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Immunology and Infection

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

Introduction

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A infecção crónica pelo vírus da hepatite B (HBV) é um fator de risco para doenças hepáticas crônicas 1. Embora as estratégias terapêuticas correntes baseiam-se em análogos de nucleótidos que inibem a função de HBV pol e / ou a administração de interferão do tipo I que activa as respostas imunitárias em indivíduos infectados, bem como a proliferação de HBV indirectamente supressão através de funções de genes estimulados com interferão 2, estes tratamentos não pode eliminar o HBV DNA completamente 3. Além disso, o aparecimento de HBVs que são resistentes aos agentes anti-Pol é de preocupação 4. A administração de agentes anti-virais que visam directamente combinadas as diferentes etapas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou ciclo de vida do virus da hepatite C (HCV), foi mostrado para suprimir ou erradicar o vírus (es) com êxito. Semelhante a esta ideia, o desenvolvimento de um agente anti-HBV (s) que actuam directamente sobre as diferentes fases do Hciclo de vida BV é importante para o estabelecimento de futuras terapias HBV.

Em geral, o estabelecimento de uma simples no sistema de cultura in vitro do vírus alvo facilita o desenvolvimento de agentes anti-vírus. No entanto, existem pelo menos duas barreiras ao desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro para rastrear agentes anti-HBV. O primeiro é a falta de um sistema in vitro de cultura de células conveniente para HBV infecção / proliferação. Ao contrário de outros vírus, tais como HIV e HCV, que são propagadas em linhas celulares estabelecidas, é difícil de cultivar in vitro de HBV devido a limitações experimentais, incluindo uma gama de hospedeiros estreita. A utilização de sistemas de cultura de células específicas, tais como a linha celular de hepatoma humano HepaRG, que é susceptível a infecção por HBV, 5, 6, 7 ter sido desenvolvido para superar estes problemas. Além disso, as células PXB, isoladas de uroquinase-type do ativador do plasminogênio transgênico / SCID inoculados com hepatócitos humanos primários (PHH), mostraram-se suscetíveis à infecção por HBV e replicação 8. No entanto, os níveis de replicação de HBV em HepaRG são dependentes do estado de diferenciação celular após a cultura, o que pode causar resultados inconsistentes e reprodutíveis de níveis de infecção / replicação de HBV. PXB é comumente utilizado nas experiências de infecção por HBV, mas é limitado pela sua disponibilidade. A linha de células de expressão HBV inducible tetraciclina, HepAD38, também tem sido amplamente utilizado para estudar a replicação do VHB, mas este sistema só permite uma avaliação após a transcrição e não na etapa de entrada da infecção por HBV 9. Recentemente, a identificação do polipéptido cotransporting taurocolato de sódio (NTCP) como um receptor funcional para VHB tem permitido o desenvolvimento de um sistema de cultura de HBV variável 10. Na verdade, a expressão PNCT em células de hepatocarcinoma não sensíveis, tais como Huh7 eHepG2 permite a infecção por HBV 10 e assim, a escolha de linhas de células susceptíveis de HBV foi expandido, resolver muitas das limitações experimentais. O segundo problema é a falta de um sistema de ensaio simples para avaliar a infecção por HBV e replicação. A avaliação da infecção por HBV é geralmente realizada por meio da análise HBV DNA, RNA e proteínas. No entanto, a quantificação destes marcadores vírus é demorado, dispendioso e muitas vezes nem sempre simples. Por conseguinte, o desenvolvimento de um sistema de ensaio simples, tais como a utilização de um gene repórter, pode superar os problemas associados com sistemas de ensaio de HBV.

No entanto, porque o tamanho do genoma que pode ser empacotado numa cápside de HBV é limitado - menos de 3,7 kb 11 - o tamanho de um gene repórter deverá ser tão curto quanto possível. Além disso, a presença de vários elementos cis espalhados ao longo do genoma, que são essenciais para a replicação virai, limita as posições disponíveis em serção do gene repórter no genoma. Vários relatórios têm tentado inserir genes estranhos, incluindo o HIV-1 Tat, proteína fluorescente verde, e DsRed, no genoma de HBV 11, 12, 13. No entanto, estes HBVs recombinantes não são úteis para o rastreio da infecção por HBV / replicação, ou para o rastreio de alto rendimento de factores que afectam a infecção por HBV / replicação. Isto é principalmente devido à baixa produtividade de vírus recombinantes e a intensidade reduzida da expressão do gene repórter causada pela produção de vírus ineficiente.

