Summary
De bepaling van de oplossing structuur van een eiwit door kleine hoek röntgen verstrooiing (SAXS) vereist monodisperse monsters. Hier presenteren we twee mogelijkheden te verzekeren minimale vertragingen tussen monstervoorbereiding en data acquisitie: online size-exclusion chromatography (SEC) en online ionenuitwisselingschromatografie (IEC).
Abstract
Biologische kleine hoek röntgen verstrooiing (BioSAXS) is een krachtige techniek moleculaire en structurele biologie gebruikt oplossingsstructuur, grootte en vorm deeltjesgrootte en oppervlak-tot-volumeverhouding van macromoleculen te bepalen. De techniek is toepasbaar op een breed scala van oplossingsomstandigheden spanning een breed bereik van concentraties, pH, ionische sterkte, temperatuur, additieven, enz., Maar het monster vereist monodispers zijn. Deze waarschuwing heeft geleid tot de uitvoering van vloeistofchromatografie systemen op SAXS beamlines. Hier beschrijven we de stroomopwaartse integratie van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en ionenuitwisselingschromatografie (IEC) een bundellijn verschillende werkwijzen voor optimale achtergrond aftrek en gegevensreductie. Als voorbeeld beschrijven we hoe we SEC- en IEC-SAXS op een fragment van de essentiële vaccinia virus eiwit D5, bestaande uit een D5N helicase domein. We bepalen de algehele vorm en moleculair gewicht, die de hexamere structuur van the eiwit.
Introduction
BioSAXS is een krachtig hulpmiddel om de vorm van nano-sized objecten 1-4 te bepalen. De verstrooiing van röntgenstraling door een oplossing met macromoleculen, grootte in het nm wordt opgenomen bij zeer lage hoeken. Dit hoekbereik bevat informatie over globale parameters: de straal van winding; de grootste intraparticle afstand; het deeltje vorm; en de mate van vouwen, denaturatie of aandoening. De techniek is niet vereist kristallen, en het macromolecuul in oplossing blijft en dus in bepaalde omstandigheden nabootsen belangrijke parameters van de cel, zoals ionsterkte, pH, enz. De kennis van deze elementen gehouden kunnen helpen om, bijvoorbeeld, de fysiologisch relevante oligomere toestand van een eiwit van belang of om een voorgestelde model van een complex te valideren. De karakterisering van proteïne-proteïne interacties in verschillende bufferomstandigheden, het creëren van modellen ontbrekende domeinen, de verfijning van homologie modellen en debeëindiging van discrete gevouwen en ontvouwen toestanden kunnen snel en eenvoudig 5 worden uitgevoerd.
Zoals met elke techniek, BioSAXS intrinsieke tekortkomingen: geaggregeerde of gedenatureerde monsters, mengsels van deeltjes, heterogene monsters, stralingsschade en buffer mismatches kan leiden tot niet-interpreteerbare gegevens. Voor veel analysemethoden wordt impliciet aangenomen dat het monster monodisperse, een vereiste dat vaak moeilijk te verkrijgen in de praktijk. In veel gevallen, de afbraak van het monster is subtiel en kan niet in de gegevens op zichzelf worden gedetecteerd en elke poging om de gegevens te interpreteren geeft onnauwkeurige of misleidende resultaten. Om deze hindernissen te overwinnen, de combinatie van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en SAXS werd uitgevoerd op vele bundellijnen datakwaliteit te waarborgen en deze techniek toegankelijker voor steeds moeilijker monsters 6-11 maken. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor het repertoire van ontwikkeling online ionenuitwisselingchromatografie (IEC) -gekoppelde SAXS 12. Beide technieken zijn het openen van SAX om een breed scala van biologische deeltjes die vroeger onmogelijk te analyseren. De keuze van de methode om te gebruiken is afhankelijk van de biofysische eigenschappen van de deeltjes van belang.
SEC scheidt macromoleculen door hun omvang, waarbij ten minste 10% verschil in schijnbare molecuulmassa nodig voor de scheiding. Fysieke beperkingen van de kolom en fysiologische eigenschappen van de monsters, zoals hydrofobe oppervlakken, flexibiliteit, en het gebrek aan stabiliteit, ook bemoeilijken het verzamelen van gegevens, analyse en interpretatie.
Ionenuitwisselingschromatografie, welke moleculen op basis van hun lading te scheiden, dus hun bindingsaffiniteit aan de kolom IEC, kan worden gebruikt in plaats van of naast SEC. De totale lading kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door het veranderen van de pH of het variëren van de zoutconcentratie van de buffer, voor een relatief eenvoudige werkwijze voor de gecontroleerde elution van de moleculen van de kolom IEC. Via de lading, de scheiding van soortgelijke en groottes van moleculen die anders moeilijk te scheiden zou kunnen worden routinematig uitgevoerd IEC. Bovendien IEC heeft het voordeel te kunnen gaan met verdunde monsters, zodat men de concentratiestappen, waarbij het potentiële risico van denatureren van het eiwit dragen voorkomen. Helaas, als de ladingsverdeling sterk sample-afhankelijke, IEC vereist optimalisatie met betrekking tot de pH en zoutconcentraties 13,14.
