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Immunology and Infection

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.

Introduction

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B 형 간염 바이러스 (HBV) 만성 감염은 만성 간 질환 (1)의 주요 위험 인자이다. 현재의 치료 전략은 인터페론 - 자극 된 유전자의 기능이 관통 HBV의 POL 기능 및 / 또는 감염된 개인에서 면역 반응을 활성화 타입 I 인터페론의 투여뿐만 아니라 간접적으로 억제 HBV의 증식을 억제 뉴클레오티드 유사체에 기반하지만, 이러한 치료는 HBV를 제거 할 수없는 DNA 완전히 3. 또한, 안티 폴 화제에 내성 HBVs의 출현 문제 4이다. 직접 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 라이프 사이클의 상이한 단계를 타겟팅 결합 항 바이러스제의 투여가 성공적으로 억제하거나 바이러스 (들)를 박멸 도시 하였다. 이 아이디어는 H의 상이한 단계에 직접 작용 항 HBV 제 (들)의 개발과 마찬가지로BV 라이프 사이클 미래 HBV 치료를 설정하는 것이 중요하다.

일반적으로, 대상 바이러스의 시험 관내 배양 시스템에서 간단한의 설립은 항 바이러스 제제의 개발을 용이하게한다. 그러나, 항 HBV 제를 선별 할 수있는 시험 관내 배양 시스템의 개발에 대한 적어도 두 개의 장벽이있다. 첫 번째는 HBV 감염 / 확산 편리한 생체 외 세포 배양 시스템의 부족이다. 확립 된 세포주에서 전파 예컨대 HIV와 같은 다른 HCV 바이러스, 달리 때문에 좁은 숙주 범위 제한을 포함하여 실험 관내에서 HBV 양성하기 어렵다. 이러한 HBV 감염, 5, 6에 취약 인간 간암 세포주 HepaRG, 특정 세포 배양 시스템의 사용은도 7에 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 또한, 유로 키나아제 TY에서 분리 PXB 세포체육 플라스 미노 겐 활성제의 형질 전환 / 차 인간 간세포 (PHH) 접종 SCID 마우스는 HBV 감염과 복제 팔에 민감한 것으로 나타났다. 그러나 HepaRG에서 HBV 복제 수준은 HBV 감염 / 복제 수준의 일관성과 재생 불가능한 결과가 발생할 수 있습니다 배양 한 후 세포 분화 상태에 따라 달라집니다. PXB는 일반적으로 HBV 감염 실험에 사용되지만 가용성에 의해 제한된다. 테트라 사이클린 유도 HBV 발현 세포주 HepAD38도 널리 HBV 복제를 연구하는 데 사용했지만,이 시스템은 전사 후하지 HBV 감염 (9)의 입력 단계에서 평가를 허용한다. 최근에, HBV에 대한 기능적 수용체 나트륨 타우로 콜산의 cotransporting 폴리펩티드의 동정 (NTCP)는 가변 HBV 배양 시스템 (10)의 개발을 허용했다. 실제로, 이러한 Huh7 비 감수성 간암 세포에서 발현 NTCPHepG2 세포는 HBV 감염을 열 수있게하고, 따라서, HBV 감염 세포주의 선택은 실험 많은 한계를 해결 확장되었다. 두 번째 문제는 HBV 감염 및 복제를 평가하기위한 간단한 분석 시스템의 부족이다. HBV 감염의 평가는 일반적으로 HBV DNA, RNA 및 단백질을 분석함으로써 수행된다. 그러나 이러한 바이러스 마커의 정량은 종종 비용이 많이 들고 항상 간단하지가 시간 소비이다. 따라서, 간단한 분석 시스템의 개발은, 예컨대 리포터 유전자를 사용하여 같은 HBV 분석 시스템과 관련된 문제를 극복 할 수있다.

