Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Здесь мы опишем недавно разработанный вирус гепатита В (HBV) системы репортер контролировать ранние стадии жизненного цикла вируса гепатита. Эта упрощенная в пробирке системы поможет в скрининга агентов против HBV с использованием стратегии высокой пропускной способностью .

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хроническая инфекция с вирусом гепатита В (HBV) является одним из основных факторов риска развития хронических заболеваний печени 1. Хотя современные терапевтические стратегии основаны на нуклеотидных аналогов , которые ингибируют ВГВ функцию Pol и / или введение типа интерферона , который активирует иммунные реакции у инфицированных лиц, а также косвенно подавляя пролиферацию HBV посредством функций гена интерферона-стимулированной 2, эти процедуры не могут устранить HBV ДНК полностью 3. Кроме того, появление HBVs, устойчивых к анти-POL агентов вызывает беспокойство 4. Введение комбинированных анти-вирусных агентов, непосредственно ориентированных на различные этапы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С (HCV) жизненного цикла было показано, чтобы успешно подавлять или уничтожать вирус (ы). Подобно этой идее, развитие анти-HBV агента (агентов), которые действуют непосредственно на различных этапах HBV жизненного цикла имеет важное значение для создания будущих методов лечения HBV.

В общем, создание простой в пробирке системы культуры целевого вируса способствует развитию антивирусных агентов. Тем не менее, есть по крайней мере два препятствия для развития в пробирке систем культивирования для скрининга агентов против HBV. Первым из них является отсутствие удобной системы культивирования клеток в пробирке для HBV - инфекции / пролиферации. В отличие от других вирусов, таких как ВИЧ и ВГС, которые распространяются в установленных клеточных линий, что трудно культивировать HBV в пробирке из - за ограничений , в том числе экспериментальных узком диапазоне хозяина. Использование специфических систем клеточных культур , таких , как клеточной линии гепатомы человека HepaRG, который восприимчив к инфекции HBV, 5, 6, 7, были разработаны для преодоления этих проблем. Кроме того, PXB клетки, выделенные из урокиназы-тире активатор плазминогена трансгенный / SCID мышей , привитых первичных человеческих гепатоцитов (ФН), как было показано, быть восприимчивы к инфекции ВГВ и репликации 8. Однако уровни репликации HBV в HepaRG зависят от состояния клеточной дифференцировки после культуры, что может привести к несогласованным и невоспроизводимые результаты уровней инфекции / репликации HBV. PXB обычно используется для экспериментов инфекции HBV, но ограничивается его доступностью. Тетрациклин индуцибельная HBV линии экспрессии в клетках, HepAD38, также широко используется для изучения репликации HBV, но эта система позволяет только оценку после транскрипции , а не на этапе входа HBV - инфекции 9. В последнее время идентификация натрия таурохолат cotransporting полипептида (НПБТ) в качестве функционального рецептора для ВГВ позволило разработать системы 10 культуры переменная HBV. Действительно, выражение НПБТ в нечувствительных гепатокарциномы клетках, таких как HuH7 иHepG2 позволяет инфекции ВГВ 10 и , таким образом, выбор чувствительных клеточных линий HBV была расширена, решение многих экспериментальных ограничений. Вторая проблема заключается в отсутствии простой тест-системы для оценки HBV-инфекции и репликации. Оценка HBV-инфекции обычно проводится путем анализа ДНК HBV, РНК и белков. Тем не менее, количественное определение этих вирусных маркеров отнимает много времени, часто дорого и не всегда просто. Таким образом, разработка простой системы анализа, например, с использованием ген-репортер, возможно, преодолеть проблемы, связанные с системами ВГВ анализа.