Voor veel proteïnen die moeilijk uit te drukken, zuiveren, of beide, slechts geringe hoeveelheden monster beschikbaar te bestuderen. Het is van belang efficiënt en het aantal zuiveringsstappen de verliezen te minimaliseren en derhalve. Daarom is de laatste zuiveringsstap online direct vóór SAXS data acquisitie, teneinde de waarschijnlijkheid van het verzamelen van een goede dataset verhogen.
HierPresenteren wij en vergelijk online SEC-SAX en IEC-SAXS. Beide technieken werden uitgevoerd op BioSAXS bundellijn BM29 aan de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankrijk 15. Als een test case, gebruikten we de D5N en helicase domein van de vaccinia virus eiwit D5, die vrij moeilijk te analyseren structureel met andere methoden was. De vaccinia virus is een lid van de familie Poxviridae en is 98% identiek aan het variolavirus, de oorzaak van pokken. Met behulp van de vaccinia-systeem, bestuderen we de replicatie machines, met de nadruk hier op de essentiële helicase-primase D5.
D5 is een 95-kDa eiwit met een N-terminale archeo-eukaryote primase (AEP) domein 16 gevolgd door een cysteïne clustergebied (res. 240-345) 16. Verder naar de C-terminus heeft een D5N domein (res. 340-460), die altijd geassocieerd met D5-type helicasen, en tenslotte een superfamilie 3 (SF3) helicasedomein (res. 460-785) 17 (Figure 1A). De helicase domein van D5 bouwt een hexamere ringstructuur die nodig is voor sterke binding aan DNA. Dankzij de recente SAX en EM-studies, worden de lage resolutie structuren van de primase en de helicase domeinen nu bekend 18.
Hier laten we zien hoe de geïmplementeerde online chromatografie technieken te gebruiken op de BioSAXS bundellijn BM29 bij ESRF om inzicht te krijgen in de structuur van het C-terminale fragment (residu 323-785) van D5.
Protocol
1. Beschrijving van het Offline Voorbereiding en Sample Genereren van een D5 Schrapping Protein
OPMERKING: De D5 323-785 construct (Figuur 1A) werd gekloneerd, tot expressie gebracht en gezuiverd zoals beschreven 18.
- Kloon het construct in de pProEx HTB vector
- Uitvoeren van een polymerasekettingreactie (PCR) op D5R met de 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'en 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' primers en PCR reactiemengsel met polymerase op advies van de fabrikant.
- Zuiveren de PCR-fragmenten via spin-kolommen, na advies van de fabrikant.
- Digest de PCR-fragmenten en plasmide met NcoI en HindIII restrictie-enzymen, de aanbevelingen van de fabrikant voor buffersamenstelling en incubatietijd.
- Run de fragmenten op een 1% agarosegel in 0,5 x TAE buffer (20 mM Tris, 10 mM azijnzuur,en 0,5 mM EDTA) en vlekken op de gel met DNA kleurstof.
- Expose de gel aan UV-licht.
Let op: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen! Knip de banden van de gedigereerde PCR-fragmenten en de gedigereerde plasmide en zuiveren van het DNA met een gelzuivering spinkolom kit, de aanbevelingen van de fabrikant. - Ligeren van de gezuiverde PCR-fragmenten in de plasmide met een snelle ligatiekit, de aanbevelingen van de fabrikant.
- Transformeren via heat shock het product uit de ligatiereactie in competente bacteriën geoptimaliseerd voor plasmide versterking.
- Voeg de helft van het ligatieproduct een flesje bacteriën.
- Incubeer de reactiebuis op ijs gedurende 20 min.
- Incubeer de buis bij 42 ° C gedurende 30 s.
- Plaats de buis op ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg 1 ml Luria Bertani (LB) bouillon (Miller) zonder antibiotica en liet de cellen herstellen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Spin down de cellen op 16.100 xg for 3 s in een tafelblad microbuis centrifuge en verwijder het grootste deel van het medium.
- Spreid de cellen op een LB agar plaat met ampicilline (50 ug / ml eind) en laat de kolonies groeien bij 37 ° C overnacht.
- Liep kolonie in 3 ml LB met ampicilline (50 ug / ml eind) en de kweek groeien bij 37 ° C, onder schudden bij 160 rpm overnacht.
- Volg de instructies van de miniprep kit om het plasmide te halen.
- ! Een monster van het plasmide voor het rangschikken en de sequentie voor de afwezigheid van mutaties en de juiste insertie analyseren.
- Transformeer de pProEx HTB D5 323-785 construct in bacteriën geoptimaliseerd voor eiwitexpressie (gebruik 1 pl en volg de stappen in stap 1.1.7). Spreid de bacteriën op een LB-agar plaat met ampicilline (50 ug / ml eind).
- Een beginnend cultuur te creëren, zet een kolonie in 300 ml LB met ampicilline (50 ug / ml eind) en de bacteriën groeien bij 37 ° C, onder schudden bij 160 ruur 's nachts.
- Inoculeren 12 x 1 liter LB in de aanwezigheid van ampicilline (50 ug / ml eind), elk met 20 ml van de pProEx HTB D5 323-785 bacteriën startercultuur bij 37 ° C totdat een OD 600 = 0,3 is bereikt. Verlaag de temperatuur tot 18 ° C en expressie induceren bij een OD 600 = 0,5 met 1 mM IPTG. Incubeer de culturen te schudden bij 160 rpm en 18 ° C.