그러나, HBV 캡시드로 패키징 될 수있는 게놈 크기가 제한되기 때문에 - 미만 3.7 KB 11 - 리포터 유전자의 크기가 가능한 한 짧아야한다. 또한, 바이러스 복제에 필수적인 게놈 흩어져 여러 시스 엘리먼트의 존재에 대한 가능한 위치를 제한 게놈에 리포터 유전자의 sertion. 몇몇 보고서는 HBV 게놈 11, 12, 13로, HIV-1 문신, 녹색 형광 단백질 및을 DsRed을 포함하여 외래 유전자를 삽입하려고했습니다. 그러나 이러한 재조합 HBVs는 HBV 감염 / 복제, 또는 HBV 감염 / 복제에 영향을 미치는 요인의 높은 처리량 검사 선별에 유용하지 않다. 이것은 주로 때문에 재조합 바이러스의 낮은 생산성과 비효율적 바이러스 생산에 의한 리포터 유전자 발현의 감소 된 강도이다.

이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 바이러스 생산의 고 수율을 가진 리포터 HBV를 구축 하였다. 이 바이러스는 전사 엔트리에 상기 HBV 복제 사이클의 초기 모니터링을위한 매우 민감하다. 이 작은 (171 개 아미노산)이 발광 기자를 설계하기 때문에이를 위해 NanoLuc (NL)는 마커 유전자로서 선택되었다클래스 = "외부 참조"> 14. 또한, NL 반딧불 또는 레 닐라 루시퍼보다 밝은 150 배 정도이고, 상기 발광 반응을 잘못된 히트 율이 높은 처리량 스크리닝 낮을 것으로 제안 ATP 독립적이다. 재조합 HBV의 생산 효율은 약 1/5 모 HBV의 이전 HBV 재조합 바이러스보고 수준과 유사하다; 이 항 HBV 제제의 질량 검사에 사용될 수 있지만, NL의 밝기 바이러스 생산성 문제를 극복한다.

기본 간세포를 사용하여 안티 HBV 요원의 검사는 HepaRG, HepAD38 및 NTCP-형질 간세포는 종래의 방법 (들)에 의해 항 HBV 에이전트의 심사에 유용 할 수 있습니다. 그러나, 여기에 설명 된 시스템은 간단한 처리, 고감도 및 스크리닝 저비용 등의 다양한 이점이있다. 이러한 장점 개발 및 치료 목적 HBV 새로운 에이전트를 식별하기위한 고 처리량 분석에 적합하다.