Тем не менее, так как размер генома , которые могут быть упакованы в HBV капсида ограничено - менее 3,7 кб 11 - размер гена - репортера должен быть как можно короче. Кроме того, наличие нескольких цис-элементов, рассеянных по всему геному, которые необходимы для репликации вируса, ограничивает позиции, доступные для в высказанное гена-репортера в геном. Несколько сообщений пытались ввести чужеродные гены, в том числе ВИЧ-1 Tat, зеленый флуоресцентный белок, и DsRed, в геноме HBV 11, 12, 13. Тем не менее, эти рекомбинантные HBVs не являются полезными для скрининга HBV-инфекции / репликации, или для высокопроизводительного скрининга факторов, влияющих на HBV-инфекции / репликации. Это происходит главным образом из-за низкой производительности рекомбинантных вирусов и пониженной интенсивности экспрессии репортерного гена, вызванного неэффективного производства вируса.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы сконструировали репортер HBV с высоким выходом продукции вируса. Этот вирус очень чувствителен для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации HBV, от входа в транскрипции. Для достижения этой цели, NanoLuc (NL) был выбран в качестве гена-маркера, потому что это небольшой (171 аминокислот) инженерии люминесцентный репортеркласс = "Xref"> 14. Кроме того, NL примерно 150 раз ярче, чем светлячков или Renilla люциферазы, и реакция люминесцентный является АТФ-независимым, предполагая, что частота ложных хит будет низкой для высокопроизводительного скрининга. Эффективность производства рекомбинантного HBV составляет примерно 1/5 от родительского HBV, и похожи на уровни, представленных за предыдущие HBV рекомбинантных вирусов; Тем не менее, яркость NL преодолевает проблемы производительности вируса, поэтому он может быть использован для массового скрининга анти-HBV агентов.

Скрининг агентов против HBV с использованием первичных гепатоцитов, HepaRG, HepAD38 и НПБТ трансдуцированных гепатоцитов может быть полезным для скрининга агентов против HBV традиционным способом (ами). Тем не менее, система, описанная здесь, имеет различные преимущества, такие как простое управление, высокую чувствительность и низкая стоимость для скрининга. Эти преимущества являются подходящими для высокой пропускной способности анализов с целью разработки и выявления новых HBV агентов в терапевтических целях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Получение рекомбинантного HBV Кодирование Reporter белка

  1. Получение клеток HepG2
    1. Готовят среду для культивирования клеток (среда Игла в модификации Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ед / мл заменимые аминокислоты).
    2. Пластина 4 х 10 6 клеток HepG2 в 10-сантиметровом коллагеном покрытием блюдо в 10 мл культуральной среды , за день до трансфекции. Инкубируйте клетки HepG2 при 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
      Примечание: Когда примерно 4 х 10 6 HepG2 клетки высевают в 10 см коллагеном покрытием чашку для препарата в 10 мл культуральной среды, они будут 70-90% сплошности на следующий день.
  2. трансфекция
    1. Трансфекции клеток HepG2 5 мкг pUC1.2HBV дельта эпсилон 15 и 5 мкг pUC1.2HBV / NL 15 , используя трансфекциюреагента в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. На следующий день, удалить культуральной среды и добавляют 10 мл свежей культуральной среды.
    3. Через неделю после трансфекции, передачи культуральной среды, содержащей рекомбинантный вирус гепатита В в 50 мл трубки и перейти к этапу 1.3.1. Добавляют 10 мл свежей культуральной среды в чашке, содержащей трансфектированных клеток.
      Примечание: Получение рекомбинантного HBV сохраняется в течение 4-х недель. Носитель культуры, содержащей рекомбинантный вирус гепатита может храниться при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
  3. Очистка рекомбинантных HBV
    1. Удалить остатков клеток от культуральной среды, содержащей рекомбинантный вирус гепатита центрифугированием (2300 х г в течение 5 мин).
    2. Пропускают супернатанта через мембранный фильтр 0,45 мкм.
    3. Добавить равный объем 26% PEG / 1,5 М NaCl (полиэтиленгликоль 6000: 130 г, NaCl, 49 г, 1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 и 5 мл 1 М HEPES рН 7,6 в 500 мл) в культуральной среде содержащий рекомбинантныйHBV и аккуратно перемешать. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Центрифуга при 2300 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
    5. Жидкость над осадком сливают и растворяют осадок в 0,5 мл ТНЭ (10 мМ Трис, 50 ​​мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
    6. Удалите мусор с помощью центрифугирования при 2300 мкг в течение 5 мин.
    7. Нагрузка 0,5 мл ТНЭ, содержащей рекомбинантный вирус гепатита на 0,8 мл 20% сахарозы в TNE.
    8. Центрифуга при 100000 × г в течение 3 ч при 15 ° С.
    9. Откажитесь, как большая часть надосадочной жидкости, как это возможно, и сохранить осадок. Ресуспендируют его в 1 мл бессывороточной среды DMEM на 40 мл культуральной среды, начиная.
    10. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
    11. Смесь фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Приготовьте 0,5 мл аликвоты и хранят при -80 ° С.
      Примечание: Если наблюдается загрязнение репортер белка исходного образца вируса, очистить вирус с помощью градиента плотности ультрацентрифугированием 5-30% сахарозы в TNE при 100000 х г в течение 2 ч, или CsCl, плотность, уравновешенную центрифугирование сюдам 1,1-1,6 г / мл при 150000 мкг в течение 50 часов.