- Oogst de bacteriën door centrifugatie bij 50.000 xg en 4 ° C gedurende 30 minuten. Resuspendeer de bacteriële pellets in ongeveer 150 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM β-mercaptoethanol en 10% glycerol) met 1x proteaseremmer en 25 eenheden ( U) / 10 ml DNase. Lyse de bacteriën via sonicatie op ijs (1-inch probe, 50% vermogen, 0,5-s pulse, 0,5-s pauze, 3x 5 min).
- Laad de bovenstaande vloeistof op een nikkel-affiniteitskolom (Ni-kolom, 1,5 ml bed volume), en was het met 10 kolomvolumes (CV) van binding buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol en 10% glycerol), 10 CV wasbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol en 10% glycerol) en 10 CV imidazool was (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol en 30 mM imidazool). Elueer het D5 323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol en 200 mM imidazool).
- Inspecteer de verschillende zuiveringsstappen via natriumdodecylsulfaat (SDS) -polyacrylamide gelelectroforese (PAGE).
- Belasting 2-20 pi van elke zuiveringsstap doorstroomkanaal gemengd met 1 x ladingskleurstof (2x: 4% SDS, 20% glycerol, 120 mM Tris-HCl [pH 6,8] en 0,02% gewicht / volume broomfenol blauw) op een 10 % SDS gel of activeert bij 200 V in 1 x Laemmli loopbuffer (25 mM Tris, 0,192 M glycine, en 0,1% SDS).
- Vlekken op de gel met een kant-en-klare Coomassie blauwe oplossing.
- exchange de buffer van de geëlueerde eiwit met bindingsbuffer met een ontzoutingskolom volgens de handleiding van de fabrikant.
- Klieven His-tag door toevoeging Tobacco Etch Virus nucleaire inclusie-a endopeptidase (TEV, 1 mg / 100 mg eiwit) aan de eiwitoplossing. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur.
- Controleer de spijsvertering door het uitvoeren van SDS-PAGE (zie stap 1.5)
- Equilibreren de Ni-kolom in bindingsbuffer. Laat de eiwitoplossing passeren en was de kralen met 2 CV imidazool wasbuffer terwijl het verzamelen van het doorstroomkanaal.
- Concentreer het eiwit met een centrifugale concentrator tot een eindvolume van 0,5 ml.
- Spuit de geconcentreerde proteïneoplossing op een grootte-uitsluiting kolom geëquilibreerd met de gelfiltratie buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glycerol en 1 mM dithiothreitol [DTT]).
- Verzamel het doorstroomkanaal in 0,5 ml fracties.
- Controleer de aanwezigheid en de zuiverheid van het eiwit in de monsters van piekhet uitvoeren van SDS-PAGE (zie stap 1.5).
- Combineer de fracties van de geëlueerde piek van D5 323-785. Verdun het monster tot 25 mM NaCl en 5% glycerol terwijl de Tris en DTT-concentraties constant (5 ml eiwitoplossing in 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glycerol en 1 mM DTT, eerste 5 ml toe van 20 mM Tris-HCl [pH 7] en 1 mM DTT en voeg 20 ml 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% glycerol en 1 mM DTT).
- Laad het monster op een ionenuitwisselingskolom. Gebruik buffer A (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% glycerol en 1 mM DTT) en buffer B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl, 5% glycerol en 1 mM DTT) een zout gradiënt van 25 mM tot 1 M. vormen
- Verzamel de geëlueerde eiwit in 1,5 ml fracties.
- Controleer de aanwezigheid en de zuiverheid van het eiwit in de piek monsters door het uitvoeren van SDS-PAGE (zie stap 1,5 en Figuur 1B)
- Reconcentrate de eiwitoplossing in een centrifugale concentrator tot een eindvolume van 0,5 ml.
- Rerun het geconcentreerde eiwit op grootte-uitsluiting kolom gelfiltratie buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5% glycerol en 1 mM DTT, zie stap 1.11).
2. Data Collection
LET OP: Request bundeltijd zo vroeg mogelijk. Voor ESRF, kunnen richtsnoeren voor de types beschikbaar toegang en over hoe een aanvraag in te dienen te vinden op:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Na de aanvaarding van het voorstel en een uitnodiging voor het experiment, alle deelnemers moeten een veiligheid opleiding te voltooien. Na validatie van de training, vul dan de "A-vorm" (via de ESRF gebruiker portal) de onderzoekers een bezoek aan de bundellijn voor het experiment, samen met de vereiste informatie de veiligheid op de monsters te verklaren. Neem contact op met de lokale contactpersoon om het experiment te bespreken.
- SEC-SAXS dataverzameling
LET OP: Voor ONLine zuivering Gebruik de High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) systeem geïnstalleerd BM29. Het systeem bestaat uit een in-line ontgasser, een binaire pomp, een klep voor selectie buffer en hellingen, een autosampler, een UV-VIS matrix fotospectrometer en een geleidbaarheidsmeter. Het is direct aan het doorstroomkanaal capillaire van de belichtingseenheid 19 SAXS.- Zet 1 ml van de gelfiltratie buffer opzij. Sluit de buffer fles naar de SEC-systeem (standaard is poort A).