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Protocol

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리포터 단백질을 코딩하는 재조합 HBV 1. 제조

  1. 인 HepG2 세포의 제조
    1. 세포 배양 배지를 준비 (둘 베코 변형 이글 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS로 보충 (DMEM)), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖의 비 필수 아미노산).
    2. 배지 10 ml의 형질 전날에 10 cm 콜라겐 코팅 접시 플레이트 4 × 10 6 인 HepG2 세포. 가습 된 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃ 인 HepG2 세포를 인큐베이션.
      주 : 약 4 × 106 인 HepG2 세포 배양 배지 10 ㎖의 10cm 콜라겐 코팅 접시에 도금되는 경우, 그들은 70~90% 합류 다음날 것이다.
  2. 형질
    1. pUC1.2HBV 델타 엡실론 (15)의 5 μg의 및 pUC1.2HBV / NL (15)의 5 μg의와 형질 인 HepG2 세포 형질을 사용하여제조업체의 지침에 따라 시약.
    2. 다음날, 배지를 제거하고 신선한 배지를 가하여 10.
    3. 1 주일 형질 감염 후, 50 ㎖ 튜브에 재조합 HBV를 포함하는 배양액을 옮기고 1.3.1 단계로 진행. 형질 감염된 세포를 함유하는 플레이트에 신선한 배지 10 ㎖를 추가한다.
      참고 : 재조합 B 형 간염 바이러스의 생산 4 주 동안 유지된다. HBV 재조합 체를 함유하는 배지 1 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  3. 재조합 B 형 간염 바이러스의 정제
    1. 원심 분리하여 재조합 HBV (5 분 동안 2,300 XG)을 함유하는 배지에서 세포 파편을 제거한다.
    2. 0.45 μm의 멤브레인 필터를 통해 뜨는을 전달합니다.
    3. 문화 매체에 : 26 % PEG / 1.5 M의 NaCl (130g, 염화나트륨, 49g, 0.5 M EDTA 산도 8.0의 1 mL 및 1 M HEPES pH를 5 ml의 7.6 500 ml의 폴리에틸렌 글리콜 6000)의 동일한 볼륨을 추가 포함하는 재조합HBV 가볍게 섞는다. 4 ℃에서 밤새 품어.
    4. 4 ℃에서 20 분 동안 2,300 XG에 원심 분리기.
    5. 뜨는을 취소하고 TNE 0.5 ㎖ (10 mM 트리스, 50 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 EDTA)에서 펠렛을 녹인다.
    6. 5 분 동안 2,300 XG에서 원심 분리하여 이물질을 제거합니다.
    7. TNE 0.8 ml의 20 % 자당 상에로드 재조합 B 형 간염 바이러스를 포함 TNE 0.5 ml의.
    8. 15 ° C에서 3 시간 동안 100,000 × g에서 원심 분리기.
    9. 가능한 상층 액만큼을 폐기하고, 펠렛을 저장합니다. 배지의 개시 40 mL의 무 혈청 DMEM 1 ㎖에 재현 탁을.
    10. 4 ℃에서 밤새 품어.
    11. 0.45 μm의 필터를 통해 필터링합니다. -80 ° C에서 0.5 ml의 분취 및 저장을 준비합니다.
      주 : 원래 바이러스 시료의 리포터 단백질의 오염이 관찰되는 경우, 2 시간 동안 100,000 XG에 TNE에서 5~30% 자당 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 바이러스를 정제 또는 아프로 CSCL 밀도 평형화 원심50 시간 동안 150,000 XG에 m 1.1-1.6 g / ㎖.

재조합 B 형 간염 바이러스의 감염 (2)

  1. 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 μg의 / ㎖ G-418, 100 U / ㎖로 보충 된 DMEM에서 HBV 감염에 취약 안정적 NTCP (HepG2 세포 / NTCP) (15)를 발현하는 문화 인 HepG2 세포 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 비 필수 아미노산.
  2. 하루 감염 전에 플레이트 약 5 × 104 인 HepG2 / 배지 0.1 ㎖ 중의 96 웰 콜라겐 코팅 된 플레이트에 NTCP 셀 (14).
  3. 37 ° C의 물을 욕조에 해동 재조합 B 형 간염 바이러스 유리 병에 남아있는 얼음의 작은 비트가있을 때까지.
  4. 다음 결합하여 감염 배지를 준비 : 1X 인산 완충 식염수 (PBS), 디메틸 설폭 사이드 2 μL (DMSO)에 40 % PEG8000 10 μl를 재조합 HBV 10 ㎕의 신선한 배지 78 μL96- 웰 플레이트의 웰 당.
  5. 96 웰 플레이트의 한 웰에 재조합 B 형 간염 용액 100 μl를 추가합니다.
  6. 어느 날 감염 후, 바이러스 부분에서 오염 기자 단백질을 제거하는 웰 당 300 ㎕의 PBS에 감염된 세포를 3 회 반복한다.
  7. 일주 이하 2 %의 DMSO를 함유하는 배지 200 μL에 감염된 세포를 인큐베이션.

3. 분석

  1. 일주일 감염 후, PBS로 감염된 세포를 3 회 반복한다.
  2. 감염된 세포에 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다.
  3. 5 분간 배양 플레이트를 흔들어 후 5 분 동안 2000 × g으로 원심 분리기.
  4. 루미 판에 기자 기판의 50 μl를 추가합니다.
  5. 기자 기판을 포함하는 루미 판에 세포 용 해물 20 μl를 추가합니다. 잠시 텍싱하여 섞는다.
  6. 루미에 접시를 놓고 15을 읽기 시작합니다.