Para superar estes problemas, foi construída uma VHB repórter com um elevado rendimento de produção de vírus. Este vírus é altamente sensível para monitorizar as fases iniciais do ciclo de replicação de HBV, a partir da entrada para a transcrição. Para alcançar este objectivo, NanoLuc (NL) foi escolhida como um gene marcador, porque ele é um pequeno (171 ácidos aminados) por engenharia repórter luminescenteclass = "xref"> 14. Além disso, a NL é aproximadamente 150 vezes mais brilhante do que de pirilampo ou de Renilla luciferase, e a reacção luminescente é independente de ATP, o que sugere que a taxa de acerto falsa será baixo para rastreio de alto rendimento. A eficiência de produção do HBV recombinante é de aproximadamente 1/5 do progenitor de HBV, e semelhante para os níveis relatados por vírus recombinantes de HBV anteriores; No entanto, o brilho da NL supera os problemas de produtividade de vírus para que ele possa ser utilizado para o rastreio em massa de agentes anti-HBV.

Rastreio de agentes anti-HBV, utilizando hepatócitos primários, HepaRG, HepAD38 e hepatócitos NTCP-transduzidas pode ser útil para o rastreio de agentes anti-HBV pelo método convencional (s). No entanto, o sistema descrito aqui tem várias vantagens, tais como manuseio simples, de alta sensibilidade e baixo custo para triagem. Estas vantagens são adequadas para ensaios de alto rendimento para identificar e desenvolver novos agentes de HBV para fins terapêuticos.

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Protocol

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1. Produção de recombinante de HBV codifica a proteína repórter

  1. Preparação de células HepG2
    1. Prepare meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 100 U / ml de aminoácidos não essenciais).
    2. A placa 4 x 10 6 células HepG2 em um prato revestido com colagénio de 10 cm em 10 ml de meio de cultura no dia antes da transfecção. Incubar as células HepG2, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 incubadora.
      NOTA: Quando cerca de 4 x 10 6 células HepG2 foram semeadas numa placa revestida de colagénio de 10 cm de 10 ml de meio de cultura, eles vão ser de 70-90% confluentes no dia seguinte.
  2. transfecção
    1. Transfectar células HepG2 com 5 ug de pUC1.2HBV epsilon delta 15 e 5 ug de pUC1.2HBV / NL 15 utilizando uma transfecçãoreagente de acordo com as instruções do fabricante.
    2. No dia seguinte, remover o meio de cultura e adicionar 10 ml de meio de cultura fresco.
    3. Uma semana após transfecção, a transferência do meio de cultura contendo o VHB recombinante para um tubo de 50 ml, e prosseguir para o passo 1.3.1. Adicionam-se 10 ml de meio de cultura fresco para a placa contendo as células transfectadas.
      Nota: A produção do HBV recombinante é mantida durante 4 semanas. O meio de cultura contendo VHB recombinante pode ser armazenado a 4 ° C durante 1 mês.
  3. A purificação do HBV recombinante
    1. Remover os detritos celulares a partir do meio de cultura contendo VHB recombinante por centrifugação (2300 xg durante 5 min).
    2. Passar o sobrenadante através de um filtro de membrana de 0,45 um.
    3. Adicionar um volume igual de 26% de PEG / NaCl 1,5 M (polietileno glicol 6000: 130 g, de NaCl, 49 g, 1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 e 5 ml de HEPES 1 M pH 7,6 em 500 ml) ao meio de cultura contendo recombinanteHBV e misture delicadamente. Incubar durante a noite a 4 ° C.
    4. Centrifugar a 2.300 xg durante 20 min a 4 ° C.
    5. Descartar o sobrenadante e dissolve-se o sedimento em 0,5 ml de TNE (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
    6. Remover os detritos por centrifugação a 2300 xg durante 5 min.
    7. Carregar 0,5 ml de TNE contendo VHB recombinante em 0,8 ml de sacarose a 20% em TNE.
    8. Centrifugar a 100000 × g durante 3 horas a 15 ° C.
    9. Descarte tanto do sobrenadante quanto possível, e guardar o sedimento. Ressuspender-lo em 1 ml de DMEM isento de soro por 40 ml de meio de cultura de partida.
    10. Incubar durante a noite a 4 ° C.
    11. Filtrar através de um filtro de 0,45 um. Preparar alíquotas de 0,5 ml e armazenar a -80 ° C.
      NOTA: Se se observa a contaminação de proteínas repórter da amostra de vírus original, purificar o vírus por gradiente de densidade ultra-centrifugação de 5-30% de sacarose em TNE a 100.000 xg durante 2 h, ou centrifugação de densidade de CsCl equilibrada from 1,1-1,6 g / ml a 150.000 xg durante 50 horas.

