Summary
Bestemmelsen af opløsningen struktur af et protein ved lille vinkel røntgenspredning (SAXS) kræver monodisperse prøver. Her præsenterer vi to muligheder for at sikre minimale forsinkelser mellem prøveforberedelse og dataopsamling: online størrelse-(SEC) og online ionbytningskromatografi (IEC).
Abstract
Biologisk lille vinkel røntgenspredning (BioSAXS) er en kraftfuld teknik i molekylær og strukturel biologi anvendes til at bestemme opløsning struktur, partikelstørrelse og form, og flade-til-volumen-forholdet af makromolekyler. Teknikken kan anvendes til en meget bred vifte af løsningsmodeller betingelser spænder over en bred vifte af koncentrationer, pH-værdier, ioniske styrker, temperaturer, tilsætningsstoffer osv, men prøven er forpligtet til at være monodisperse. Denne advarsel førte til gennemførelsen af væskekromatografi systemer på SAXS beamlines. Her beskriver vi den opstrøms integration af størrelsesudelukkelseschromatografi (SEC) og ionbytningskromatografi (IEC) på en beamline, forskellige metoder til optimal baggrund subtraktion, og datareduktion. Som et eksempel beskriver vi, hvordan vi bruger SEC og IEC-SAXS på et fragment af det essentielle vacciniavirus protein D5, der består af en D5N helicasedomænet. Vi bestemme dens overordnede form og molekylvægt, der viser den hexameriske struktur the-protein.
Introduction
BioSAXS er et kraftfuldt værktøj til at bestemme formen af nanostørrelse objekter 1-4. Spredningen af røntgenstråler ved en opløsning indeholdende makromolekyler, dimensioneres på nm, registreres ved meget lave vinkler. Denne kantede sortiment indeholder oplysninger om globale parametre: inertiradius; den største intrapartikulære distance; partiklen form; og graden af foldning, denaturering, eller lidelse. Teknikken kræver ikke krystaller, og makromolekylet forbliver i opløsning og kan således holdes under forhold efterligner visse vigtige parametre for cellen, såsom ionstyrke, pH osv Kendskabet til disse faktorer kan bidrage til at fastslå, for eksempel det fysiologisk relevante oligomere tilstand af et protein af interesse eller til at validere en foreslået model af et kompleks. Karakteriseringen af protein-protein interaktioner i forskellige bufferbetingelser, skabelse af modeller for manglende domæner, forfinelse af homologi modeller, og dekan udføres terminering af diskrete foldede og ufoldede tilstande hurtigt og nemt 5.
Som med enhver teknik, BioSAXS har iboende svagheder: aggregerede eller denaturerede prøver, blandinger af partikler, heterogene prøver, stråleskader, og buffer misforhold kan resultere i un-fortolkelige data. For mange analysemetoder, er det implicit antaget, at prøven er monodisperse, et krav, er ofte vanskeligt at opnå i praksis. I mange tilfælde, nedbrydningen af prøven er subtile og kan ikke påvises i data på egen hånd, og ethvert forsøg på at fortolke data giver urigtige eller endda misvisende resultater. For at overvinde disse forhindringer, var kombinationen af størrelse-(SEC) og SAXS implementeret på mange beamlines at sikre datakvaliteten og gøre denne teknik mere tilgængelige for stadig sværere prøver 6-11. For nylig har vi tilføjet en ny metode til at repertoiret ved at udvikle online ionbytningkromatografi (IEC) -coupled SAXS 12. Begge teknikker åbner SAXS til en bred vifte af biologiske partikler tidligere umuligt at analysere. Valget af metode afhænger af de biofysiske egenskaber af partiklerne af interesse.
SEC adskiller makromolekyler ved deres størrelse, hvorved der behov for mindst en forskel i tilsyneladende molekylvægt på 10% til adskillelse. Fysiske begrænsninger i søjlen og fysiologiske egenskaber af prøverne, ligesom hydrofobe overflader, fleksibilitet og manglende stabilitet, også komplicere dataindsamling, analyse og fortolkning.
Ionbytningskromatografi, som adskiller molekyler baseret på deres ladning og dermed deres bindingsaffinitet til IEC kolonne, kan anvendes i stedet for eller som supplement til SEC. Den totale ladning kan let manipuleres ved ændring af pH eller variere koncentrationen af bufferen salt, hvilket giver en forholdsvis simpel metode til styret elution af molekylerne fra IEC kolonne. Ved at bruge afgiften, adskillelse af lignende typer og størrelser af molekyler, som ellers ville være svært at adskille, kan udføres rutinemæssigt med IEC. Derudover IEC har den fordel at være i stand til at behandle fortyndede prøver, tillader en at undgå koncentrering, som bærer den potentielle risiko for denaturering af proteinet. Desværre, som ladningsfordelingen er yderst prøve-afhængig, IEC kræver optimering med hensyn til pH og saltkoncentrationer 13,14.