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Representative Results

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도 1은 게놈에서 HBV 게놈의 RNA 전사는 바이러스 단백질 및 코딩 영역의 개략도를 도시한다. 게놈의 리포터 유전자 및 그 위치도 표시됩니다. 도 2는 리포터 유전자를 포함하는 HBV 리포터 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 나타낸다. pUC1.2HBV / NL 기자는 pUC1.2HBV (16)의 preCore의 mRNA의 전사 개시 사이트에서 염기 위치를 223-811을 삭제 한 후 리포터 유전자를 삽입하여 제작 하였다. 이입의 신호 서열의 점 돌연변이와 pUC1.2HBVdelta은 부위 특이 적 변이 PCR에 의해 생성 하였다. 리포터 플라스미드 (pUC1.2HBV / NL) 및 헬퍼 플라스미드 (pUC1.2HBVdelta)는 DIII 에코 RI로 분해 한 다음 전기 영동 하였다. 는 pUC 플라스미드 3.0 킬로바이트 및 1.2HBV / NL 또는 1.2HBVdelta 3.5 킬로바이트가 예상 밴드는,도있다URE의 (b). 그림 3은 재조합 B 형 간염 바이러스에 감염 NTCP을 표현 인 HepG2 세포를 보여줍니다. 안정적으로 NTCP을 표현 인 HepG2 세포를 설정하려면, 인 HepG2 세포 PCAN-NTCP-myc의 인코딩 NTCP-myc 단백과 네오 마이신 내성 유전자로 형질했다. G418 내성 세포 클론을 선택하여 확대 배양 하였다. 인 HepG2-NTCP-myc의-clone22는 HBV 감염에 취약하다. 인 HepG2 또는 인 HepG2-NTCP-myc의-clone22의 해물 서부 블로 팅을 실시 하였다. NTCP 두 개의 N- 결합 글리코 실화 부위 (Asn5 및 Asn11)를 함유하는 세포 외 N- 말단에, 349 아미노산 당 단백질이다. 당화 NTCP의 43 kDa의 밴드와 글리코 실화 (10)의 65 kDa의 밴드는도 3a에 도시되어있다. NTCP 표현 인 HepG2-NTCP-myc의 세포 - clone22 아니지만 인 HepG2 세포는 재조합 HBV 감염에 취약 하였다. 도 4는 재조합 HBV 감염이 HepG2-NTCP-myc의 클론에서 리포터 유전자의 동역학 (A 및 B), 바이러스 RNA와 DNA (A) 농도를 도시22 (A) 또는 인간 간세포 주 (PHH) 셀 (B). B 형 간염 바이러스 RNA와 기자 활동의 수준 인 HepG2-NTCP-myc의-clone22 또는 PHH 세포에서 감염 후 3 일에서 상승했다. 재조합 HBV DNA가 세포 내 복제 경로에서 중요한 역할을 기능적 코어 POL위한 결손 때문 반면, 감염 후 구일에서 DNA 수준에서의 변화는 없었다. 그림 5는 B 형 간염 면역 글로불린 (HBIG), 헤파린 및 IFN-β에 의해 재조합 B 형 간염 바이러스의 억제를 보여줍니다. IFN-β, 000 U / ㎖에서 50 % 미만으로 리포터 활성을 억제하면서 이러한 HBIG 헤파린과 같은 항목 억제제 강하게 각각 ml를 75 U / 150 U / ㎖에서 10 % 미만으로 리포터 활성을 억제 하였다. 이러한 억제제의 억제 효과는 용량 의존적이었다. 도 6은 HBV의 수명을 나타낸다.