2. A infecção de VHB recombinante

  1. As células HepG2 cultura que expressam estavelmente NTCP (HepG2 / NTCP) 15 que são susceptíveis a infecção por HBV em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 250 ug / mL de G-418 e 100 U / ml aminoácidos não essenciais a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 incubadora.
  2. Um dia antes da infecção, placas de aproximadamente 5 x 10 4 HepG2 / células NTCP 14 para uma placa de 96 poços revestidos de colagénio em 0,1 ml de meio de cultura.
  3. HBV recombinante Thaw em um banho de água C 37 ° até que haja um pequeno pedaço de gelo restante no frasco.
  4. Prepara-se o meio de infecção por combinação dos seguintes: 10 ul de 40% PEG8000 em 1x tampão fosfato salino (PBS), 2 uL de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 10 uL de HBV recombinante e 78 ul de meio de cultura frescopor poço de uma placa de 96 poços.
  5. Adicionar 100 ul de solução de HBV recombinante a um poço da placa de 96 poços.
  6. Um dia após a infecção, as células infectadas lavar 3 vezes com 300 ul de PBS por cavidade para remover a proteína repórter contaminante a partir da fracção de vírus.
  7. Incubar as células infectadas em 200 ul de meio de cultura contendo 2% de DMSO, durante uma semana ou menos.

3. Análise

  1. Uma semana após a infecção, as células infectadas lavar 3 vezes com PBS.
  2. Adicionar 50 ul de tampão de lise de células infectadas.
  3. Rocha da placa de cultura durante 5 minutos, e depois centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
  4. Adicionar 50 ul de substrato repórter na placa de luminómetro.
  5. Adicionar 20 ul de lisado de células para uma placa de luminómetro contendo o substrato de repórter. Misture em vortex brevemente.
  6. Coloque a placa no luminómetro e iniciar a leitura 15.

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Representative Results

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A Figura 1 mostra uma representação esquemática do genoma de HBV, ARN transcritos, proteínas do vírus e a sua região de codificação no genoma. O gene repórter e sua localização no genoma são também indicados. A Figura 2 mostra o plasmídeo repórter e auxiliar plasmídeo VHB que contém o gene repórter. O repórter pUC1.2HBV / NL, foi construído por exclusão posições de nucleótidos 223-811 do local de iniciação da transcrição do ARNm de preCore de pUC1.2HBV 16 e, em seguida, inserir o gene repórter. O pUC1.2HBVdelta com mutações pontuais na sequência de sinal de encapsidação foi gerado por mutagénese dirigida ao local por PCR. Plasmídeo repórter (pUC1.2HBV / NL) e o plasmídeo ajudante (pUC1.2HBVdelta) foram digeridos com HindIII e EcoRI, e em seguida, submetidos a electroforese em gel. As bandas esperadas, que são 3,0 kb para o plasmídeo pUC e 3,5 kb para 1.2HBV / NL ou 1.2HBVdelta, são mostrados na Fig2B ure. A Figura 3 mostra células HepG2 expressando PNCT infectado com HBV recombinante. Para estabelecer as células HepG2 expressam estavelmente NTCP, células HepG2 foram transfectadas com codificação PCAN-NTCP-myc NTCP-myc e um gene resistente à neomicina. Os clones de células resistentes a G418 foram seleccionados e expandidos. O HepG2-NTCP-myc-clone22 é susceptível a infecção por HBV. Os lisados ​​de células HepG2 ou HepG2-NTCP-myc-clone22 foram submetidas a transferência de Western. NTCP é uma glicoproteína de 349 aminoácidos, com um N-terminal extracelular contendo dois sítios de glicosilação ligados a N (Asn5 e Asn11). A banda de 43 kDa de NTCP não glicosilada e a banda de 65 kDa glicosilado 10 são mostrados na Figura 3A. As células HepG2-PNCT-myc-clone22 expressando PNCT, mas não as células HepG2, foram sensíveis à infecção por HBV recombinante. A Figura 4 mostra a cinética do gene repórter (A e B), vírus de ARN e ADN (a) em HepG2-NTCP-myc clone infectadas com VHB recombinante22 células de hepatócitos humanos primários (PHH) (B) (A) ou. Os níveis de ARN de HBV e a actividade repórter foram elevados em 3 dias após a infecção em células HepG2 PHH-NTCP-myc-clone22 ou. Em contraste, não houve alteração nos níveis de ADN em 9 dias após a infecção de HBV recombinante porque é deficiente para o núcleo funcional e pol que têm um papel importante na via de replicação do DNA intracelular. A Figura 5 mostra a inibição de HBV recombinante por hepatite B globulina imune (IGHAHB), heparina e IFN-β. inibidores de entrada tais como heparina e IGHAHB suprimiu fortemente a actividade repórter pelo menos de 10%, a 75 U / ml e 150 U / ml, respectivamente, enquanto o IFN-β suprimiu a actividade repórter pelo menos de 50% em 1000 U / ml. O efeito inibidor destes inibidores foi dependente da dose. A Figura 6 mostra o ciclo de vida do HBV.