For mange proteiner, som er vanskeligt at udtrykke, oprense eller begge kun lave mængder af prøven er tilgængelige til at studere. Det er vigtigt at være effektiv og for at minimere antallet af rensningstrin og dermed tab. Af denne grund det sidste oprensningstrin er online direkte inden SAXS dataopsamling, for at øge sandsynligheden for opsamling af en god data sættet.
HerPræsenterer vi og sammenligne online SEC-SAXS og IEC-SAXS. Begge teknikker blev gennemført på BioSAXS beamline BM29 på ESRF (ESRF) i Grenoble, Frankrig 15. Som en prøvesag, brugte vi D5N og helicasedomænet af vacciniavirus protein D5, som var temmelig vanskeligt at analysere strukturelt ved hjælp af andre metoder. Vaccinia virus er et medlem af Poxviridae familien og er 98% identisk med variolavirus, årsagen til kopper. Ved hjælp af vaccinia systemet, studerer vi replikation maskiner, der fokuserer her på de væsentlige helicase-primase D5.
D5 er et 95-kDa protein med en N-terminal Archeo-eukaryot primase (AEP) domæne 16 efterfulgt af en cystein klynge region (res. 240-345) 16. Tættere på C-terminus kommer en D5N domæne (res. 340-460), som altid er forbundet med D5-type helicaser, og endelig en superfamilie 3 (SF3) helicasedomænet (res. 460-785) 17 (Figure 1A). Helicasedomænet af D5 bygger en hexamer ringstruktur, der er nødvendig for tæt binding til DNA. Takket være de seneste SAXS og EM studier er de lav opløsning strukturer i primase og helicase domæner nu kendt 18.
Her viser vi, hvordan man bruger de gennemførte online kromatografiteknikker på BioSAXS beamline BM29 på ESRF at få indblik i strukturen af den C-terminale fragment (rest 323-785) i D5.
Protocol
1. Beskrivelse af Offline Forberedelse og Sample Generation af en D5 sletning Protein
BEMÆRK: D5 323-785 konstrukt (figur 1A) blev klonet, udtrykt og oprenset som beskrevet 18.
- Klon konstruktionen i pProEx HTB vektor
- Udfør en polymerasekædereaktion (PCR) på D5R hjælp af 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'og 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' primere og en PCR-reaktionsblandingen med polymerase, efter fabrikantens vejledning.
- Oprense PCR-fragmenter via spin-søjler, efter fabrikantens vejledning.
- Fordøje PCR fragmenter og plasmidet med Ncol og Hindlll-restriktionsenzymer, i overensstemmelse med producentens anbefalinger til buffer sammensætning og inkubationstid.
- Kør fragmenterne på en 1% agarosegel i 0,5x TAE-buffer (20 mM Tris, 10 mM eddikesyre,og 0,5 mM EDTA) og plette gelen med en DNA-farvestof.
- Udsætte gelen for UV-lys.
Forsigtig: Brug personligt sikkerhedsudstyr! Skåret ud båndene af de fordøjede PCR-fragmenter og det fordøjede plasmid og oprense DNA under anvendelse af en gel rensning spinsøjle kit, ifølge producentens anbefalinger. - Ligere de oprensede PCR-fragmenter i plasmidet under anvendelse af en hurtig ligeringskit, ifølge producentens anbefalinger.
- Transform via varmechok produktet fra ligeringsreaktionen i kompetente bakterier optimeret til plasmid amplifikation.
- Tilsæt halvdelen af ligeringsproduktet til et hætteglas af bakterier.
- Inkubér reaktionsrøret på is i 20 minutter.
- Inkubér røret ved 42 ° C i 30 s.
- Glasset anbringes på is i 2 min.
- Tilsæt 1 ml Luria Bertani (LB) bouillon (Miller) uden antibiotika og lad cellerne inddrive ved 37 ° C i 1 time.
- Spin ned cellerne ved 16.100 xg foR 3 s i en bordplade mikrorør centrifuge og fjerne det meste af mediet.
- Spred celler på en LB-agarplade med ampicillin (50 ug / ml endelig) og lad kolonierne vokser ved 37 ° C natten over.
- Sætte en koloni i 3 ml LB med ampicillin (50 ug / ml endelig) og vokse kulturen ved 37 ° C, rystning ved 160 rpm natten over.
- Følg instruktionen af miniprep kit til at udtrække plasmidet.
- Sende en prøve af plasmidet til sekventering og analyse af sekvensen for fravær af mutationer og for korrekt indføring.
- Transformer pProEx HTB D5 323-785 konstruktion i bakterier er optimeret til proteinekspression (brug en uL og følge trinene i trin 1.1.7). Spred bakterierne på en LB-agarplade med ampicillin (50 ug / ml endelig).
- For at oprette en start kultur, sætte en koloni i 300 ml LB med ampicillin (50 ug / ml endelig) og vokse bakterier ved 37 ° C, ryster ved 160 rpm natten over.
- Pode 12 x 1 L LB i nærvær af ampicillin (50 ug / ml endelig), hver med 20 ml af pProEx HTB D5 323-785 bakterier starterkultur ved 37 ° C indtil en OD600 = 0,3 er nået. Sænk temperaturen til 18 ° C og inducere ekspression ved en OD600 = 0,5 med 1 mM IPTG. Inkubér kulturer, ryster dem ved 160 rpm og 18 ° C natten over.