2. Заражение HBV рекомбинантного

  1. Культура клеток HepG2 , стабильно экспрессирующие НПБТ (HepG2 / НПБТ) 15, которые восприимчивы к инфекции ВГВ в среде DMEM , дополненной 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 250 мкг / мл G-418 и 100 Ед / мл заменимые аминокислоты при температуре 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
  2. За один день до инфицирования, пластины приблизительно 5 х 10 4 HepG2 / НПБТ клетки 14 в пластине с покрытием 96-луночных коллагена в 0,1 мл культуральной среды.
  3. Оттепель рекомбинантный HBV в C водяной бане при 37 ° до тех пор, пока маленький кусочек оставшегося во флаконе льда.
  4. Готовят среду для инфекции путем объединения следующих: по 10 мкл 40% PEG8000 в 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS), 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 10 мкл рекомбинантного HBV и 78 мкл свежей культуральной средына лунку 96-луночного планшета.
  5. Добавьте 100 мкл раствора рекомбинантного HBV в одну лунку 96-луночного планшета.
  6. Через день после заражения, промойте инфицированные клетки 3 раза с 300 мкл PBS на лунку, чтобы удалить белок загрязняющий репортер из вирусной фракции.
  7. Инкубируйте инфицированных клеток в 200 мкл культуральной среды, содержащей 2% ДМСО в течение одной недели или менее.

3. Анализ

  1. Через неделю после заражения, промойте инфицированные клетки 3 раза PBS.
  2. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса в инфицированных клетках.
  3. Rock Культуральный планшет в течение 5 мин, а затем центрифугировать при 2000 х г в течение 5 мин.
  4. Добавьте 50 мкл субстрата репортера в фотометр пластину.
  5. Добавьте 20 мкл лизата клеток в люминометра пластину, содержащую репортерный подложку. Смешайте встряхиванием кратко.
  6. Поместите пластину в фотометр и начать чтение 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

На рисунке 1 показана схема генома ВГВ, переписана РНК, вирусные белки и их кодирующей области на геном. Ген-репортер и его местоположение в геноме указаны также. На рисунке 2 показан репортер плазмиды и вспомогательной плазмиды ВГВ , содержащей ген - репортер. Репортер pUC1.2HBV / NL был построен путем удаления нуклеотидные положения 223-811 от сайта инициации транскрипции мРНК preCore из pUC1.2HBV 16 , а затем вставить ген - репортер. PUC1.2HBVdelta с точечных мутаций в последовательности инкапсидации сигнал был сгенерирован с помощью сайт-направленного мутагенеза ПЦР. Репортерной плазмидой (pUC1.2HBV / NL) и плазмиды - хелпера (pUC1.2HBVdelta) переваривали Hin DIII и Eco RI, а затем подвергали гель - электрофорезу. Ожидаемые диапазоны, которые 3,0 кб для плазмиды МПУЕ и 3,5 кб для 1.2HBV / NL или 1.2HBVdelta, показаны на рисЮр 2B. На рисунке 3 показана HepG2 клетки , экспрессирующие НПБТ , инфицированного рекомбинантным HBV. Для того, чтобы установить HepG2 клетки, стабильно экспрессирующие НПБТ, клетки HepG2 трансфицировали PCAN-НПБТ-Myc кодирования НПБТ-Myc и неомицину ген устойчивости. G418-резистентные клоны клеток отбирали и расширена. HepG2-НПБТ-Мус-clone22 восприимчивы к инфекции HBV. Лизатов HepG2 или HepG2-НПБТ-Myc-clone22 подвергали вестерн-блоттинга. НПБТ представляет собой гликопротеин из 349 аминокислот, с внеклеточным N-конца, содержащего два N-связанных сайтов гликозилирования (Asn5 и Asn11). 43 кДа полоса негликозилированной НПБТ и полоса 65 кДа гликозилированного 10 показаны на рисунке 3А. HepG2-НПБТ-Мус-clone22 клетки, экспрессирующие НПБТ, но не клетки HepG2, были восприимчивы к рекомбинантной HBV-инфекции. На рисунке 4 показана кинетика гена - репортера (А и В), вирус РНК и ДНК (А) уровни в рекомбинантной HBV-инфицированных HepG2-НПБТ-Myc-клона22 (А), или первичный гепатоцитов (ФН) клетки человека (B). Уровни HBV и РНК-репортера активности были повышены в 3-х дней после заражения в HepG2-НПБТ-Myc-clone22 или клеток ФН. В отличие от этого, не было никаких изменений в уровне ДНК через 9 дней после заражения, потому что рекомбинантный HBV является недостаточным для функционального ядра и Pol, которые играют важную роль в внутриклеточного пути репликации ДНК. На рисунке 5 показано ингибирование рекомбинантной HBV путем гепатита иммуноглобулин (HBIG), гепарин и IFN-бета. ингибиторы входа, такие как HBIG и гепарин сильно подавлял активность репортера менее чем на 10% при 75 Ед / мл и 150 ед / мл, соответственно, в то время как ИФН-β подавляло активность репортера менее чем на 50% при 1000 ед / мл. Ингибирующее действие этих ингибиторов была дозозависимой. На рисунке 6 показан жизненный цикл HBV.