- Kies de stroomsnelheid afhankelijk van de kolom in gebruik. Opmerking: Voor de grootte-uitsluitingskolom hier gebruikt, de stromingssnelheid 0,1 ml / min. Bepaal de maximale druk voor de kolom, nemen nota van de tegendruk, en stel de overname tijd om ten minste 1,2 CV.
- Spoel de pompen en de upstream-buizen via de functie "auto-zuivering".
- Wacht tot het systeem is gevuld met de buffer en sluit de kolom. Equilibreren van de kolom door het passeren van tenminste 1,5 CV.
- in elkaar grijpenhet hok en meet de braaklegging in stap 2.1.1 buffer, met behulp van het monster-wisselaar te controleren voor variatie van het signaal als gevolg van stralingsschade. Alleen doorgaan als er geen stralingsschade aan de buffer.
- Schakel de bundellijn controlesysteem om HPLC-modus. Maak een proefrit van de buffer, het verzamelen van 200 frames met 1 s per frame. Noteer het aantal tellingen gegeven door de detector in de opgetelde intensiteit plot.
LET OP: Het signaal moet de eerder gemeten buffer te passen, en de opgetelde intensiteit na verloop van tijd moet constant blijven. Als het signaal niet overeenkomt of niet constant is, is een langere evenwichtsinstelling van het systeem vereist. - Spin down het monster bij 13.000 xg in een tafelblad centrifuge microbuis gedurende ten minste 10 min.
- Vul het monster in een HPLC-compatibele glazen flesje (meegeleverd) en zet hem in de auto-injector. Let op de goede positie.
- Interlock de experimentele hok met behulp van standaard procedure, zoals beschreven in de User Safety Training.
- Log in en maak een map voor de opslag van gegevens door de bundellijn besturingssoftware.
- Programmeer het HPLC-systeem met behulp van de "quick charge" -functie. Stel de opslaglocatie voor de UV-gegevens naar de map die u in stap 2.1.10. Zorg ervoor dat de automatische ASCII conversie van de UV-data te activeren, het opslaan van de ASCII-bestand in dezelfde map.
- Kies het geïnjecteerde volume en goed stand. Voeg de meting in de rij door op de knop "Start". De software zal vragen om de partij op te slaan. Bereid je voor op het opslaan, maar niet op de knop "Opslaan", omdat dit de meting wordt automatisch gestart.
- Het opzetten van het verzamelen van gegevens parameters in de bundellijn besturingssoftware. Kies het aantal frames, zodat de totale verzameling van gegevens is de tijd iets meer zijn dan de acquisitie tijd gedefinieerd in stap 2.1.2.
- Open de veiligheid sluiter en beginnen SAXS het verzamelen van gegevens met behulp van de bundellijn besturingssoftware. Controleer of de gegevens correct verworven. Vergelijk de nieuw verzamelde gegevens om de in fase 2.1.6 data en controleer of het aantal tellingen in de gesommeerde intensiteit constant blijft gedurende ten minste 100 frames en overeenkomt met de waarde uit stap 2.1.6.
- Start de SEC gerund door op de knop "Opslaan", zoals bereid in stap 2.1.11, en noteer het framenummer weergegeven in het camserver software als de injectie is voltooid en UV data-acquisitie begint.
- Na het verzamelen van gegevens, opent u de ISPyB databank 20 bij Open het tabblad 'data-acquisitie "en druk op de" Go "knop om toegang te krijgen tot de dataset en de resultaten van de automatische analyse 21.
- IEC-SAXS dataverzameling
Opmerking: In plaats van de continue lineaire gradiënt gewoonlijk toegepast in IEC experimenten gebruikt een stapsgewijze gradiënt, waarbij de hoeveelheid buffer B wordt verhoogd in vooraf ingestelde afzonderlijke stappen.- Maak de HPLC-programma voor een sample-free buffer run. Programmeer een stapsgewijze gradiënt vanaf 0% buffer B en steeg met 5 procentpunten na twee CV tot 100% van de buffer B wordt bereikt.
- Doe wat van elke buffer opzij. Sluit de fles met de low-salt buffer A naar poort A en degene met de hoge zout buffer B poort B.
- Kies de stroomsnelheid en blijven onder de drukgrens van de kolom (in dit voorbeeld, 1 ml / min).
- Net als in stap 2.1.3, spoel de pompen en de stroomopwaartse buis met behulp van de functie "auto-zuivering".
- Evenwicht van het systeem in de lage-zout buffer A (zie stap 1.15) en sluit de kolom ion-uitwisseling. Wacht tot de kolom volledig geëquilibreerd (tenminste 1,5 CV).
- Gebruik de middelen die buffer in stap 2.2.2 om buffers A en B te onderzoeken voor stralingsschade het gebruik van de sample-wisselaar, zoals in stap 2.1.5.
- Controleer de buffer uit de kolom, zoals in stap 2.1.6. Vergelijk het signaal het signaal buffer A die in stap 2.2.6. Merk opnieuw op deaantal tellingen in de opgetelde intensiteit plot.
- Maak een map voor data-opslag voor de buffer run.
- Het opzetten van het verzamelen van gegevens in de HPLC-systeem-modus. Kies het aantal frames, zodat de totale dataverzameling keer groter is dan de totale tijd van de IEC-run (zie stap 2.2.1).