- Høst bakterierne ved centrifugering ved 50.000 x g og ved 4 ° C i 30 minutter. Resuspender bakterielle pellets i ca. 150 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM β-mercaptoethanol og 10% glycerol) med 1x proteasehæmmer og 25 enheder ( U) / 10 ml DNase. Lysere bakterier via sonikering på is (1-tommer sonde, 50% effekt, 0,5-s puls, 0,5-s pause, 3x 5 min).
- Indlæse supernatanten på en nikkel affinitet søjle (Ni-søjle, 1,5 ml søjlevolumen), og vask det med 10 søjlevolumener (CV) af BBINDENDE buffer (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol og 10% glycerol), 10 CV af vaskebuffer (50 mM Tris-HCI [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol og 10% glycerol), og 10 CV af imidazol vask (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol og 30 mM imidazol). Eluering af D5 323-785 (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol og 200 mM imidazol).
- Undersøg forskellige oprensningstrin via natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE).
- Belastning 2-20 pi hver oprensningstrin gennemstrømning blandet med 1x loading dye (2x: 4% SDS, 20% glycerol, 120 mM Tris-HCI [pH 6,8], og 0,02% vægt / volumen bromphenolblåt) på en 10 % SDS gel og køre dem ved 200 V i 1x Laemmli løbebuffer (25 mM Tris, 0,192 M glycin og 0,1% SDS).
- Farv gelen med en klar-til-brug Coomassie blå opløsning.
- excSvejsning bufferen i den eluerede protein med bindingsbuffer ved anvendelse af en afsaltningssøjle ifølge producentens manual.
- Spalte His-mærke ved at tilføje Tobacco Etch Virus nuklear-optagelse-en endopeptidase (TEV, 1 mg / 100 mg protein) til proteinopløsningen. Der inkuberes ved stuetemperatur natten over.
- Kontroller fordøjelse ved at udføre SDS-PAGE (se trin 1.5)
- Ækvilibrering af Ni-søjlen i bindingsbuffer. Lad proteinopløsningen passere igennem og vask af perlerne med 2 CV af imidazol vaskebuffer mens indsamling gennemløbet.
- Koncentrer proteinet under anvendelse af en centrifugal-koncentrator til et endeligt volumen på 0,5 ml.
- Injicere koncentrerede proteinopløsning på en størrelse-eksklusion søjle ækvilibreret med gelfiltrering buffer (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glycerol og 1 mM dithiothreitol [DTT]).
- Opsaml gennemløbet i 0,5-ml fraktioner.
- Kontrol af tilstedeværelse og renhed af proteinet i Peak prøver vedudføre SDS-PAGE (se trin 1.5).
- Kombiner fraktionerne af den eluerede top af D5 323-785. Fortynde prøven til 25 mM NaCl og 5% glycerol og samtidig holde TRIS og DTT-koncentrationer konstant (i 5 ml proteinopløsning i 20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glycerol og 1 mM DTT, først tilføje 5 ml 20 mM Tris-HCI [pH 7] og 1 mM DTT, og derefter tilføje 20 ml 20 mM Tris-HCI [pH 7], 5% glycerol, og 1 mM DTT).
- Læg prøven på en ionbyttersøjle. Brug puffer A (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% glycerol og 1 mM DTT) og puffer B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl, 5% glycerol og 1 mM DTT) at danne et salt gradient fra 25 mM til 1 M.
- Opsaml eluerede protein i 1,5-ml fraktioner.
- Kontrol af tilstedeværelse og renhed af proteinet i Peak prøver ved at udføre SDS-PAGE (se trin 1.5 og figur 1B)
- Reconcentrate proteinopløsningen i en centrifugal-koncentrator til et endeligt volumen på 0,5 ml.
- Rerun det koncentrerede protein på en størrelse-eksklusion søjle i gelfiltrering buffer (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCl, 5% glycerol og 1 mM DTT; se trin 1.11).
2. Dataindsamling
BEMÆRK: Forespørgsel stråle tid så tidligt som muligt. For ESRF, kan retningslinjer for tilgængelige access typer, og om, hvordan man indsende en ansøgning findes på:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Efter accept af forslaget og en invitation til eksperimentet, alle deltagere nødt til at fuldføre en sikkerhedsuddannelse. Efter validering af uddannelsen, skal du udfylde "A-form" (via ESRF brugeren portalen) til at erklære forskerne besøger beamline for eksperimentet, sammen med de nødvendige oplysninger sikkerheden på prøverne. Kontakt det lokale kontaktperson for at diskutere eksperimentet.
- SEC-SAXS dataindsamling
BEMÆRK: onlIne rensning, skal du bruge (HPLC) -system kromatografi højtydende væske installeret hos BM29. Systemet består af en in-line afgasningsdelen, en binær pumpe, en ventil til buffer udvælgelse og gradienter, en autosampler, en UV-VIS-array photospectrometer, og en ledningsevnemåler. Den er direkte bundet til gennemstrømning kapillar af SAXS eksponering enhed 19.- 1 ml af den gelfiltrering puffer til side. Slut buffer flasken til SEC-systemet (standard er Port A).