그림 1
인터넷 gure 1 : HBV 게놈 및 게놈에 바이러스 RNA와 단백질의 상대적 위치의 도식. HBV DNA는 검은 색의 아크으로 표시됩니다. 아크에서 바이러스의 RNA의 전사 인핸서 및 프로모터의 위치는 노란색으로 표시된다. 바이러스 성 RNA를 게놈에 단백질의 위치는 점선 파란색 선 (RNA)와 각각 색 화살표 (단백질)와 화살표로 표시됩니다. 바이러스 RNA를이 크기에 의해 구별된다 : 3.5 킬로바이트 및 3.4 킬로바이트의 mRNA를 각각 PreCore / C 및 pregenomic RNA / 코어, 표시, 2.5 및 2.1 킬로바이트의 RNA를 각각 preS1 및 preS2 / S를 나타내고, 0.8 킬로바이트의 RNA는 X 유전자 (17)를 나타냅니다. 리포터 유전자는 코어 코딩 서열의 관련 크기에 의해 치환된다. 리포터 유전자 인핸서 II를 함유하는 코어 프로모터에 의해 구동된다. 프로 : 프로 발기인, EnhI / : 증강 I / 프로모터, EnhII / 프로 : EnhancerII / 프로모터, 폴 : 중합 효소, S : 표면 항원. 대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 재조합 B 형 간염 바이러스의 생성을위한 회로도. (A) 블루 라인은 pregenome의 RNA를 나타냅니다. 은 "A"스트레칭은 3 '말단에 폴리 A를 나타냅니다. 블루 박스는 각 바이러스 단백질에 대한 코딩 영역을 나타낸다. 빨간색 상자는 자신의 개시 코돈 번역 리포터 유전자를 나타냅니다. PreCore 및 폴 및 (CTATGTC에 CTGTGCC) 이입 신호 2 돌연변이를 포함하는 헬퍼 플라스미드를 제조 할 수 리포터 플라스미드 모두 HBV 단백질을 나타낸다. E : 이입 신호. (B) 기자 플라스미드, 헬퍼 플라스미드는 pUC 플라스미드는 에코 RI 및 DIII로 소화했다. 이러한 분해 플라스미드 겔 전기 영동 하였다.광고 / 54849 / 54849fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 재조합 B 형 간염 바이러스는 인 HepG2 NTCP을 표현 감염. (A)는 NTCP을 표현하는 안정적인 세포주 3 주 동안 G418의 500 μg의 / ㎖와 선택에 의해 다음 Myc와-태그 NTCP 코딩하는 플라스미드 인 HepG2 세포의 형질 전환에 의해 설립되었습니다. (: 1000 희석 1) 인 HepG2 세포에서 NTCP-Myc와의 레벨이 안정적 NTCP (인 HepG2-NTCP-Myc와 clone22 -) 세포를 발현하는 안티 나 Myc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 결정 하였다. (B) 인 HepG2-NTCP-Myc와-clone22 세포를 2 % DMSO 및 4 % PEG8000의 존재하에 재조합 HBV 감염시켰다. 감염 후 72 시간에서, 리포터 활성의 수준은 리포터 분석법으로 측정 하였다. 결과는 3 개의 독립적 인 실험을 대표하고, 오차 막대를 표시 번째수단 즉 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 재조합 B 형 간염의 시간 코스. (A) 인 HepG2-NTCP-Myc와-clone22 세포를 2 % DMSO 및 4 % PEG8000의 존재하에 재조합 HBV 감염시켰다. HBV 감염의 수준은 감염 후 3, 6 또는 9 일째 리포터 활성 (검은 선)에 의해 측정 하였다. HBV RNA (청색 선)와 DNA (오렌지 라인)의 레벨이 동시에 각각의 감염 시점에서, RT-PCR 및 PCR (15) 각각에 의해 측정 하였다. (B) PHH 접종 유로키나제 형 플라스 미노 겐 활성 인자 유전자 / SCID 마우스에서 분리 상기 presenc 재조합 HBV에 감염된 차 인간 간세포 (PHH)2 % DMSO 4 % PEG8000의 전자. HBV 감염의 수준은 감염 후 3, 6, 9 일째 리포터 활성을 결정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 재조합 B 형 간염에 알려진 항 HBV 제의 효과. 인 HepG2-NTCP-Myc와-22 세포를 재조합 HBIG, 지시 된 투여 량으로 헤파린 및 IFN-β의 존재하에 HBV뿐만 아니라, 2 % DMSO 및 4 % PEG8000으로 감염시켰다. HBV 복제 (A)와 세포 생존율 (B)의 레벨은 6일 감염 후 리포터 활성을 결정 하였다. HBIG는 HBV 감염을 중화 및 헤파린은 싸여 바이러스 억제제 인 항체이다. 결과는 3 개의 독립적 인 실험을하고, 오차 막대 대표 수단의 표준 편차를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : HBV 수명주기의 도식. HBV는 NTCP를 포함하여 바이러스 수용체를 통해 세포에 들어갑니다. 캡시드 관련 편안 원형 DNA (rcDNA)는 코팅과 핵에 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA)에 변환됩니다. mRNA의 전사를위한 템플릿으로 cccDNA 기능. 게놈 RNA는 코어와 폴에 대한 단백질과 조합하여 바이러스 캡시드에 encapsidated된다. 상기 HBS 단백질과 조립 전에 캡시드는 프로세스 HBV의 DNA 증폭에 관여는 cccDNA 복제 처리를했다. HBS 단백질 조립 바이러스 입자가 최종적으로 세포 외부 방출된다.톰 / 파일 / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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B 형 간염 게놈 코어, 폴리머, 표면 및 X의 ORF (그림 1) 등 4 차 오픈 리딩 프레임 (ORF를)가 있습니다. 이 네 HBV 개의 ORF의 전사가 단단히 네 프로모터에 의해 조절된다 다음 precore / 핵심 프로모터 인핸서 II를 포함, S1 프로모터, S2 프로모터 및 X 프로모터 인핸서 (18) I를 포함. 3.5 킬로바이트 및 3.4 킬로바이트의 mRNA는 각각 PreCore 및 핵심 단백질로 번역된다. 큰 봉투 단백질 (L)의 가장 큰 subgenomic mRNA를 (2.5 킬로바이트)에서 생산되며, 중간 (M) 작은 표면 단백질 (S)는 짧은 성적 증명서 (2.1 킬로바이트)로 변환됩니다. 0.8 킬로바이트 성적 증명서는 X 단백질 19, 20의 번역을위한 템플릿입니다. pregenomic RNA의 5 '및 3'말단이 직접 반복 1 (DR1), DR2 및 포장 신호 (21), (22)을 포함 여러 기능 시스 요소를 포함. 이러한 기능 요소는 pregenomic RNA에 리포터 또는 마커 유전자의 삽입을 제한한다. 우리는 두 벡터의 리포터 유전자 및 헬퍼 벡터를 포함하는 전사 벡터의 트랜스 보완을 사용하여 재조합 HBV를 구축 하였다. 전송 벡터는 리포터 유전자 (도 2)와 코어와 POL 영역의 대체에 의해 제조 하였다.