figura 1
Fi figura 1: Representação esquemática do genoma do HBV e localização relativa de ARN do vírus e as proteínas do genoma. ADN de HBV é mostrado por um arco em preto. A localização do intensificador e promotores para a transcrição de ARN de vírus sobre o arco é mostrado em amarelo. A localização dos ARNs virais e proteínas no genoma são representados por setas com linhas pontilhadas azuis (ARN) e com setas coloridas (proteínas), respectivamente. ARN de vírus são discriminados por tamanho: 3,5 kb e 3,4 kb ARNm indicam preCore / C e ARN pregenómico / núcleo, respectivamente, 2,5 e 2,1 kb RNAs representam preS 1 e pré-S2 / S, respectivamente, e o ARN de 0,8 kb do gene X indica 17. Um gene repórter é substituído pelo correspondente tamanho da sequência de codificação núcleo. O gene repórter é conduzido por um promotor-núcleo contendo potenciador II. Pro: Promotor, EnhI / pro: Enhancer I / promotor, EnhII / Pro: EnhancerII / promotor, Pol: Polymerase, S: antígeno de superfície. target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Diagrama esquemático para a geração de HBV recombinante. (A) As linhas azuis indicam a RNA pregenome. O "A" representa alongamento poli A na extremidade 3 '. As caixas azuis indicam a região de codificação de proteína para cada vírus. A caixa vermelha indica um gene repórter traduzido do seu próprio codão de iniciação. O plasmídeo repórter não pode produzir preCore e Pol, e o plasmídeo ajudante contendo 2 mutações no sinal de encapsidação (CTGTGCC para CTATGTC) expressa todas as proteínas de HBV. E: sinal de encapsidação. (B) O plasmídeo repórter, o plasmídeo ajudante e o plasmídeo pUC foram digeridos com EcoRI e HindIII. Estes plasmídeos digeridos foram submetidos a electroforese em gel.ad / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: HBV recombinante infecta HepG2 expressar PNCT. (A) Uma linha celular estável expressando NTCP foi estabelecido por transfecção de células HepG2 com um plasmídeo que codifica marcada com myc NTCP seguido de selecção com 500 ug / ml de G418 durante 3 semanas. O nível de NTCP-Myc em células HepG2 que expressam estavelmente células NTCP (HepG2-NTCP-Myc-clone22) foi determinada por transferência de Western utilizando anticorpos anti-Myc (diluição 1: 1000). (B) As células HepG2-NTCP-Myc-clone22 foram infectados com VHB recombinante na presença de DMSO a 2% e 4% PEG8000. Em 72 horas após a infecção, o nível de actividade repórter foi determinada por ensaio de repórter. Os resultados são representativos de três experiências independentes e as barras de erro mostram the desvios-padrão dos meios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Curso de tempo da infecção por HBV recombinante. (A) células HepG2-NTCP-Myc-clone22 foram infectados com VHB recombinante na presença de DMSO a 2% e 4% PEG8000. O nível de infecção por VHB foi determinada pela actividade repórter (linha preta) em 3, 6 ou 9 dias após a infecção. Os níveis de ARN de HBV (linha azul) e ADN (linha laranja) foram simultaneamente medido por RT-PCR e PCR de 