- Vælg strømningshastigheden afhængig søjlen i brug. Note: For størrelsesudelukkelses-kolonnen anvendes her, strømningshastigheden er 0,1 ml / minut. Definer det maksimale tryk for kolonnen, notere modtrykket, og indstille købet tid til mindst 1,2 CV.
- Skyl pumper og opstrøms rør via "auto-udrensning" funktion.
- Vent til systemet er fyldt med bufferen, og tilslut kolonnen. Ækvilibrering af kolonnen ved at lede mindst 1,5 CV.
- Interlockden Hutch og måle puffer afsat i trin 2.1.1, under anvendelse prøveudskiftningsanordningen at kontrollere for variation af signal på grund af strålingsskader. Kun fortsætte, hvis der ikke er nogen stråling skader på bufferen.
- Skift beamline kontrolsystem til HPLC-tilstand. Foretag en testkørsel af buffer, indsamle 200 frames med 1 s per ramme. Skriv ned på antallet af tællinger givet af detektoren i den summerede intensitet plot.
BEMÆRK: Signalet skal matche tidligere målt buffer og den summerede intensitet over tid skal forblive konstant. Hvis signalet ikke passer eller ikke er konstant, er en længere ligevægt af systemet kræves. - Spin ned prøven ved 13.000 xg i en bordplade mikrorør centrifuge i mindst 10 min.
- Fyld prøven i en HPLC-kompatibelt hætteglas (medfølger), og sætte det ind i autoinjektor. Bemærk brønden position.
- Interlock den eksperimentelle Hutch hjælp standard procedure, som forklaret i Brugersikkerhed Training.
- Log ind og oprette en mappe til lagring af data gennem beamline kontrol software.
- Program HPLC-systemet ved hjælp af "hurtig batch" funktionen. Angiv placering opbevaring for UV-data til mappen oprettede i trin 2.1.10. Sørg for at aktivere den automatiske ASCII konvertering af UV-data, lagring ASCII-filen i samme mappe.
- Vælg injektionsvolumen og godt position. Føj målingen til kø ved at trykke på "Start" knappen. Softwaren vil bede om at redde partiet. Forbered til at gemme, men ikke trykke på knappen "Gem", da dette automatisk starter målingen.
- Opsæt parametre dataindsamling i beamline kontrol software. Vælg antallet af rammer, således at den samlede dataindsamling tid er i svagt overskud af erhvervelsen tid defineret i trin 2.1.2.
- Åbn sikkerhed lukker og starter SAXS dataindsamling ved hjælp af beamline kontrol software. Kontroller, at data er correkte erhvervet. Sammenlign nyligt indsamlede data til de indsamlede i trin 2.1.6 data og kontrollere, at antallet af tællinger i den summerede intensitet forbliver konstant i mindst 100 frames og svarer til den værdi fra trin 2.1.6.
- Start SEC køre ved at trykke på knappen "Gem", som fremstillet i trin 2.1.11, og bemærk rammen nummer vises i camserver software, når injektionen er afsluttet, og erhvervelse UV-data starter.
- Efter dataindsamlingen, åbne ISPyB databasen 20 på Åbn fanen "datafangst", og tryk på knappen "Go" for at få adgang til datasæt og resultaterne af den automatiske analyse 21.
- IEC-SAXS dataindsamling
BEMÆRK: I stedet for den kontinuerlige lineær gradient almindeligt anvendt i IEC eksperimenter, bruge en trinvis gradient, hvor mængden af buffer B øges i forudindstillede diskrete trin.- Opret HPLC program for en Sample-fri buffer run. Programmere en trinvis gradient startende fra 0% buffer B og stigende med 5 procentpoint efter to CV indtil 100% af buffer B er nået.
- Sæt nogle af hver buffer til side. Tilslut flasken med lavt saltindhold buffer A til port A og den med den høje salt buffer B til port B.
- Vælg strømningshastigheden og holde sig under trykket grænse af søjlen (i dette eksempel, 1 ml / min).
- Som i trin 2.1.3, skylle pumper og opstrøms rør ved hjælp af "auto-udrensning" funktion.
- Bringe systemet i ligevægt i buffer med lavt saltindhold A (se trin 1.15) og forbinde ionbyttersøjle den. Vent indtil kolonnen er fuldstændig ækvilibreret (mindst 1,5 CV).
- Brug bufferen afsat i trin 2.2.2 at undersøge buffere A og B for stråleskader ved hjælp af prøven skifter, som i trin 2.1.5.
- Check bufferen kommer ud af søjlen, som i trin 2.1.6. Sammenlign signalet til signalet buffer A registreres i trin 2.2.6. Bemærk igenantal tællinger i den summerede intensitet plot.
- Opret en mappe til lagring af data for bufferen løb.