- Open de veiligheid sluiter en begint het verzamelen van gegevens SAXS. Controleer of het correct verloopt en double-check dat de opgetelde intensiteit constant op de waarde genoteerd in stap 2.2.7 voor ten minste 100 frames blijft.
- Gebruik de "Single Run" kenmerk van de HPLC-software en start de stapsgewijze gradiënt geprogrammeerd in stap 2.2.1. Voor de injectie Stel de flacon getal -1 om geen sample injecteren in deze stap. Noteer het aantal frames verworven als het programma start.
- Maak de HPLC-programma voor de steekproef run. Programmeer een stapsgewijze gradiënt vanaf 0% buffer B. Schatting het percentage buffer B bij elke piek offline gemeten in stap 1.1.5 (
- Spin down het monster bij 13.000 xg in een tafelblad centrifuge microbuis gedurende ten minste 10 min.
- Verdun D5 323-785 in de zoutconcentratie van buffer A (25 mM) door het te mengen met 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% glycerol en 1 mM DTT.
- handmatig laden van het monster op de kolom. Zet de buffer A aanvoerslang in het verdunde monster na de onderbreking de pompen om de vorming van luchtbellen te vermijden. Kolom los van de detectoren naar de doorstroom van de kolom direct verzamelen.
- Wanneer de monsterhouder is bijna leeg terug de aanvoerslang in buffer A (nogmaals te pauzeren pompen tijdens het verplaatsen van de buis) en de pompen met buffer A opnieuw om het monster te brengen van de slang aan de kolom. Zodra het gehele monster is geweestgeladen, passeert 2 CV van buffer A, en sluit de kolom aan de detectoren.
- Voor het monster run, maakt u een map voor de opslag van gegevens.
- Open de veiligheid sluiter en begint het verzamelen van gegevens SAXS. Controleer of het verzamelen van gegevens correct verloopt en double-check dat de opgetelde intensiteit constant op de waarde genoteerd in stap 2.2.7 voor ten minste 100 frames blijft.
- Gebruik de "Single Run" kenmerk van de HPLC-software om de stapsgewijze gradiënt geprogrammeerd in stap 2.2.12 te starten. Voor de injectie Stel de flacon getal -1 om geen sample injecteren in deze stap. Noteer het aantal frames verworven als het programma start.
- Open "data-acquisitie" in ISPyB 20 en druk op "Go" om te kijken naar de dataset en de automatische analyse 21.
- Exporteer de UV-gegevens van het HPLC-systeem naar ASCII-formaat via de "Postrun Analysis" software.
3.SEC-SAXS data Reduction & Analysis
- Open de gegevens in data-acquisitie in ISPyB door op de "Go" knop. Bepaal in het overzicht welke frames van de SAXS verzamelen van gegevens komen overeen met de elutiepiek. Controleer of de gyrostraal is stabiel tijdens de piek.
- Controleer of de geautomatiseerde buffer correctie correct werd uitgevoerd. Laad kaders van het centrale deel van de piek in een programma dat manipulaties uitvoert met experimentele SAX gegevensbestanden 22 en hiervan het gemiddelde. Vervolgens plaatst u het automatisch gegenereerde buffer bestand en controleer of de hoge Q regio's van de gemiddelde frames en de buffer frames wedstrijd.
- Vergelijk de frames verworven gedurende de piek kwantitatief met behulp van de CORMAP-test 23.
- Laad het automatisch aangemaakt aftrekkingen (* _sub.dat bestanden) van frames voor de regio van belang.
- Schaal ze met elkaar door te drukken op de "Scale" knop.
- Compare ze met behulp van de "Data Vergelijking" -functie. Er mogen geen systematische verschillen tussen de frames gedurende de piek.
- Open alle * -_ sub.dat frames van belang, voeg ze samen met de "Merge" -knop, en sla het samengevoegde bestand in .dat formaat.
- Bepaal de gyrostraal met de "gyrostraal" tool in het programma, wijzend op de eerste data punt in het Guinier bereik voor later bijsnijden van de gegevens met een lage resolutie.
- Bepaal de pair-afstand distributie functie met de "Afstand Distribution" tool in het programma en sla het resulterende .out bestand als gnom.out.
4. Ab Initio Modeling
- Op een Unix-machine, lopen een 40 x ab initio model reconstructie programma zonder symmetrie beperkingen. Maak een nieuwe map en kopieer de gnom.out bestand om het. Start het programma als volgt:
voor ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i; deen - Analoog, uitvoeren van een ab initio model wederopbouwprogramma met symmetrie beperkingen voor het zesvoudige symmetrie in een tweede map:
voor ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; gedaan - Lijn alle ab initio model wederopbouwprogramma output bestanden (* -1.pdb). In de twee mappen uit stappen 4.1 en 4.2, lopen damaver -a * -1.pdb.
- Open de vereniging van alle modellen (damaver.pdb) en het model gefiltreerd om het juiste volume (damfilt.pdb) in een geschikt moleculair visualisatiesoftware 26 en te vergelijken.
- Open het damsel.log bestand in een teksteditor. Het model vermeld als het "referentie" aan het einde van het bestand is het meest representatieve model.