Рисунок 1
Fi 1 цифра: Схема генома ВГВ и относительного расположения вирусной РНК и белков на геном. ДНК HBV показана дугой в черном цвете. Расположение энхансер и промоторы для транскрипции вируса РНК на дуге показан желтым цветом. Расположение вирусных РНК и белков в геноме представлены стрелками с пунктирными синими линиями (РНК) и с цветными стрелками (белки), соответственно. Вирусные РНК дискриминируются по размеру: 3,5 кб и 3,4 кб мРНК указывают на PreCore / C и прегеномной РНК / Core, соответственно, 2,5 и 2,1 кб РНК представляют и пре S1 пре S2 / S, соответственно, и 0,8 кб РНК указывает X ген 17. Ген-репортер, заменяется соответствующим размером коровой последовательности кодирования. Ген-репортер движимый основного промотора, содержащего энхансер II. Pro: Promoter, EnhI / Pro: Enhancer I / промоутер, EnhII / Pro: EnhancerII / промоутер, Пол: полимераза, S: поверхностный антиген вируса. целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Схема для генерирования рекомбинантного HBV. (A) Синие линии указывают на РНК pregenome. "А" растянуть представляет поли на 3'-конце. Синие прямоугольники обозначают кодирующую область для каждого вирусного белка. Красное поле указывает ген-репортер переведенный из своего собственного инициирующего кодона. Плазмида репортер не может производить PreCore и Pol, и вспомогательной плазмиды, содержащей 2 мутации в сигнале капсидирования (CTGTGCC к CTATGTC) выражает все белки HBV. E: инкапсидации сигнал. (В) репортерной плазмидой, плазмиды - хелпера и PUC плазмиду переваривают с Eco RI и Hin DIII. Эти расщепленные плазмиды подвергали гель-электрофорезу.Объявление / 54849 / 54849fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Рекомбинантные HBV инфицирует HepG2 , выражающую НПБТ. (A) Стабильная клеточная линия , экспрессирующая НПБТ была создана трансфекции клеток HepG2 с плазмиды , кодирующей Myc-меченый НПБТ с последующим отбором с 500 мкг / мл G418 в течение 3 недель. Уровень НПБТ-Myc в клетках HepG2, стабильно экспрессирующих НПБТ (HepG2-НПБТ-Мус-clone22) клеток определяли с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-Myc антител (1: 1000 разведение). (B) HepG2-НПБТ-Мус-clone22 клетки инфицировали рекомбинантным HBV в присутствии 2% ДМСО и 4% PEG8000. Через 72 ч после инфицирования, уровень репортерной активности определяли с помощью анализа репортерного. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, и столбики ошибок показывают йе стандартные отклонения средств. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Временной ход рекомбинантной HBV - инфекции. (A) HepG2-НПБТ-Мус-clone22 клетки инфицировали рекомбинантным HBV в присутствии 2% ДМСО и 4% PEG8000. Уровень HBV-инфекции определяли активность репортера (черная линия) на 3, 6 или 9 дней после заражения. Уровни HBV РНК (синяя линия) и ДНК (оранжевый линия) были одновременно измерены с помощью ОТ -ПЦР и ПЦР 15 соответственно, в каждой временной точке инфекция. (Б) Первичные