- Opsæt dataindsamling i HPLC-system mode. Vælg antallet af rammer, således at den samlede dataindsamling tid overstiger den samlede tid for IEC run (se trin 2.2.1).
- Åbn sikkerhed lukker og start SAXS dataindsamling. Kontroller, at det fortsætter korrekt og dobbelttjekke, at den summerede intensitet forbliver konstant på noterede i trin 2.2.7 i mindst 100 frames værdi.
- Brug "Single Kør" funktion i HPLC software og starte den trinvise gradient programmeret i trin 2.2.1. Til injektion, sætte hætteglasset nummer til -1 for at injicere ingen prøve i dette trin. Skriv ned på antallet af frames erhvervet som programmet starter.
- Opret HPLC program for prøven løb. Programmere en trinvis gradient startende fra 0% af buffer B. Skøn andelen af buffer B på hver top målt offline i trin 1.1.5 (
- Spin ned prøven ved 13.000 xg i en bordplade mikrorør centrifuge i mindst 10 min.
- Fortynd D5 323-785 i saltkoncentration på puffer A (25 mM) ved at blande det med 20 mM Tris-HCI [pH 7], 10% glycerol og 1 mM DTT.
- Læg prøven manuelt på søjlen. Sætte buffer A indgangsrør i den fortyndede prøve efter pause pumperne for at undgå dannelse af luftbobler. Afbryd kolonne fra detektorerne direkte at samle gennemløbet fra søjlen.
- Når prøvebeholderen er næsten tom, returnerer input røret i puffer A (igen pause pumperne under flytning af rør) og genstart pumpning med puffer A for at overføre prøven fra slangen til søjlen. Når hele prøven har væretindlæst, pass 2 CV af buffer A, og tilslut derefter kolonnen til detektorerne.
- For prøven løb, oprette en mappe til lagring af data.
- Åbn sikkerhed lukker og start SAXS dataindsamling. Kontroller, at dataindsamlingen skrider korrekt og dobbelttjekke, at den summerede intensitet forbliver konstant på noterede i trin 2.2.7 i mindst 100 frames værdi.
- Brug "Single Run" træk ved HPLC software til at starte den trinvise gradient programmeret i trin 2.2.12. Til injektion, sætte hætteglasset nummer til -1 for at injicere ingen prøve i dette trin. Skriv ned på antallet af frames erhvervet som programmet starter.
- "Dataopsamling" Open i ISPyB 20 og tryk "Go" for at se på datasættet og automatisk analyse 21.
- Eksporter UV data fra HPLC-systemet til ASCII-format gennem "Postrun Analysis" software.
3.SEC-SAXS data Reduction & Analyse
- Åbn dataene i dataopsamling i ISPyB ved at trykke på "Go" -knappen. Bestem i oversigten, der indrammer af samlingen SAXS data svarer til toppen eluering. Kontroller, at inertiradius er stabil hele toppen.
- Bekræft, at automatiseret buffer korrektion blev udført korrekt. Indlæs rammer fra den centrale del af toppen i et program, der udfører manipulationer med eksperimentelle SAXS datafilerne 22 og midle dem. Derefter indlæse automatisk genererede buffer fil og kontrollere, om de høje q regioner af de midlede rammer og den buffer frames kamp.
- Sammenlign rammerne vundet i top kvantitativt ved hjælp af CORMAP test 23.
- Læg de automatisk oprettede subtraktioner (* _sub.dat filer) af rammer, der dækker området af interesse.
- Skaler dem til hinanden ved at trykke på "Scale" knappen.
- Compare dem ved hjælp af "Data Sammenligning" funktion. Der bør ikke være nogen systematiske ændringer mellem rammerne i hele toppen.
- Åbn alle * -_ sub.dat rammer af interesse, flette dem ved hjælp af knappen "Flet", og gem det fusionerede fil i .dat format.
- Bestem inertiradius med "inertiradius" værktøj i programmet, at bemærke det første datapunkt i Guinier interval for senere beskæring af dataene ved lav opløsning.
- Bestem parret afstande fordelingsfunktion med "Distance Distribution" værktøj i programmet og gemme den resulterende .out fil som gnom.out.
4. ab initio Modeling
- På en Unix maskine, køre en 40 x ab initio model genopbygningsprogram uden symmetri restriktioner. Opret en ny mappe og kopiere gnom.out filen til det. Kør programmet som følger:
for ((i = 1; i <= 40; i ++)); gøre dammif gnom.out -MS -p dammifp1_ $ i; den - Analogt, køre en rekonstruktion ab initio modelprogram med symmetri restriktioner for seksdoblet symmetri i en anden mappe:
for ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -MS -s P6 -p dammifp6_ $ i; Færdig - Juster alle genopbygning ab initio modelprogram output-filer (* -1.pdb). I de to mapper fra trin 4.1 og 4.2, køre damaver -a * -1.pdb.
- Åbn foreningen af alle modeller (damaver.pdb) samt den model, filtreret til den korrekte mængde (damfilt.pdb) i en egnet molekylær visualisering software 26 og sammenligne dem.
- Åbn damsel.log filen i en teksteditor. Det opført som "reference" i bunden af filen model er den mest repræsentative model.