15, respectivamente, em cada ponto de tempo de infecção. (B) os hepatócitos primários humanos (PHH), isolado a partir de tipo urocinase do activador do plasminogénio transgénicos / SCID inoculados com PHH, foram infectados com VHB recombinante na presence de 2% de DMSO e 4% PEG8000. O nível de infecção pelo HBV foi determinada pela actividade repórter em 3, 6 ou 9 dias após a infecção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Efeito de conhecidos agentes anti-HBV em infecção de HBV recombinante. As células HepG2-NTCP-Myc-22 foram infectadas com VHB recombinante na presença de IGHAHB, heparina e IFN-β nas doses indicadas, bem como DMSO a 2% e 4% PEG8000. O nível de replicação de HBV (A) e a viabilidade celular (B) foi determinada pela actividade repórter 6 dias após a infecção. IGHAHB é um anticorpo que neutraliza a infecção por HBV e a heparina é um inibidor de vírus com envelope. Os resultados são representativos de três experiências independentes e as barras de erro mostrar os desvios-padrão dos meios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Representação esquemática do ciclo de vida do HBV. VHB entra nas células através de receptores de vírus incluindo NTCP. -Cápside associada ADN circular relaxado (rcDNA) é não revestido e convertido em DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) no núcleo. cccDNA funções como um modelo para a transcrição de mRNA. O ARN genómico é encapsidado com o capsídeo do vírus através da montagem com proteínas de núcleo e pol. Antes de montar mais proteínas com HBS, a cápside está envolvida na amplificação do ADN do VHB por um processo chamado de processo de replicação cccDNA. partículas de vírus reunidos com proteínas HBS, eventualmente são libertados fora da célula.om / files / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O genoma do VHB tem quatro primários grelhas de leitura abertas (ORFs), incluindo o núcleo, polimerase, de superfície e X ORFs (Figura 1). A transcrição destes quatro HBV ORF é estreitamente regulada por quatro promotores: o promotor pré-core / core contendo potenciador II, promotor S1, S2 promotor e X promotor contendo potenciador I 18. Os mRNAs 3,5 kb e 3,4 kb são traduzidos em proteínas Precore e Core, respectivamente. O grande proteína envelope (L) é produzido a partir da maior mRNA subgen�ica (2,5 kb) e no meio (M) e proteínas de superfície pequenas (S) são convertidas da transcrição mais curto (2,1 kb). A transcrição de 0,8 kb é o modelo para a tradução da proteína X 19, 20. Os 5'e 3'extremidades do RNA pregenômica conter vários elementos cis funcionais que incluem repetição directa 1 (DR1), DR2 e um sinal de empacotamento 21, 22. Estes elementos funcionais limitar a inserção de genes repórter ou marcador para o ARN pregenómico. Construiu-HBV recombinante, utilizando trans-complementação de dois vectores, um vector de transferência contendo o gene repórter e um vector auxiliar. O vector de transferência foi construído através da substituição das regiões do núcleo e pol com o gene repórter (Figura 2).