5. IEC-SAXS gegevens Reduction, analyse en modellering
- In het programma dat de manipulatie uitvoert experimentele SAX databestanden 22, laadt ongeveer 50 frames SAX van elke mengstap van dede buffer run, druk op de "gemiddelde" knop, en de resultaten opslaan.
- Op basis van de automatische verwerking van de resultaten beschikbaar via ISPyB, identificeren welke kaders van het experiment komen overeen met de elutie van het eiwit en controleer of de (voorlopige) gyrostraal is stabiel tijdens de piek.
- Laad de frames in de experimentele SAXS databestanden manipuleren programma 22 en het gemiddelde van hen, zoals voor het buffer frames (zie stap 5.1). Vervolgens laadt de buffer bestanden die in stap 5.1 en vergelijk de hoge Q regio's (boven 4,2 nm -1) om een buffer die overeenkomt met het gemiddelde van de piek te vinden.
NB: Er mag geen systematische verschuiving tussen het gemiddelde van de piek en de buffer zijn. Indien het monster curve lijkt te vallen tussen twee krommen buffer, interpoleren hun bochten door het gemiddelde. - Trek de buffer geïdentificeerd als de beste match van het gemiddelde verstrooiing curve van de piek fractie en sla de resulterende subtrgehandeld bestand. Bovendien maken afgetrokken krommen berekenen van de gemiddelde buffer curven van de voorafgaande en volgende mengtrappen de foutenmarge van de aftrekking te schatten.
- Herhaal de stappen 5,3 en 5,4 individueel de linker- en rechterhelft van de piek en de resultaten vergelijkt met die van stap 5.4 te controleren op stabiliteit van het signaal gedurende de piek.
- Volg de stappen 3.5 en 3.6 voor alle drie afgetrokken curves uit stap 5.4.
- Vergelijk de resultaten voor alle drie curven afgetrokken.
Opmerking: Alleen resultaten die robuust blijven binnen de foutenmarge van de aftrek kan worden vertrouwd. - Voer modelleren zoals in de stappen 4.1 en 4.2 voor de beste aftrekken die in stap 5.3.
- Volg stap 4,3-4,5 om de modellen af te stemmen en de meest representatieve een te identificeren.
6. Vergelijking van de resultaten
- Voer een programma om 3D-structuren superponeren 12 op de representatieve modellen van de SEC (stap 4.5) eend IEC-SAX data (stap 5.9) met P6 symmetrie: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
- Importeer de model_sec.pdb en de model_iec-r.pdb in een moleculaire visualisatie software.
- Open de .fir dossiers van de modelsec.pdb en de modeliec-r.pdb in een spreadsheet en een 2D-grafiek van experimentele en berekende verstrooiing bochten.
Representative Results
De resultaten van de model-vrije invariante analyse zijn weergegeven in Tabel 1. De analyse van de D5 323-785 SEC-SAX gegevens toonden een molecuulmassa schatting (een Porod analyse) van 345 kDa versus 338 kDa waargenomen onder toepassing van IEC-SAXS. Beide zijn in overeenstemming met de verwachte massa van 6 keer 53,5 kDa (321 kDa) voor een hexameer. De ab initio modellering van beide datasets werd ondernomen zonder opgelegde symmetrie (SEC-SAX: χ 2 = 0,88, IEC-SAX: χ 2 = 3,1) en het gebruik van C6 symmetrie (SEC-SAX: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Aangezien de algemene fit voor de verstrooiing gegevens voor beide reconstructies zijn vergelijkbaar in beide gevallen (figuur 1D en E), kan worden aangenomen C6 symmetrie. Dus het model overeen met een hexagonale kegel-achtige structuur met een centraal kanaal, die gedeeltelijk belemmerd wordt (SEC Figuur 1F; IEC:
Figuur 1: SAX data analyse en vergelijking van D5 323 -785 (figuur aangepast van referenties 12 en 18). A) Schematische domeinstructuur van D5 eiwit en D5 323-785. B) Offline ionenwisseling chromatogram met de aanduiding van de drie pieken. Oranje curve: absorptie bij 280 nm (au), blauwe curve: percentage buffer B. Percentages buffer B bij de pieken zijn aangegeven. C) Online ionenwisseling chromatogram. Toets zoals in B. Bovendien is de gemeten intensiteit wordt groen aangegeven. De experimentele curve een verstrooiingnd berekende curve van de verkregen door SEC-SAXS D) en IEC E) data-analyse van de D5 323-785 model. F) Bead model van D5 323-785 gebaseerd op SEC data en G) IEC gegevens. H) Overlay van de SEC en IEC modellen. De panelen in F) tot H) werden gemaakt met behulp van een moleculaire visualisatie software 24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gegevensverzameling parameters | |
| Instrument: | ESRF BM29 |
| Golflengte (A) | 0.99 |
| Q-range (-1) | ,0032-,49 |
| Sample-to-detectorafstand | 2.864 m |
| tijdopname (sec) | 1 per frame |
| concentratiegebied | nvt |
| (K) | 293 |
| Detector | Pilatus 1M (Dectris) |
| Flux (fotonen / s) | 1 x 10 12 |
| Bundelbreedte (um 2) | 700 × 700 |
| Structurele parameters voor D5 323-785, SEC | |
| I 0 (cm -1) [Van Guinier] | 0,0237 |
| Rg (A) [van Guinier] | 48 |
| q min Rg - Qmax Rg gebruikt Guinier | 0,77-1,24 |
| Dmax (A) [P (r)] | 145 |
| q-range gebruikt voor p (r) (-1) | 0,02-0,17 |
| Porod volume V p (A3) [van Scatter] | (570 ± 5) × 10 3 |
| Moleculaire massa M r (kDa) [van V p] | 345 |
| Berekend monomeer heer van sequentie (kDa) | 321 |
| Structurele parameters voor D5 323-785, IEC | |
| I 0 (cm -1) [Van Guinier] | 0,386 |
| Rg (A) [van Guinier] | 46,5 ± 0,1 |
| q min Rg - Qmax Rg gebruikt Guinier | 0,44-1,29 |
| Dmax (A) [P (r)] | 120 |
| q-range gebruikt voor p (r) (-1) | 0,03-0,18 |
| Porod volume Vp (& #197; 3) [van Scatter] | (577 ± 5) × 10 3 |
| Moleculaire massa M r (kDa) [van V p] | 339 |
| Berekend hexameric heer van sequentie (kDa) | 321 |
Tabel 1: SAXS gegevensparameters. De tabel geeft een overzicht van de parameters van SAXS data-acquisitie en analyse.
Discussion
Voor veel macromoleculen, wordt een laatste zuiveringsstap met behulp van chromatografie vereist voor SAX het verzamelen van gegevens om een goede kwaliteit dataset te verkrijgen. Echter, niet alle monsters stabiel; zij kunnen gevoelig zijn voor aggregatie of opnieuw evenwicht zijn om een mengsel van oligomerisatie staten. Daarom is een laatste keer zuiveringsstap de bundellijn nodig is om de tijd tussen zuivering en gegevensverzameling minimaliseren om de beste kwaliteit SAXS gegevens. Afhankelijk van de biofysische eigenschappen van het eiwit van belang kunnen SEC-SAXS of IEC-SAX worden gekozen om een optimale kwaliteit van het monster te verkrijgen. Hier, op een eiwit construct afgeleid van de helicase / primase D5, beide technieken zijn toegelicht en besproken.
Overname van SEC-SAX data wordt steeds meer en meer gestandaardiseerd en is beschikbaar op veel BioSAXS beamlines. Gegevensanalyse name achtergrond aftrek, is relatief eenvoudig en gemakkelijk. Echter, een stabiele buffer signaalen de voldoende scheiding van de macromoleculaire soorten blijft essentieel. Daarom is het essentieel dat voldoende tijd voor de kolom grondig equilibreren reserveren. Falen van deze werkwijze kan het gevolg afbreekbare verontreinigingen van overeenkomstige grootte als het eiwit van belang, lage concentraties en stralingsgevoelige buffers.
In de praktijk aanvankelijk SEC-SAXS waarschijnlijk wordt gebruikt als de methode van keuze voor de meeste macromoleculaire monsters. Nog veel zuiveringsprotocollen een voorafgaande IEC-stap door de aanwezigheid van verontreinigingen of aggregatie. Aangezien elke concentratie en chromatografie stap gaat gepaard met verlies van monster (geschat op 30-50%) en de tijd direct IEC-SAXS gunstig. Voor monsters die niet kunnen worden gezuiverd door SEC, hetzij door de aanwezigheid van vergelijkbare grootte "contaminanten" of omdat ze sterk geaggregeerde onder voldoende concentraties IEC-SAXS zou altijd beter geschikt benadering. Verder ondersteund de hogere stroomsnelhedendoor vele IEC kolommen kunnen helpen de transittijd tussen zuivering en meting verminderen. In het hier gepresenteerde voorbeeld, werd gebruikt met een IEC stap elutie, waardoor de scheiding van de nauwe toppen van D5 323-785 van verontreinigingen door het zorgvuldig kiezen van de zoutconcentratie stappen. In principe is het aantal stappen is onbeperkt, maar praktisch wordt ten minste 1 stap per piek vereist, en niet te veel moet worden gekozen. Voor de achtergrond aftrek hierboven beschreven, is het cruciaal om een relatief groot aantal verschillende buffersamenstellingen meten om de overeenkomende vinden.
Een gemeenschappelijk nadeel van beide technieken is een onnauwkeurige eiwitconcentratie informatie. Als gevolg van deze nauwkeurige bepaling van de massa op basis van forward verstrooiing is niet mogelijk. Voor bolvormige eiwitten zoals D5 323-785, de Porod volume biedt een alternatief, zij het minder nauwkeurige, massa schatting, maar voor zeer flexibel of ontvouwen eiwittenDeze aanpak zou niet geldig zijn.
Een variatie van de stapsgewijze gradiënt IEC-SAX hier gepresenteerde methode is het gebruik van een lineaire gradiënt plaats. Hoewel het mogelijk is met zoveel stappen werken als gewenst sub-pieken te isoleren onder toepassing van een stapsgewijze elutie met lineaire gradiënt benadering, is het vereist om de gradiëntvoorwaarden zorgvuldig optimaliseren om de pieken te scheiden volledig alvorens de SAXS experiment. Achtergrond aftrekken in deze benadering kan worden gedaan frame wijs en kan worden gecontroleerd door de vergelijking van de afzonderlijke frames, maar het vereist meer geavanceerde verwerking van gegevens, en een speciale software bestaat nog niet.
De keuze van een geschikte kolom essentieel is voor beide technieken, zoals de scheiding van de macromoleculaire species bepaalt. Size-exclusiekolommen verschillen laadvermogen, het groottebereik scheidbare macromoleculen en resolutie, terwijl ionenuitwisselingskolommen verschillen in de aard en de dichtheidhun geïmmobiliseerd kosten.
Terwijl de hier gepresenteerde protocol beschrijft het ESRF bundellijn BM29, aanpassing aan andere SAXS bundellijn is in principe eenvoudig. De belangrijkste eisen zijn een voldoende hoge röntgenstralen flux en een geschikte detector (idealiter enkel-foton-counting), redelijke signaal-geluidsgegevens te verkrijgen in het traject van seconden of minder, en een online Vloeistofchromatografiesysteem staat het creëren hellingen. De precieze uitvoering zal uiteraard afhangen van de lokale omgeving bundellijn.
De verkregen op D5 323-785 met behulp van de twee methoden resultaten verschillen enigszins. De gyrostraal iets kleiner voor de IEC gegevens dan de SEC data en de lokale minima van de verstrooiing curve verschoven iets grotere verstrooiing vectoren. Dit betekent dat de D5 323-785 gemeten IEC-SAX iets compacter dan D5 323-785 gemeten met SEC-SAXS. Dit kan be gevolg van verschillen in de monsterbereiding, de tijd tussen zuivering en meting (IEC sneller), of, minder vaak, een verontreiniging in de SEC-gezuiverde monster. De kraal modellen verkregen volledig zelfstandig met beide methoden vergelijkbaar (Figuur 1H). D5 323-785 toont de verwachte holle, hexamere structuur 18.
Concluderend online ionenuitwisseling en online size-exclusiechromatografie belangrijke biochemische zuiveringswerkwijzen die direct SAX 6,7,9-12,25,26 kunnen worden gekoppeld. De achtergrond aftrek van IEC-SAX data is iets moeilijker en dubbelzinnige dan SEC-SAXS, maar is het toch mogelijk. Afhankelijk van de biofysische eigenschappen van het eiwit van belang, zowel SEC en IEC-SAXS oog op het optimaliseren van soorten scheiding met inherente voordelen. Mits de validatiestappen (zoals beschreven) correct worden waargenomen, kan de verkregen data te analyseren with vertrouwen en modellen kan worden bepaald met behulp van de standaard beschikbare instrumenten binnen de gemeenschap. Samen, beide technieken mogelijk online scheiding voor een breed scala van biologische macromoleculen, waardoor gegevens niet toegankelijk zijn via standaard statische metingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol [DTT] | Euromedex | EU0006-B | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel | Biorad | 4561033 | |
| 2x Phusion Flash PCR Master Mix | ThermoFisher scientific | F 548 | |
| acetic acid glacial | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20104.298 | |
| Agarose D-5 | Euromedex | LF45130653 | |
| Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K | Millipore Ltd | UFC903024 | |
| Ampicillin sodium salt | Euromedex | EU0400-D | |
| Benzonase | Novagene | 70750-3 | |
| bromophenol blue | MERCK | 8122 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11231400 | |
| Econo-Pac 10 DG Desalting column | Bio-rad | 732-2010 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Glycerol | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 24388.295 | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405-C | |
| HindIII | Roche | 656313 | |
| HisSelect HF Nickel Affinity Gel | Sigma | H0537 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20252.295 | |
| Imidazole | AppliChem Panreac | A1073,0500 | |
| InstantBlue | Expedeon | ISB1L | |
| LB broth Miller | Fluka Analytical | L3152 | |
| MgCl2 | ICN Biomedicals Inc. | 191421 | |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| NcoI | Fermentas | ER0571 | |
| One Shot BL21 Star (DE3) | ThermoFisher scientific | C6010-03 | |
| pProEx HTb vector | Addgene | 10711018 | |
| Primer | Eurofins mwg operon | ||
| QIAprep Spin Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAquick PCR purification kid | QIAGEN | 28106 | |
| SDS | Sigma | 75746 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen life technology | S33102 | |
| T4 ligase | ThermoFisher scientific | EL0011 | |
| TEV | home made | ||
| TOP 10 | Invitrogen life technology | C404003 | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Uno Q 1R column | Bio-rad | 720 0011 | |
| β-mercaptoethanol | MPBiomedicals, LLC | 194834 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| Camserver software | Dectris | n.a. | detector control software |
| DAMAVER | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to align ab initio models |
| DAMMIF | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | ab initio model reconstruction program |
| HPLC program Biologic Duo Flow | Bio-rad | ||
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| PRIMUS | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program, which performs the manipulation with experimental SAXS |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | https://www.pymol.org/ | software for visualization |
| SUPCOMB | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to superimpose 3D structures |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioLogic Duo Flow | Biorad | ||
| BioLogic Biofrac Fraction collector | Biorad | ||
| HPLC system | Shimadzu | ||
| Labsonic P | Sartorius Stedim biotech | BBI8535108 |
References
- Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
- Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
- Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
- Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
- Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
- Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
- Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
- Selkirk, C.
- Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
- Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
- Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
- Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
- Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
- Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
- Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
- Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
- Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
- Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
- Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).