5. IEC-SAXS data Reduction, Analyse og modellering
- I det program, der udfører manipulation med eksperimentelle SAXS datafiler 22, indlæse omkring 50 SAXS rammer fra hvert blandetrin afbufferen løb, trykke på "MIDDEL" knappen, og gemme resultaterne.
- Baseret på auto-behandling resultater tilgængelige via ISPyB, identificere, hvilke rammer af eksperimentet svarer til eluering af proteinet og kontrollere, at (foreløbig) inertiradius er stabil i hele toppen.
- Læg rammer til den eksperimentelle SAXS datafiler manipulation program 22 og gennemsnittet dem, som udført for buffer rammer (se trin 5.1). Derefter indlæse buffer filer genereret i trin 5.1 og sammenligne de høje q regioner (over 4,2 nm -1) for at finde en buffer, der matcher gennemsnittet fra toppen.
BEMÆRK: Der må ikke være systematisk forskydning mellem gennemsnittet fra toppen og bufferen. Hvis prøven kurve synes at falde mellem to buffer kurver, interpolere deres kurver ved at beregne gennemsnittet. - Træk bufferen identificeret som det bedste match fra gennemsnittet spredning kurve af toppen fraktionen og gemme den resulterende subtrhandlet fil. Desuden skaber trækkes kurver ved hjælp af gennemsnitlige buffer kurverne fra de foregående og følgende blanding skridt til at estimere fejlmargin af subtraktion.
- Gentag trin 5.3 og 5.4 individuelt for venstre og højre halvdele af top og sammenligne resultaterne med dem fra trin 5.4 at kontrollere for stabiliteten af signalet hele toppen.
- Følg trin 3.5 og 3.6 for alle tre subtraherede Kurverne fra trin 5.4.
- Sammenlign resultaterne for alle tre trækkes kurver.
Bemærk: Kun resultater, der forbliver robust i fejlmargin på subtraktion kan have tillid til. - Udfør modellering som i trin 4.1 og 4.2 for den bedste subtraktion identificeret i trin 5.3.
- Følg trin 4,3-4,5 at tilpasse modellerne og for at identificere den mest repræsentative en.
6. Sammenligning af resultater
- Kør et program til at overlejre 3D strukturer 12 på de repræsentative modeller af SEC (trin 4.5) end IEC-SAXS data (trin 5.9) med P6 symmetri: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
- Importer model_sec.pdb og model_iec-r.pdb i en molekylær visualisering software.
- Åbn .fir filer af modelsec.pdb og modeliec-r.pdb i et regneark og skabe en 2D graf af eksperimentelle og beregnede sprednings- kurver.
Representative Results
Resultaterne af model-fri invariant analyse er anført i tabel 1. Analysen af D5 323-785 SEC-SAXS data viste en molekylmasse skøn (fra en Porod analyse) af 345 kDa versus 338 kDa, observeret ved hjælp af IEC-SAXS. Begge er i overensstemmelse med den forventede masse på 6 gange 53,5 kDa (321 kDa) for en hexamer. Den ab initio modellering af begge datasæt blev gennemført uden pålagt symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1), og ved hjælp af C6 symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Da de overordnede passer til spredningen data for begge rekonstruktioner er sammenlignelige i begge tilfælde (Figur 1D og E), kan C6 symmetri antages. Således modellen svarer til en sekskantet kegle-lignende struktur med en central kanal, som vises delvis blokeret (SEC: Figur 1F; IEC:
Figur 1: SAXS dataanalyse og sammenligning af D5 323 -785 (figur tilpasset fra Referencer 12 og 18). A) Skematisk domæne struktur D5 protein og D5 323-785. B) Offline ion-udveksling kromatogram med angivelse af de tre toppe. Orange kurve: Absorbans ved 280 nm (au), blå kurve: Procent af puffer B. Procentdele af puffer B ved toppene er angivet. C) Online ion-udveksling kromatogram. Farve nøgle som i B. Derudover er den målte intensitet angivet med grøn. Den eksperimentelle spredning kurve and beregnede kurve af modellen opnås ved SEC-SAXS D) og IEC E) dataanalyse af D5 323-785. F) Bead model af D5 323-785 baseret på SEC-data og G) IEC data. H) overlejring af SEC og IEC-modeller. Panelerne i F) til H) blev oprettet ved hjælp af en molekylær visualisering software 24. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Parametre data-indsamling | |
| Instrument: | ESRF BM29 |
| Bølgelængde (Å) | 0.99 |
| q-range (Å -1) | ,0032-,49 |
| Prøve-til-detektor afstand | 2,864 m |
| Eksponering tid (sek) | 1 per ramme |
| Koncentration rækkevidde | na |
| Temperatur (K) | 293 |
| detektor | Pilatus 1M (Dectris) |
| Flux (fotoner / s) | 1 × 10 12 |
| Beam størrelse (um 2) | 700 × 700 |
| Strukturelle parametre for D5 323-785, SEK | |
| I 0 (cm-1) [fra Guinier] | 0,0237 |
| Rg (Å) [fra Guinier] | 48 |
| q min R g - q max Rg anvendes til Guinier | 0,77-1,24 |
| D max (Å) [fra P (R)] | 145 |
| q-måleområder for p (r) (Å -1) | 0,02 til 0,17 |
| Porod volumen V p (Å 3) [fra Scatter] | (570 ± 5) × 10 3 |
| Molekylær masse M r (kDa) [fra V p] | 345 |
| Beregnet monomer hr fra sekvensen (kDa) | 321 |
| Strukturelle parametre for D5 323-785, IEC | |
| I 0 (cm-1) [fra Guinier] | 0,386 |
| Rg (Å) [fra Guinier] | 46,5 ± 0,1 |
| q min R g - q max Rg anvendes til Guinier | 0,44-1,29 |
| D max (Å) [fra P (R)] | 120 |
| q-måleområder for p (r) (Å -1) | 0,03-0,18 |
| Porod volumen V p (& #197; 3) [fra Scatter] | (577 ± 5) × 10 3 |
| Molekylær masse M r (kDa) [fra V p] | 339 |
| Beregnet hexamere hr fra sekvensen (kDa) | 321 |
Tabel 1: SAXS data parametre. Tabellen opsummerer parametrene for SAXS indsamling og analyse af data.
