation schématique du cycle de vie du HBV. HBV entre dans les cellules par le biais de récepteurs de virus, y compris NTCP. Capside associée ADN circulaire détendue (rcDNA) est non couché et converti en ADN circulaire fermé de façon covalente (cccDNA) dans le noyau. cccDNA fonctions en tant que matrice pour la transcription de l'ARNm. L'ARN génomique est encapsidé à la capside du virus par l'assemblage avec des protéines pour noyau et pol. Avant de monter encore avec des protéines HBS, la capside est impliqué dans l'amplification de l'ADN du VHB par un processus appelé le processus de réplication de cccDNA. Les particules virales assemblées avec des protéines HBS sont finalement libérés en dehors de la cellule.om / files / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Le génome du VHB a quatre trames primaires de lecture ouverts (ORF) , y compris le noyau, la polymerase, de surface et X ORFs (Figure 1). La transcription de ces ORFs quatre HBV est étroitement régulée par quatre promoteurs: le promoteur précore / noyau contenant activateur II, promoteur S1, S2 promoteur et X promoteur contenant activateur I 18. Les 3,5 kb et 3,4 kb ARNm sont traduits en protéines Precore et Core, respectivement. La grande protéine d'enveloppe (L) est produit à partir de la plus grande ARNm subgénomique (2,5 kb), et le milieu (M) et de petites protéines de surface (S) sont convertis de la transcription plus courte (2,1 kb). La transcription de 0,8 kb est le modèle pour la traduction de la protéine X 19, 20. Les 5'et 3 'extrémités de l' ARN prégénomique contiennent des éléments cis fonctionnels multiples qui incluent répétition directe 1 (DR1), DR2 et un signal d'emballage 21, 22. Ces éléments fonctionnels limitent l'insertion de gènes rapporteurs ou marqueurs dans l'ARN prégénomique. Nous avons construit le HBV recombinant en utilisant le trans-complémentation de deux vecteurs, un vecteur de transfert contenant le gène rapporteur et un vecteur auxiliaire. Le vecteur de transfert a été construit par remplacement des régions centrales et pol avec le gène rapporteur (figure 2).

PNAT a été identifié comme un récepteur cellulaire pour le VHB entrée 10. Parce que l'expression de l' ARNm de NTCP est très faible dans les cellules HepG2, qui ne sont pas sensibles à l' infection par le VHB, nous avons établi une lignée cellulaire HepG2 stable exprimant NTCP-myc (figure 3A). Considérant que l' infection par le HBV recombinant des cellules HepG2 n'a montré aucune activité de journaliste, l' expression NTCP dans les cellules HepG2 conféré susceptibilité à l' infection par le VHB recombinant (figure 3B). L'analyse au cours du temps de l'infection par le HBV recombinant a démontré que tant l'activité du rapporteur et de l'ARN du VHB ont été; detectable dans les 3 jours de l'infection par le HBV recombinant et a culminé à 9 jours après l'infection; Cependant, l' augmentation des niveaux d' ADN du VHB n'a pas été observé (figure 4). Les inhibiteurs d'entrée, tels que HBIG ou de l' héparine, l' infection par le HBV recombinant inhibée (Figure 5). Ces résultats indiquent ce système peut être utilisé pour surveiller la réplication du VHB début de l' étape de l' entrée du virus de la transcription mais pas la replication de l' ADN et de la ré-infection de virus libéré par les cellules infectées (figure 6).

Etant donné que la protéine rapporteur contaminent souvent la fraction de HBV recombinant lavant les cellules infectées par le virus avec du PBS au moins trois fois peut entraîner un bruit de fond élevé. Par conséquent, il est important de vérifier le niveau de fond en mesurant l'activité de journaliste dans un milieu de HepG2 HBV-unsusceptible traités avec le virus recombinant. Si le fond est élevé, ajouter une étape de lavage (3 fois le lavage avec 300 ul de PBS par puits dans une plaque de 96 puits) le bef jourminerai l'étape 3.1.

Si la production de l'hépatite B recombinant est faible, vérifier l'efficacité de transfection avec un plasmide témoin exprimant une protéine fluorescente, telle que la GFP ou DsRed. D'une manière générale, l'efficacité de la transfection des cellules HepG2 doit être supérieure à 35%. Si l'efficacité de transfection est faible, d'optimiser les conditions de transfection spécifiques pour atteindre des rendements élevés de transfection. Si l'efficacité de transfection est élevé, vérifier si le VHB infectieux recombinant est produit en utilisant pour infecter des hépatocytes humains primaires. Infectiosité du VHB à des hépatocytes humains primaires est généralement plus élevé que de lignées cellulaires d'hépatome exprimant NTCP. Si l'infection efficace de l'hépatite B recombinant est réalisée dans des hépatocytes humains primaires, le problème est non HBV recombinant mais les cellules à infecter. Mettre en place un certain nombre de clones HepG2 stables exprimant NTCP et sélectionner des clones hautement infectieux cellulaires. confluence cellulaire faible dans la culture au moment de l'infection peut entraîner une mauvaise infectivity. L'augmentation du nombre de cellules dans la culture permet d'améliorer l'efficacité de l'infection. Pour l'infection à VHB, 80-95% de confluence pour les cellules HepG2 exprimant NTCP au moment de l'infection fournit un taux d'infection élevé.

Le développement de plusieurs HBVs rapporteurs a été rapporté par de nombreux groupes 11, 12, 13, mais la plupart de ces HBVs rapporteurs montrent une faible productivité. En outre, l'activité du rapporteur dans les cellules infectées ne soit pas aussi élevée, et il serait difficile d'utiliser pour le criblage d'agents anti-VHB en utilisant un dosage à haut débit. En revanche, notre système journaliste HBV produit un signal rapporteur forte dans les cellules infectées qui le rend facile d'effectuer un dépistage de masse pour les agents anti-VHB en utilisant une quantité relativement faible du virus par rapport à d'autres virus rapporteurs rapportés jusqu'ici.

Ici, nous avons généré un système VHB rapporteur nouveau pour surveiller les premiers stades dele cycle de réplication du VHB, ce qui a été validée par mesure de l'activité de la protéine rapporteur après l'infection. Le procédé décrit est un système de vecteur VHB simple, rapide et rentable et sera utile pour l'identification des facteurs de l'hôte du VHB ainsi que des composés anti-VHB en utilisant des procédés de criblage à haut débit. En effet, nous avons identifié le VHB facteurs de l' hôte et des gènes anti-HBV par l' ensemble du génome de la technologie ARNi 15. Il faut noter que ce système ne convient pas pour l'évaluation des stades tardifs de la réplication du VHB tel que l'étape de réplication de l'ADN, la capside et l'assemblage du virus et bourgeonnant, car le VHB recombinant est déficient pour la production d'un noyau fonctionnel et pol. La poursuite du développement du HBV recombinant est nécessaire pour évaluer le cycle de vie du HBV entier.

En résumé, ce système peut être utilisé pour évaluer l'infection par le VHB en mesurant l'activité du rapporteur. Par conséquent, il est inutile de procéder à des techniques de dosage complexes telles que la PCR, la RT-PCR,HBV Core ou S antigène ELISA pour évaluer l'infection par le VHB / réplication. Enfin, parce que ce journaliste HBV est réplication incompétent, il n'y a aucun risque d'infection.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

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References

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Développement d'un système de virus de l'hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication
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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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