гепатоциты человека (ФН), изолированный от урокиназы типа активатора плазминогена трансгенных мышей / SCID , инокулированных ФН, инфицировали рекомбинантным HBV в presencе 2% ДМСО и 4% PEG8000. Уровень HBV-инфекции определяли активность репортера на 3, 6 или 9 дней после заражения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Влияние известных агентов против HBV на рекомбинантную инфекции HBV. Клетки HepG2-НПБТ-Мус-22 инфицировали рекомбинантным HBV в присутствии HBIG, гепарина и IFN-бета в дозах, указанных, а также 2% ДМСО и 4% PEG8000. Уровень репликации HBV (А) и жизнеспособность клеток (В) определяли активность репортера через 6 дней после заражения. ИГГВ представляет собой антитело, которое нейтрализует инфекцию HBV и гепарин является ингибитором для оболочечных вирусов. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, а также погрешностями показывают стандартные отклонения средств. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Схема жизненного цикла вируса гепатита. HBV попадает в клетки через вирусные рецепторы, включая НПБТ. Капсида-ассоциированной расслаблены кольцевая ДНК (rcDNA) является без покрытия и превращается в ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (ковалентно замкнутую кольцевую ДНК) в ядре. функционирует в качестве ковалентно замкнутую кольцевую ДНК матрицы для транскрипции мРНК. Геномную РНК encapsidated к капсида вируса путем сборки с белками для ядра и Pol. Перед дальнейшим сборки с HBS белками, капсида участвует в амплификации ДНК HBV с помощью процесса, называемого процесса репликации ковалентно замкнутую кольцевую ДНК. Вирусные частицы, собранные с HBS белки в конце концов выходят за пределы клетки.ом / файлов / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HBV геном имеет четыре основных открытых рамок считывания (ORF , ) , включая ядро, полимеразы, поверхностных и X ORF , (рисунок 1). Транскрипция из этих четырех HBV ORF , жестко регулируется четырьмя промоутеров: при регистрации precore / ядро промотора , содержащие энхансер II, S1 промотор, S2 промотор и X промотор , содержащий энхансер I 18. 3,5 кб и 3,4 кб мРНК транслируются в PreCore и ядро ​​белков, соответственно. Большой обволакивают белок (L) получают из крупнейших субгеномного мРНК (2,5 кб), а средний (M) и небольшие поверхностные белки (S) переводятся с более короткой транскрипта (2,1 кб). 0,8 кб транскрипт шаблон для перевода X белка 19, 20. 5'и 3'концы прегеномной РНК содержат несколько функциональных цис - элементы , которые включают прямое повторение 1 (DR1), DR2 и упаковочный сигнал 21, 22, Эти функциональные элементы ограничивают вставку или репортерных генов-маркеров в прегеномной РНК. Мы построили рекомбинантный вирус гепатита с использованием транс-комплементации двух векторов, вектор переноса, содержащий ген-репортер и вспомогательный вектор. Вектор переноса был построен путем замены основных и POL регионов с геном - репортером (рисунок 2).