NTCP는 HBV 항목 (10)에 대한 세포 수용체로 확인되었다. NTCP의 mRNA의 발현이 HBV 감염에 민감하지 않은 인 HepG2 세포에서 매우 낮기 때문에, 우리는 NTCP-myc의 (도 3a)를 발현하는 안정한 인 HepG2 세포주를 확립. 인 HepG2 세포의 재조합 HBV 감염이 더 리포터 활성을 나타내지 않았다 반면 인 HepG2 세포에서 NTCP 발현 재조합 HBV 감염 (도 3B)에 대한 감수성을 부여. 재조합 HBV 감염 시간 경과 분석 리포터 활성 및 HBV RNA 모두 거라고되었음을 입증재조합 B 형 간염 3 일 이내에 etectable 9 일 postinfection에 뾰족; 그러나, 증가 된 HBV DNA의 수준 (도 4)이 관찰되지 않았다. 이러한 HBIG 또는 헤파린, 억제 재조합 B 형 간염 (그림 5)와 같은 항목 억제제. 이 시스템을 나타내는 이들 결과는 초기에 전사 바이러스 엔트리 스테이지 HBV 복제가 아닌 DNA 복제 및 감염된 세포로부터 방출 바이러스 재감염 (도 6)를 모니터링하는데 사용될 수있다.