NTCP foi identificado como um receptor celular para a entrada 10 do HBV. Uma vez que a expressão de ARNm NTCP é muito baixa em células HepG2, que não são susceptíveis à infecção por HBV, foi estabelecida uma linha celular HepG2 estável expressando NTCP-myc (Figura 3A). Considerando que a infecção por HBV recombinante de células HepG2 não revelou nenhuma actividade repórter, NTCP expressão em células HepG2 conferiu susceptibilidade a infecção por HBV recombinante (Figura 3B). A análise de curso de tempo da infecção por HBV recombinante demonstrou que tanto a actividade repórter e HBV foram ARN detectable dentro de 3 dias de infecção por HBV recombinante e atingiu um pico de 9 dias após a infecção; No entanto, os níveis de ADN de HBV aumento não foi observado (Figura 4). Inibidores de entrada, tais como a heparina ou IGHAHB, inibiu a infecção por HBV recombinante (Figura 5). Estes resultados indicaram que este sistema pode ser utilizado para monitorizar a replicação início do estágio de HBV a partir da entrada do vírus para a transcrição, mas não a replicação do ADN e a re-infecção de vírus libertado a partir de células infectadas (Figura 6).

Uma vez que a proteína repórter frequentemente contamina a fracção de HBV recombinante, lavando as células infectadas pelo vírus com PBS três vezes menos do que pode resultar num fundo elevado. Portanto, é importante para verificar o nível de fundo por medição da actividade repórter em meio de células HepG2-HBV insusceptíveis tratados com o vírus recombinante. Se o fundo é alta, adicionar um passo de lavagem (3 vezes a lavagem com 300 ul de PBS por poço numa placa de 96 poços) a dia BEFminério passo 3.1.

Se a produção do HBV recombinante é baixo, verificar a eficiência da transfecção com um plasmídeo de controlo que expressa uma proteína fluorescente, tal como GFP ou DsRed. Em geral, a eficiência de transfecção de células HepG2 deve ser maior do que 35%. Se a eficiência de transfecção é baixo, otimizar as condições de transfecção específicas para alcançar altas eficiências de transfecção. Se a eficiência de transfecção é elevado, verifique se HBV recombinante infeccioso é produzido usando-o para infectar hepatócitos primários humanos. Infectividade do HBV aos hepatócitos primários humanos é geralmente mais elevada do que para linhas de células de hepatoma expressando PNCT. Se a infecção eficiente de VHB recombinante é obtida em hepatócitos humanos primários, o problema não é a de HBV recombinante, mas as células a serem infectadas. Estabelecer uma série de clones HepG2 estáveis ​​expressando PNCT e selecione clones celulares altamente infecciosas. confluência celular baixo na cultura, no momento da infecção pode resultar em mau infectivity. O aumento do número de células na cultura melhora a eficiência de infecção. Para a infecção por HBV, 80-95% de confluência de células HepG2 que exprimem NTCP no momento da infecção proporciona uma alta taxa de infecção.

O desenvolvimento de vários HBVs repórter foi relatado por muitos grupos 11, 12, 13, mas a maioria desses HBVs repórter mostrar fraca produtividade. Além disso, a actividade repórter nas células infectadas não é tão elevada, e seria difícil de utilizar para rastreio de agentes anti-HBV utilizando um ensaio de elevado débito. Em contraste, o nosso sistema repórter de HBV produz um sinal repórter forte nas células infectadas que faz com que seja fácil de conduzir um rastreio em massa de agentes anti-HBV, utilizando uma quantidade relativamente pequena do vírus em comparação com outros vírus repórter relatadas até agora.

Aqui, nós geramos um sistema repórter VHB novo para monitorar as fases iniciais deo ciclo de replicação de HBV e este foi validado através da medição da actividade da proteína repórter após a infecção. O método descrito é um sistema de HBV vector simples, rápida, eficaz e de custo e será útil para a identificação de factores do hospedeiro do HBV, bem como compostos anti-HBV, utilizando métodos de rastreio de alto rendimento. Na verdade, foram identificados fatores do hospedeiro HBV e genes anti-HBV por todo o genoma tecnologia RNAi 15. De notar que este sistema não é apropriado para a avaliação das fases tardias da replicação de HBV, tais como o passo de replicação do ADN, da cápside, e o conjunto de vírus, e brotamento, porque VHB recombinante é deficiente para a produção de um núcleo funcional e pol. O desenvolvimento do HBV recombinante é necessária para avaliar todo o ciclo de vida do HBV.

Em resumo, este sistema pode ser usado para avaliar a infecção de HBV medindo a actividade repórter. Portanto, não há necessidade de realizar as técnicas de ensaio complicados, tais como PCR, RT-PCR,Núcleo HBV ou antigénio S de ELISA para avaliar a infecção por HBV / replicação. Por último, porque este VHB repórter é incompetente de replicação, não há risco de infecção.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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