Discussion
For mange makromolekyler, er et sidste rensning skridt ved hjælp chromatografi påkrævet før SAXS dataindsamling for at opnå en god kvalitet datasæt. Men ikke alle prøver forbliver stabile; de kan være tilbøjelige til aggregering eller re-ækvilibrering til en blanding af oligomeriserende stater. Derfor er en endelig online rensning skridt på beamline kræves for at minimere tiden mellem rensning og dataindsamling for at opnå den SAXS data bedst kvalitet. Afhængigt af de biofysiske egenskaber af proteinet af interesse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS blive valgt til at opnå optimal prøve kvalitet. Her, på et protein-konstruktion afledt af helicase / primase D5, er begge teknikker forklaret og diskuteret.
Erhvervelse af SEC-SAXS data bliver mere og mere standardiseret og er tilgængelig på mange BioSAXS beamlines. Dataanalyse, især baggrund subtraktion, er forholdsvis ligetil og nemt. Men en stabil puffer signalog en tilstrækkelig adskillelse af de makromolekylære arter fortsat vigtigt. Derfor er det afgørende at reservere tilstrækkelig tid til at ækvilibrere søjlen grundigt. Svigt af denne metode kan skyldes persistente forureninger af lignende størrelse til proteinet af interesse, lave koncentrationer, og strålingsfølsomme buffere.
I praksis indledningsvist, SEC-SAXS er forventes anvendt som den foretrukne metode til de fleste makromolekylære prøver. Stadig, mange oprensningsprotokoller kræve en forudgående IEC trin på grund af tilstedeværelsen af forurenende stoffer eller aggregering. I betragtning af, at hver koncentration og kromatografi trin er forbundet med tab af prøve (anslået til 30-50%) og tid, direkte IEC-SAXS er fordelagtig. For prøver, der ikke kan renses ved SEC, det være sig på grund af tilstedeværelsen af samme størrelse "forureninger", eller fordi de er alvorlig aggregat ved de nødvendige koncentrationer, ville IEC-SAXS altid være lige velegnet fremgangsmåde. Også, støttet de højere flowhastighederaf mange IEC kolonner kan bidrage til at reducere transittiden mellem rensning og måling. I eksemplet præsenteret her, blev IEC bruges med en trinvis eluering, hvilket giver mulighed for adskillelse af de tætte toppe af D5 323-785 fra kontaminanter ved omhyggeligt at vælge saltkoncentrationen trin. I princippet er antallet af trin er ubegrænset, men praktisk er mindst 1 trin pr peak påkrævet, og ikke for mange bør vælges. For baggrundssubtraktion beskrevet ovenfor, er det vigtigt at kunne måle et relativt stort antal af forskellige buffer-sammensætninger for at finde den matchende en.
En delt ulempe ved begge teknikker er manglen på præcise oplysninger proteinkoncentration. På grund af dette, præcis masse bestemmelse baseret på forward spredning er ikke mulig. For kugleformede proteiner såsom D5 323-785, den Porod volumen giver et alternativ, om end mindre præcise, masse skøn, men for meget fleksible eller uordnede proteinerVille denne fremgangsmåde ikke være gyldig.
En variation af den trinvise gradient IEC-SAXS metode præsenteres her er anvendelsen af en lineær gradient i stedet. Selv om det er muligt at arbejde med så mange trin, som ønskes at isolere sub-toppe under anvendelse af en trinvis eluering i lineær gradient tilgang, er det nødvendigt at optimere gradientbetingelserne omhyggeligt for at adskille toppene helt før start af SAXS eksperiment. Baggrund subtraktion i denne tilgang kunne gøres frame-klog og kunne verificeres ved en sammenligning af de enkelte frames, men det kræver mere avanceret data håndtering, og en dedikeret software findes ikke endnu.
Valget af en egnet kolonne er kritisk for begge teknikker, eftersom den måler adskillelsen af de makromolekylære arter. Størrelsesudelukkelses-kolonner forskellige i lasteevnen, størrelsesområdet adskillelige makromolekyler, og opløsning, mens ionbyttersøjler variere i form og densitetenaf deres immobiliserede afgifter.
Mens den protokol, der præsenteres her er specifik for ESRF beamline BM29, tilpasning til enhver anden SAXS beamline er i princippet ligetil. De vigtigste krav er en tilstrækkelig høj X-ray flux og en egnet detektor (ideelt enkelt-foton-tælling), at erhverve rimelige signal-til-støj-data i området fra sekunder eller mindre, og et online væskekromatografi system, der kan skabe gradienter. Den nøjagtige implementering vil naturligvis afhænge af den lokale beamline miljø.
De opnåede på D5 323-785 ved hjælp af de to metoder resultater afvige lidt. Den inertiradius er lidt mindre for IEC data end for SEC-data, og den lokale minima af spredningen kurven forskydes til lidt større sprednings- vektorer. Dette betyder, at D5 323-785 målt med IEC-SAXS er lidt mere kompakt end D5 323-785 målt med SEC-SAXS. Dette kan be på grund af forskelle i prøveforberedelse, i tiden mellem rensning og måling (IEC er hurtigere), eller, mindre sandsynligt, at et forurenende stof i SEC-renset prøve. Perlen modeller opnået helt uafhængigt med begge metoder er sammenlignelige (Figur 1 H). D5 323-785 viser den forventede hule, hexamere struktur 18.
Afslutningsvis online ionbytning og online gelpermeationskromatografi er vigtige biokemiske oprensningsmetoder, som kan kobles direkte til SAXS 6,7,9-12,25,26. Baggrunden fratrækning af IEC-SAXS data er lidt sværere og tvetydig end for SEC-SAXS, men det er ikke desto mindre muligt. Afhængigt af de biofysiske egenskaber af proteinet af interesse, både SEC og IEC-SAXS muliggøre optimering af separation arter med iboende fordele. Forudsat, at validering trin (som beskrevet) er korrekt observeret, kan de resulterende data analyseres with tillid, og modeller kan bestemmes ved hjælp af standard værktøjer til rådighed i samfundet. Sammen begge teknikker tillader online adskillelse for en bred vifte af biologiske makromolekyler, hvilket giver data ikke tilgængelige via standard statiske målinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol [DTT] | Euromedex | EU0006-B | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel | Biorad | 4561033 | |
| 2x Phusion Flash PCR Master Mix | ThermoFisher scientific | F 548 | |
| acetic acid glacial | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20104.298 | |
| Agarose D-5 | Euromedex | LF45130653 | |
| Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K | Millipore Ltd | UFC903024 | |
| Ampicillin sodium salt | Euromedex | EU0400-D | |
| Benzonase | Novagene | 70750-3 | |
| bromophenol blue | MERCK | 8122 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11231400 | |
| Econo-Pac 10 DG Desalting column | Bio-rad | 732-2010 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Glycerol | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 24388.295 | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405-C | |
| HindIII | Roche | 656313 | |
| HisSelect HF Nickel Affinity Gel | Sigma | H0537 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20252.295 | |
| Imidazole | AppliChem Panreac | A1073,0500 | |
| InstantBlue | Expedeon | ISB1L | |
| LB broth Miller | Fluka Analytical | L3152 | |
| MgCl2 | ICN Biomedicals Inc. | 191421 | |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| NcoI | Fermentas | ER0571 | |
| One Shot BL21 Star (DE3) | ThermoFisher scientific | C6010-03 | |
| pProEx HTb vector | Addgene | 10711018 | |
| Primer | Eurofins mwg operon | ||
| QIAprep Spin Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAquick PCR purification kid | QIAGEN | 28106 | |
| SDS | Sigma | 75746 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen life technology | S33102 | |
| T4 ligase | ThermoFisher scientific | EL0011 | |
| TEV | home made | ||
| TOP 10 | Invitrogen life technology | C404003 | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Uno Q 1R column | Bio-rad | 720 0011 | |
| β-mercaptoethanol | MPBiomedicals, LLC | 194834 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| Camserver software | Dectris | n.a. | detector control software |
| DAMAVER | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to align ab initio models |
| DAMMIF | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | ab initio model reconstruction program |
| HPLC program Biologic Duo Flow | Bio-rad | ||
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| PRIMUS | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program, which performs the manipulation with experimental SAXS |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | https://www.pymol.org/ | software for visualization |
| SUPCOMB | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to superimpose 3D structures |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioLogic Duo Flow | Biorad | ||
| BioLogic Biofrac Fraction collector | Biorad | ||
| HPLC system | Shimadzu | ||
| Labsonic P | Sartorius Stedim biotech | BBI8535108 |
References
- Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
- Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
- Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
- Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
- Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
- Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
- Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
- Selkirk, C.
- Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
- Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
- Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
- Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
- Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
- Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
- Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
- Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
- Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
- Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
- Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).