리포터 단백질들은 PBS로 바이러스 감염 세포를 세척하는 재조합 HBV 분획을 오염 때문에 3 배 이상 높은 백그라운드에서 발생할 수있다. 따라서, 재조합 바이러스로 치료 HBV-민감하지 못한 HepG2 세포로부터 배지에서 리포터 활성을 측정함으로써 백그라운드 레벨을 확인하는 것이 중요하다. 배경이 높은 경우는, 세척 단계 (3 회 96- 웰 플레이트에 웰 당 300 ㎕의 PBS로 세척) 하루 BEF 추가광석은 3.1 단계.

재조합 HBV의 생산이 낮은 경우 등을 DsRed 또는 GFP 같은 형광 단백질을 발현하는 제어 플라스미드 형질 감염 효율을 확인한다. 일반적으로, 인 HepG2 세포의 형질 전환 효율은 35 % 이상이어야한다. 형질 감염 효율이 낮은 경우, 높은 형질 전환 효율을 달성하기 위해 특정 형질 조건을 최적화한다. 형질 감염 효율이 높은 경우, 감염성 재조합 HBV 1 차 인간 간세포를 감염을 사용하여 제조되어 있는지 여부를 확인한다. 기본 인간의 간세포에 HBV의 감염은 NTCP를 발현하는 간암 세포주보다 일반적으로 높다. 재조합 HBV의 효율적인 감염 1 차 인간 간세포에서 달성되는 경우, 문제는 재조합 HBV 아니지만 세포에 감염된다. NTCP을 표현 안정적 인 HepG2 클론의 번호를 설정하고 전염성이 높은 세포 클론을 선택합니다. 감염시 배양 낮은 세포 생장이 불량 내가 될 수도nfectivity. 배양 세포의 수가 증가하면 감염의 효율을 향상시킨다. HBV 감염, 감염시 NTCP 표현 인 HepG2 세포 80-95%의 생장 높은 감염율을 제공한다.

여러 리포터 HBVs의 개발은 많은 그룹 (11), (12, 13)에 의해보고하지만, 이러한 리포터 HBVs 대부분 열악한 생산성을 보여왔다. 더욱이, 감염된 세포에서 리포터 활성이 높게되지 않고, 높은 처리량 분석법을 이용하여 항 HBV 제제를 스크리닝 사용하기 어렵다. 반면에, 우리의 리포터 HBV 시스템은 지금까지보고 된 다른 리포터 바이러스에 비해 바이러스 비교적 소량을 사용하여 항 HBV 에이전트에 대한 질량을 조회로 쉽게 감염된 세포에서 강한 리포터 신호를 생성한다.

여기에서는 초기 단계를 모니터하는 신규 HBV 리포터 시스템을 생성B 형 간염의 복제 사이클이 감염 후 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 확인 하였다. 설명 된 방법은 간단 신속하고 비용 효율적인 HBV 벡터 시스템이며, 하이 스루풋 스크리닝 방법을 사용하여 HBV 호스트 요인뿐만 아니라, 항 HBV 화합물의 동정에 유용 할 것이다. 사실, 우리는 전체 게놈의 RNAi 기술 (15)에 의해 HBV 호스트 요인 및 안티 HBV 유전자를 확인했다. 재조합 HBV는 기능적 코어 POL의 제조 결핍 때문에 참고로,이 시스템은, 예컨대 DNA 복제 단계 캡시드와 바이러스 어셈블리 및 신진로서 HBV 복제의 말기의 평가에는 적합하지 않다. 재조합 HBV의 추가 개발은 전체 HBV 기간을 평가하기 위해 필요하다.

요약하면,이 시스템은 리포터 활성을 측정하여 HBV 감염을 평가할 수있다. 따라서, PCR, RT-PCR 등의 복잡한 분석 기법을 수행 할 필요가없고,HBV 코어 또는 S 항원 ELISA는 HBV 감염 / 복제를 평가합니다. 이 리포터 HBV 복제 무능 때문에 마지막으로, 감염의 위험이 없다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

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References

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B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기
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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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