НПБТ был идентифицирован как клеточный рецептор для HBV записи 10. Поскольку экспрессия мРНК НПБТ очень низка в клетках HepG2, которые не восприимчивы к инфекции ВГВ, мы установили устойчивую линию HepG2 клеток , выражающую НПБТ-Myc (рис 3А). В то время как рекомбинантный HBV инфекция клеток HepG2 не показали активность репортера, экспрессия НПБТ в клетках HepG2 присвоил восприимчивость к рекомбинантной HBV - инфекции (рис 3B). Анализ временной ход рекомбинантной HBV-инфекции показали, что как репортер активности и HBV РНК detectable в течение 3 дней рекомбинантной HBV-инфекции и достиг максимума в 9 дней постинфекционные; Однако, повышенные уровни ДНК вируса гепатита В не наблюдалось (рисунок 4). Ингибиторы входа, такие как HBIG или гепарина, заторможенной рекомбинантного HBV - инфекции (Рисунок 5). Эти результаты указывают на эту систему можно использовать для контроля ранней репликации вируса гепатита В от стадии вступления вируса в транскрипции, но не репликации ДНК и повторное заражение вирусом высвобождается из инфицированных клеток (рисунок 6).

Так как белок репортер часто загрязняет рекомбинантной HBV фракции, промывание инфицированных вирусом клеток с PBS менее чем в три раза, может привести к высоким фоном. Поэтому важно, чтобы проверить уровень фона путем измерения активности репортера в среде с HBV-невосприимчива HepG2 обработанного рекомбинантного вируса. Если фон высокой, добавьте стадии промывки (3 раза промыванием 300 мкл PBS на лунку в 96-луночный планшет) день BEFруды шагу 3.1.

Если производство рекомбинантного HBV низок, проверить эффективность трансфекции контрольной плазмидой, экспрессирующей флуоресцентный белок, такой как GFP или DsRed. В общем, эффективность трансфекции клеток HepG2 должно быть больше, чем на 35%. Если эффективность трансфекции является низкой, оптимизации конкретных условий трансфекции для достижения высокой эффективности трансфекции. Если эффективность трансфекции высока, проверьте, является ли инфекционный рекомбинантный HBV получен с использованием его для заражения первичные гепатоциты человека. Инфекционность HBV в первичных гепатоцитов человека, как правило, выше, чем в линии клеток гепатомы, экспрессирующих НПБТ. Если эффективная инфекция рекомбинантной HBV достигается в первичных гепатоцитов человека, проблема не рекомбинантный HBV, но клетки должны быть инфицированы. Установить ряд стабильных HepG2 клонов, экспрессирующих НПБТ и выбрать высоко инфекционных клеточных клонов. Низкая конфлюентности клеток в культуре во время инфекции может привести к плохому Infectivity. Увеличение количества клеток в культуре повышает эффективность инфекции. Для HBV-инфекции, 80-95% слияния для клеток HepG2, экспрессирующих НПБТ во время инфекции обеспечивает высокий уровень инфекции.

Развитие нескольких репортер HBVs сообщалось многими группами 11, 12, 13, но большинство из этих репортерных HBVs демонстрируют плохую производительность. Кроме того, активность репортера в инфицированных клетках не столь высока, и было бы трудно использовать для скрининга анти-HBV агентов с использованием анализа с высокой пропускной способностью. В отличие от этого, наша система репортер ВГВ производит сильный сигнал репортер в инфицированных клетках, что позволяет легко проводить массовый скрининг для агентов против HBV с использованием относительно небольшого количества вируса по сравнению с другими вирусами репортерных сообщенных до сих пор.

Здесь мы получили новую систему HBV-репортер для мониторинга на ранних стадияхцикл репликации HBV, и это было подтверждено измерением активности репортера белка после заражения. Описанный метод является простым, быстрым и экономически эффективным HBV векторной системой и будет полезен для выявления HBV факторов хозяина, а также анти-HBV соединений с использованием методов скрининга с высокой пропускной способностью. Действительно, мы определили HBV факторы хозяина и гены анти-HBV от всего генома технологии RNAi 15. Следует отметить, что эта система не подходит для оценки поздних стадий репликации HBV, таких как стадии репликации ДНК, капсида и сборки вируса, и подающий надежды, потому что рекомбинантный HBV является недостаточным для производства функционального ядра и Pol. Дальнейшее развитие рекомбинантной HBV требуется, чтобы оценить весь жизненный цикл HBV.

Таким образом, эта система может быть использована для оценки ВГВ-инфекции путем измерения активности репортера. Таким образом, нет необходимости проводить сложные методы анализа, такие как ПЦР, ОТ-ПЦР,HBV Ядро или S антиген ELISA для оценки HBV-инфекции / репликации. И, наконец, потому, что этот репортер ВГВ некомпетентным репликации, не существует риск инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter