Summary
Bestemmelsen av strukturen oppløsning av et protein ved liten vinkel røntgen-spredning (SAXS) krever monodisperse prøver. Her presenterer vi to muligheter for å sikre minimale forsinkelser mellom prøveopparbeidelse og datainnsamling: online size-kromatografi (SEC) og online ionebytterkromatografi (IEC).
Abstract
Biologisk liten vinkel røntgen-spredning (BioSAXS) er en kraftfull teknikk i molekylær biologi og struktur benyttet for å bestemme oppløsning struktur, partikkelstørrelse og form, og overflate-til-volum-forholdet av makromolekyler. Teknikken kan anvendes på et svært bredt spekter av oppløsningsbetingelser som strekker seg over et bredt område av konsentrasjoner, pH-verdier, ionestyrker, temperaturer, additiver, etc., men prøven er nødvendig for å være monodisperse. Dette forbeholdet førte til gjennomføringen av væskekromatografi systemer på SaXs beamlines. Her beskriver vi oppstrøms integrasjon av størrelsesutelukkelses (SEC) og ionebytterkromatografi (IEC) på en beamline, forskjellige metoder for optimal bakgrunn subtraksjon, og datareduksjon. Som et eksempel, vil vi beskrive hvordan vi bruker sek- og IEC-SAXS på et fragment av de essensielle vaccinia virus protein D5, som består av en D5N helikase domene. Vi bestemmer dens totale form og molekylvekt, som viser heksa struktur av the protein.
Introduction
BioSAXS er et kraftig verktøy for å bestemme formen på nanostørrelse stedene 1-4. Spredningen av røntgenstråler med en oppløsning inneholdende makromolekyler, størrelse i nm, føres ved meget lave vinkler. Dette vinkelområde inneholder informasjon om globale parametere: treghetsradier; den største intrapartikulær avstand; partikkelformen; og graden av folding, denaturering, eller uorden. Teknikken krever ikke krystaller, og den makromolekylet forblir i løsning, og således kan holdes under betingelser som etterligner visse viktige parametre for cellen, slik som ionestyrke, pH, etc. kunnskap om disse faktorer kan bidra til å bestemme, for eksempel, det fysiologisk relevante oligomere tilstand av et protein av interesse, eller for å validere en foreslått modell av et kompleks. Karakterisering av protein-protein interaksjoner i forskjellige bufferbetingelsene, etablering av modeller av manglende domener, avgrensningen av homologi modeller, og deopphør av diskrete brettes og utfoldet tilstander kan utføres raskt og enkelt 5.
Som med alle teknikk, har BioSAXS iboende svakheter: aggregerte eller denaturert prøver, blandinger av partikler, heterogene prøver, stråleskader, og buffer uoverensstemmelser kan føre til un-tolkbare data. For mange analysemetoder, er det implisitt antatt at prøven er monodisperse, et krav som ofte er vanskelig å oppnå i praksis. I mange tilfeller er det degradering av prøven subtile og kan ikke detekteres i data på egen hånd, og ethvert forsøk på å tolke dataene gir unøyaktige, eller til og med misvisende resultater. For å overvinne disse hindringene, ble en kombinasjon av størrelse-eksklusjonskromatografi (SEC) og SAXS implementeres på mange beamlines for å sikre datakvalitet og for å gjøre denne teknikken mer tilgjengelig for stadig vanskeligere prøvene 6-11. Nylig la vi en ny metode for å repertoaret ved å utvikle online ion-exchangekromatografi (IEC) -koblet SAXS 12. Begge teknikker er åpne SAXS til et bredt spekter av biologiske partikler tidligere umulig å analysere. Valget av hvilken metode som skal brukes avhenger av biofysiske egenskapene til partiklene av interesse.
SEC skiller makromolekyler av deres størrelse, hvorved er nødvendig minst en 10% forskjell i tilsynelatende molekylmasse for separasjon. Fysiske begrensninger av kolonnen og fysiologiske egenskaper av prøvene, som hydrofobe overflater, fleksibilitet, mangel på stabilitet, også komplisere datainnsamling, analyse og fortolkning.
Ionebytte-kromatografi, som separerer molekyler basert på deres ladning og dermed deres bindingsaffinitet til IEC kolonne, kan brukes i stedet for eller i tillegg til SEC. Den totale ladningen kan lett manipuleres ved å endre pH-verdien, eller varierende saltkonsentrasjonen i bufferen, og gir en forholdsvis enkel metode for regulert elution av molekyler fra den IEC kolonnen. Ved å bruke ladning, separasjon av lignende typer og størrelser av molekyler, som ellers ville være vanskelig å separere, kan utføres rutinemessig med IEC. I tillegg har IEC fordelen av å være i stand til å håndtere fortynnede prøver, slik at man for å unngå konsentrasjonstrinn, som bærer den potensielle risiko for denaturering av proteinet. Dessverre, som det ladningsfordeling er meget sample-avhengige, krever IEC optimalisering med hensyn til pH og saltkonsentrasjoner 13,14.
For mange proteiner som er vanskelig å uttrykke, rense, eller begge deler, bare lave mengder av prøven er tilgjengelige for å studere. Det er viktig å være effektive og for å minimere antall rensetrinn, og derfor tapene. Av denne grunn er det siste rensetrinnet elektronisk direkte før SAXS datainnsamling, for å øke sannsynligheten for å samle inn en god datasett.
HerPresenterer vi og sammenligne online SEC-SAXS og IEC-SAXS. Begge teknikker ble gjennomført på BioSAXS beamline BM29 ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) i Grenoble, Frankrike 15. Som en test, vi brukte D5N og helikasen domene av vaccinia-virus-protein D5, som var temmelig vanskelig å analysere strukturelt ved hjelp av andre metoder. Vaccinia viruset er et medlem av familien Poxviridae, og er 98% identisk med Variola virus, årsaken til små pox. Bruke vaccinia systemet, studerer vi replikering maskiner, med fokus her på essensielle helicase-primase D5.
D5 er et 95-kDa-protein med en N-terminal Archeo-eukaryote primase (AEP) domene 16 etterfulgt av en cystein klynge region (res. 240-345) 16. Videre mot C-terminalen kommer en D5N domene (res. 340-460), som er alltid forbundet med D5-type heli, og til slutt en super 3 (SF3) helicase domene (res. 460-785) 17 (Figure 1A). Den helikase domene av D5 bygger en heksaringstruktur som er nødvendig for tett binding til DNA. Takket være de siste SaXs og EM-studier, er lavoppløste strukturer av primase og helicase domener nå kjent 18.
Her viser vi hvordan du bruker de gjennomførte online kromatografiteknikker på BioSAXS beamline BM29 ved ESRF å få innsikt i strukturen i C-terminale fragment (rest 323-785) av D5.
Protocol
1. Beskrivelse av Offline Utarbeidelse og Sample Generering av et D5 Sletting Protein
MERK: D5 323-785 konstruksjon (figur 1A) ble klonet, uttrykt og renset som beskrevet 18.
- Klone konstruksjonen i den pProEx HTB vektor
- Utfør en polymerase chain reaction (PCR) på D5R hjelp av 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'og 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' primere og en PCR reaksjon blanding med polymerase, etter produsentens råd.
- Rense PCR-fragmenter via spinnkolonner, etter produsentens råd.
- Fordøye PCR-fragmenter og plasmidet med Ncol og Hindlll restriksjonsenzymer, i henhold til produsentens anbefalinger for buffer sammensetning og inkubasjonstid.
- Kjør fragmentene på en 1% agarosegel i TAE-buffer (0,5x 20 mM Tris, 10 mM eddiksyre,og 0,5 mM EDTA) og beis gelen med en DNA-fargestoff.
- Utsett gel mot UV-lys.
Forsiktig: Bruk personlig verneutstyr! Klipp ut bånd fordøyd PCR-fragmenter og fordøyd plasmid og rense DNA ved hjelp av en gel rensing spin kolonne kit, etter produsentens anbefalinger. - Ligate de rensede PCR-fragmenter inn i plasmidet ved hjelp av en rask ligeringssett, etter produsentens anbefalinger.
- Transform via varmesjokk produktet fra ligeringsreaksjonen inn i kompetente bakterier som er optimalisert for plasmid forsterkning.
- Tilsett halvparten av ligerings produkt til en ampulle med bakterier.
- Inkuber i reaksjonsrøret på is i 20 min.
- Inkuber røret ved 42 ° C i 30 sek.
- Plasser røret på is i 2 min.
- Tilsett 1 ml av Luria-Bertani (LB) Broth (Miller) uten antibiotika og la cellene komme ved 37 ° C i 1 time.
- Spinn ned celler på 16 100 xg for 3 s i en bordsentrifuge mikrorør og fjerne det meste av mediet.
- Spre cellene på en LB-agarplate med ampicillin (50 ug / ml endelig) og la kolonier vokse ved 37 ° C over natten.
- Sett en koloni i 3 ml LB med ampicillin (50 mikrogram / ml endelig) og vokse kulturen ved 37 ° C, rist ved 160 rpm over natten.
- Følg instruksjonen på miniprepp kit for å trekke plasmidet.
- Sende en prøve av plasmid for sekvensering, og analysere sekvensen for fraværet av mutasjoner og for riktig innsetting.
- Transform pProEx HTB D5 323-785 bygge opp bakterier som er optimalisert for protein uttrykk (bruk en ul og følger fremgangsmåten i trinn 1.1.7). Spre bakterier på en LB-agarplate med ampicillin (50 ug / ml endelig).
- For å lage en startkultur, sette en koloni i 300 ml LB med ampicillin (50 mikrogram / ml endelig) og vokse bakterier ved 37 ° C, rist ved 160 rpm natten.
- Inokulere 12 x 1 liter av LB i nærvær av ampicillin (50 ug / ml endelig), hver med 20 ml av pProEx HTB D5 323-785 bakterier starterkultur ved 37 ° C inntil en OD 600 = 0,3 er nådd. Redusere temperaturen til 18 ° C og indusere ekspresjon ved en OD 600 = 0,5 med 1 mM IPTG. Inkuber kulturer, riste dem ved 160 rpm og 18 ° C over natten.
- Høste bakteriene ved sentrifugering ved 50 000 x g og ved 4 ° C i 30 minutter. Resuspender bakteriepelletene i ca. 150 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM β-merkaptoetanol, og 10% glycerol) med 1x proteasehemmer og 25 enheter ( U) / 10 ml DNase. Lyses bakterier via lydbehandling på is (1-tommers sonde, 50% strøm, 0,5-s puls, 0,5-s pause, 3x 5 min).
- Laster supernatanten på en affinitetskolonne nikkel (Ni-kolonne, 1,5 ml sjiktvolum), og vaske den med 10 kolonnevolumer (CV) av binding-buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol, og 10% glycerol), 10 CV vaskebuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol og 10% glycerol), og 10 CV imidazol vaske (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% glycerol og 30 mM imidazol). Eluer D5 323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% glycerol og 200 mM imidazol).
- Inspisere de forskjellige rensetrinn, via natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE).
- Belastning 2-20 ul av hvert rensetrinn gjennomstrømnings blandet med 1x lasting fargestoff (2x: 4% SDS, 20% glyserol, 120 mM Tris-HCl [pH 6,8], og 0,02% vekt / volum bromfenol blå) på en 10 % SDS gel og kjøre dem ved 200 V i 1 x Laemmli-buffer (25 mM Tris, 0,192 M glycin, og 0,1% SDS).
- Flekk gelen med et klar-til-bruk Coomassie blå løsning.
- Excndre buffer av eluert protein med bindingsbuffer ved hjelp av en avsaltingskolonne i henhold til produsentens manual.
- Spalter His-tag ved å legge Tobacco Etch Virus atom inkludering-en endopeptidase (TEV, 1 mg / 100 mg protein) til protein løsning. Inkuber ved romtemperatur over natten.
- Sjekk fordøyelsen ved å utføre SDS-PAGE (se trinn 1.5)
- Ekvilibrere Ni-kolonnen i bindingsbuffer. La proteinoppløsningen passerer gjennom og vaske perlene med 2 CV imidazol vaskebuffer mens samle gjennomstrømnings.
- Konsentrer proteinet ved hjelp av en sentrifugal konsentrator til et sluttvolum på 0,5 ml.
- Injiser det konsentrerte protein på en størrelsesutelukkelseskolonne ekvilibrert med gelfiltrering buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glyserol, og 1 mM ditiotreitol [DTT]).
- Samle gjennomstrømnings i 0,5-ml fraksjoner.
- Kontroller tilstedeværelse og renhet av proteinet i de travleste prøvene etterutføre SDS-PAGE (se trinn 1.5).
- Kombiner fraksjoner av elueres toppen av D5 323-785. Fortynne prøven til 25 mM NaCl og 5% glycerol samtidig som Tris og DTT-konsentrasjonen konstant (for 5 ml proteinoppløsning i 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glyserol, og 1 mM DTT, første tilsett 5 ml 20 mM Tris-HCl [pH 7] og 1 mM DTT, og deretter tilsettes 20 ml av 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% glyserol, og 1 mM DTT).
- Laste prøven på en ione-bytterkolonne. Bruk buffer A (20 mM tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% glycerol, og 1 mM DTT) og buffer B (20 mM tris [pH 7], 1 M NaCl, 5% glycerol, og 1 mM DTT) for å danne et salt gradient fra 25 mM til 1 M.
- Samle det eluerte proteinet i 1,5-ml fraksjoner.
- Kontroller tilstedeværelse og renhet av proteinet i topp prøvene ved å utføre SDS-PAGE (se trinn 1.5 og figur 1B)
- Rekonsentrere protein løsning i en sentrifugalkompressor konsentrator til et sluttvolum på 0,5 ml.
- Rerun det konsentrerte protein på en størrelsesutelukkelseskolonne i gelfiltrering buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5% glycerol, og 1 mM DTT; se trinn 1.11).
2. Datainnsamling
MERK: Request bjelke gang så tidlig som mulig. For ESRF, kan retningslinjer for tilgjengelige aksesstyper og om hvordan du sender inn en søknad på:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Etter aksept av forslaget og en invitasjon for forsøket, alle deltakerne må fullføre en sikkerhetsopplæring. Etter validering av trening, fyll i "A-form» (via ESRF brukeren portal) å erklære forskerne besøker beamline for forsøket, sammen med nødvendig sikkerhetsinformasjon på prøvene. Kontakt den lokale kontaktpersonen for å diskutere eksperimentet.
- SEC-SAXS datainnsamling
MERK: For online rensing, bruk væskekromatografi (HPLC) som er installert på BM29. Systemet består av en in-line degasser, en binær pumpe, en ventil for buffer utvalg og gradienter, en autosampler, en UV-VIS matrise photospectrometer, og en conductometer. Det er direkte festet til gjennomstrømnings kapillar av SAXS eksponeringsenheten 19.- Sette 1 ml av den gelfiltrering buffer til side. Koble buffer flasken til SEC systemet (standard er Port A).
- Velge strømningshastigheten avhengig av kolonnen er i bruk. Merk: For den størrelsesutelukkelseskolonne som brukes her, er strømningshastigheten 0,1 ml / min. Definer maksimalt trykk for kolonnen, legg merke til baktrykket, og satt oppkjøpet tid til minst 1,2 CV.
- Skyll pumpene og de offisielle rør via "auto-purge" -funksjon.
- Vent til systemet er fylt med bufferen og koble til kolonnen. Balanser konsollen ved å sende minst 1,5 CV.
- Interlockbur og måle buffer satt til side i trinn 2.1.1, ved hjelp av prøvebytter for å kontrollere for variasjon av signalet på grunn av stråleskader. Bare fortsette hvis det ikke er noen stråleskader til bufferen.
- Slå beamline kontrollsystemet til HPLC-modus. Lag en testkjøring av buffer, samle 200 rammer med 1 s per bilde. Skrive ned det antall tellinger som er gitt av detektoren i den summerte intensitet plottet.
MERK: Signalet skal samsvare med tidligere målt buffer, og summert intensitet over tid bør forbli konstant. Hvis signalet ikke samsvarer med eller er ikke konstant, blir en lengre ekvilibrering av systemet er nødvendig. - Spinne ned prøven ved 13 000 xg i en bordsentrifuge mikrorør i minst 10 min.
- Fyll prøven i en HPLC-kompatibel hetteglass (følger med) og sette den inn i autoinjektor. Merk brønnen posisjon.
- Sperre den eksperimentelle bur ved hjelp av standard prosedyre, som forklart i brukersikkerhetsopplæring.
- Logg inn og opprette en mappe for lagring av data gjennom beamline kontroll programvare.
- Programmere HPLC systemet med "rask batch" -funksjonen. Angi lagringssted for UV-data til mappen du opprettet i trinn 2.1.10. Sørg for å aktivere automatisk ASCII konvertering av UV-data, lagring i ASCII-fil i samme mappe.
- Velge injeksjonsvolum og godt stilling. Legg målingen til kø ved å trykke på "Start" -knappen. Programvaren vil be om å redde partiet. Forbered deg på å spare, men ikke trykk på "Lagre" knappen, da dette automatisk starter målingen.
- Sett opp datainnsamling parametre i beamline kontroll programvare. Velg antall bilder, slik at den totale datainnsamlingen tid er litt i overkant av oppkjøpet tid definert i trinn 2.1.2.
- Åpne sikkerhets skodde og begynne SAXS datainnsamling ved hjelp av beamline kontroll programvare. Kontroller at dataene er correkte ervervet. Sammenlign nylig innsamlede data til de innsamlede dataene i trinn 2.1.6 og sjekk at antall teller i oppsummerte intensitet forblir konstant i minst 100 bilder og har samme verdi fra trinn 2.1.6.
- Start SEC kjøres ved å trykke på "Lagre" -knappen, som utarbeides i trinn 2.1.11, og legg merke til rammenummeret vises i camserver programvaren når injeksjonen er ferdig og UV datainnsamling starter.
- Etter datainnsamlingen, åpner ISPyB database 20 på Åpne "datainnsamling" -kategorien og trykk "Go" -knappen for å få tilgang til datasettet og resultatene av den automatiske analyse 21.
- IEC-SAXS datainnsamling
NB: I stedet for den kontinuerlige lineær gradient som vanligvis anvendes i IEC eksperimenter ved å bruke en trinnvis gradient karakterisert ved at mengden av buffer B blir øket i forhåndsinnstilte diskrete trinn.- Opprett HPLC program for en sample-free buffer løp. Programmere en trinnvis gradient fra 0% buffer B og en økning på 5 prosentpoeng etter to CV inntil 100% av buffer B er nådd.
- Sett noen av hver buffer til side. Treffe flasken med lav-salt buffer A til port A, og en med høy-saltbuffer B til porten B.
- Velge strømningshastigheten og holder seg under trykkgrensen av kolonnen (i dette eksemplet, 1 ml / min).
- Som i trinn 2.1.3, spyle pumper og oppstrøms rør ved hjelp av "auto-purge" -funksjon.
- Ekvilibrere systemet i lav-salt buffer A (se trinn 1.15), og koble den ionebytter-kolonne. Vent til kolonnen er fullstendig i likevekt (minst 1,5 CV).
- Bruke buffer satt til side i trinn 2.2.2 for å undersøke buffere A og B for strålingsskade ved hjelp av prøvebytter, som i trinn 2.1.5.
- Kontroller buffer som kommer ut av kolonnen, som i trinn 2.1.6. Sammenligne signalet til signalet fra buffer A registreres i trinn 2.2.6. Merk igjenantall tellinger i summerte intensitet plot.
- Lag en mappe for datalagring for buffer løp.
- Sett opp datainnsamling i HPLC system modus. Velge det antall rammer, slik at den totale datainnsamlingen tid er i overskudd av den totale tiden for IEC løp (se trinn 2.2.1).
- Åpne sikkerhet lukker og starte SAXS datainnsamling. Kontroller at det går riktig og dobbeltsjekke at den oppsummerte intensitet forblir konstant på verdien noterte i trinn 2.2.7 for minst 100 bilder.
- Bruk "Single Run" -funksjonen i HPLC-programvaren og start trinnvis gradient programmert i trinn 2.2.1. For injeksjon, setter flasken nummer til -1 for å injisere ingen prøve i dette trinnet. Skriv ned antall bilder som tas opp mens programmet starter.
- Opprett HPLC program for prøven løp. Programmere en trinnvis gradient fra 0% av buffer B. Beregn prosentandelen av buffer B på hver topp målt offline i trinn 1.1.5 (
- Spinne ned prøven ved 13 000 xg i en bordsentrifuge mikrorør i minst 10 min.
- Fortynn D5 323-785 i saltkonsentrasjonen av buffer A (25 mM) ved å blande den med 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% glyserol, og 1 mM DTT.
- Laste prøven manuelt på kolonnen. Sett buffer A innspill rør inn den fortynnede prøven etter pause pumpene for å unngå dannelse av luftbobler. Koble fra kolonnen fra detektorene til direkte å samle gjennomstrømnings fra kolonnen.
- Når prøvebeholderen er nesten tom, returnerer inngangsrøret inn i buffer A (igjen midlertidig stopping av pumpene og når den beveges rør) og starte pumping med buffer A for å overføre prøven fra røret til kolonnen. Når hele prøven har værtlastet, passere 2 CV buffer A, og deretter koble kolonnen til detektorene.
- For prøven løp, opprette en mappe for lagring av data.
- Åpne sikkerhet lukker og starte SAXS datainnsamling. Kontroller at datainnsamlingen foregår på riktig måte og dobbeltsjekke at den oppsummerte intensitet forblir konstant på verdien noterte i trinn 2.2.7 for minst 100 bilder.
- Bruk "Single Run" -funksjonen i HPLC-programvaren for å starte trinnvis gradient programmert i trinn 2.2.12. For injeksjon, setter flasken nummer til -1 for å injisere ingen prøve i dette trinnet. Skriv ned antall bilder som tas opp mens programmet starter.
- Åpne "datainnsamling" i ISPyB 20 og trykk "Go" å se på datasettet og den automatiske analysen 21.
- Eksportere UV data fra HPLC-systemet til ASCII-format gjennom "Postrun Analysis" programvare.
3.SEC-SAXS datareduksjon og analyse
- Åpne dataene i datainnsamling i ISPyB ved å trykke på "Go" -knappen. Bestemme i oversikten hvilke rammer av den SAXS datainnsamling tilsvarer elueringstoppen. Kontroller at treghetsradius er stabil gjennom toppen.
- Bekreft at automatisert buffer korreksjon er riktig utført. Last rammer fra den sentrale del av toppen til et program som utfører manipulasjoner med eksperimentelle SAXS datafiler 22 og gjennomsnittlig dem. Deretter laster den automatisk genererte buffer fil og sjekke om de høye q regioner i gjennomsnitt rammer og buffer rammer kamp.
- Sammenligne rammene ervervet gjennom toppen kvantitativt ved hjelp av CORMAP test 23.
- Last inn automatisk opprettet subtractions (* _sub.dat filer) rammer dekker regionen av interesse.
- Skalere dem til hverandre ved å trykke på "Scale" -knappen.
- Compare dem ved hjelp av "data sammenligning" -funksjonen. Det skal ikke være noen systematiske endringer mellom rammene gjennom toppen.
- Åpne alle * -_ sub.dat rammer av interesse, flette dem ved hjelp av "Merge" -knappen, og lagre den sammenslåtte filen i .dat format.
- Bestemme treghetsradius med "treghetsradius" -verktøyet i programmet, å merke det første datapunkt i Guinier rekkevidde for senere beskjæring av dataene ved lav oppløsning.
- Bestem pair-avstand fordelingsfunksjon med "Avstand Distribution" -verktøyet i programmet og lagre den resulterende .out-filen som gnom.out.
4. ab initio modellering
- På en Unix-maskin, kjøre en 40 x ab initio modell rekonstruksjon program uten symmetri restriksjoner. Opprett en ny mappe og kopiere gnom.out fil til det. Kjør programmet som følger:
for ((i = 1; i <= 40; i ++)); gjøre dammif gnom.out -MS -p dammifp1_ $ i; den - Analogt, kjøre en ab initio modell rekonstruksjon program med symmetri restriksjoner for seksdoblet symmetri i en annen mappe:
for ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -MS -s P6 -p dammifp6_ $ i; ferdig - Juster alle ab initio modell rekonstruksjon program utgang filer (* -1.pdb). I de to mapper fra trinn 4.1 og 4.2, kjører damaver -a * -1.pdb.
- Åpne unionen av alle modeller (damaver.pdb) samt modellen filtrert til riktig volum (damfilt.pdb) i en passende molekylær visualisering programvare 26 og sammenligne dem.
- Åpne damsel.log filen i en teksteditor. Modellen som er oppført som "referanse" på bunnen av filen er den mest representative modell.
5. IEC-SAXS datareduksjon, analyse og modellering
- I programmet som utfører manipulering med eksperimentelle SaXs datafiler 22, legger 50 SAXS rammer fra hvert blandetrinn avbuffer kjøre, trykk på "gjennomsnittlig" -knappen, og lagre resultatene.
- Basert på auto-behandlingsresultater tilgjengelig via ISPyB, identifisere hvilke rammer av forsøket svarer til eluering av protein og kontrollere at (foreløpig) treghetsradier er stabil gjennom toppen.
- Last rammene i den eksperimentelle SAXS datafiler manipulasjon program 22 og gjennomsnittlig dem, som gjøres for buffer rammer (se trinn 5.1). Deretter laster bufferfilene som genereres i trinn 5,1 og sammenligne de høye q regionene (over 4,2 nm -1) for å finne en buffer som samsvarer med gjennomsnittet fra toppen.
MERK: det bør ikke være noen systematisk forskyvning mellom den gjennomsnittlige fra toppen og bufferen. Hvis prøven kurven ser ut til å falle mellom to buffer kurver, interpolere sine kurver ved å beregne gjennomsnittet. - Trekk bufferen identifisert som den beste kampen fra gjennomsnittet spredning kurven på toppen fraksjonen og lagre den resulterende subtrhandlet fil. I tillegg skaper subtraherte kurver ved hjelp av den gjennomsnittlige buffer kurvene fra de foregående og følgende blandetrinn for å estimere feilmargin på subtraksjon.
- Gjenta trinn 5,3 og 5,4 individuelt for venstre og høyre halvdel av toppen og sammenligne resultatene til de fra trinn 5.4 for å sjekke for stabiliteten av signalet gjennom peak.
- Følg trinn 3,5 og 3,6 for alle tre trekkes kurver fra trinn 5.4.
- Sammenlign resultatene for alle tre trekkes kurver.
Merk: Bare resultater som forblir robust innenfor feilmarginen subtraksjon kan være klarert. - Utfør modellering som i trinn 4.1 og 4.2 for best subtraksjon identifisert i trinn 5.3.
- Følg trinn 04.03 til 04.05 for å justere modellene, og for å identifisere de mest representative ett.
6. Sammenligning av resultatene
- Kjør et program for å sammenligne med 3D-strukturer 12 på de representative modeller av SEC (trinn 4.5) end IEC-SaXs data (trinn 5.9) med P6 symmetri: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
- Importer model_sec.pdb og model_iec-r.pdb inn en molekylær visualisering programvare.
- Åpne .fir filer av modelsec.pdb og modeliec-r.pdb i et regneark og lage et 2D-graf av eksperimentelle og beregnet spredning kurver.
Representative Results
Resultatene av modellfrie invariant analyse er oppført i tabell 1. Analysen av D5 323-785 SEC-SAXS data viste en molekylvekt anslag (fra en Porod analyse) av 345 kDa versus 338 kDa, observert ved anvendelse av IEC-SAXS. Begge er i overensstemmelse med den forventede masse av 6 ganger 53,5 kDa (321 kDa) for en hexamer. Den ab initio modellering av begge datasettene ble gjennomført uten pålagt symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) og bruk C6 symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Ettersom den samlede passer til spredningsdata for både rekonstruksjoner er sammenlignbare i begge tilfeller (figur 1D og E), kan antas C6 symmetri. Således tilsvarer modellen til et sekskantet kjegle-lignende struktur med en sentral kanal, som vises delvis hindret (SEC: Figur 1F; IEC:
Figur 1: SAXS dataanalyse og sammenligning av D5 323 -785 (figur tilpasset fra Referanser 12 og 18). A) Skjematisk domenestruktur av D5 protein og D5 323-785. B) Offline ion-exchange kromatogram med angivelse av de tre toppene. Orange kurve: Absorbans ved 280 nm (AU), blå kurve: Prosent av buffer B. Prosentvise buffer B på toppene er angitt. C) Online ion-exchange kromatogram. Farge nøkkel som i B. I tillegg er den målte intensitet angitt i grønt. Den eksperimentelle spredning kurve ennd beregnet kurve av modellen oppnådd ved SEC-SAXS D) og IEC E) dataanalyse av D5 323-785. F) Bead modell av D5 323-785 basert på SEC-data og G) IEC data. H) Overlay av SEC og IEC-modeller. Panelene i F) til H) ble opprettet ved hjelp av en molekylær visualisering programvare 24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Datainnsamling parametere | |
| Instrument: | ESRF BM29 |
| Bølgelengde (Å) | 0.99 |
| q-range (-1) | 0,0032 til 0,49 |
| Prøve-å-detektor avstand | 2,864 m |
| Eksponeringstid (sek) | 1 per ramme |
| konsentrasjonsområde | na |
| Temperatur (K) | 293 |
| Detector | Pilatus 1M (Dectris) |
| Flux (fotoner / s) | 1 × 10 12 |
| Bjelke størrelse (um 2) | 700 × 700 |
| Strukturelle parametere for D5 323-785, SEC | |
| I 0 (cm -1) [fra Guinier] | 0,0237 |
| Rg (A) [fra Guinier] | 48 |
| q min R g - q max R g brukt for Guinier | 0,77 til 1,24 |
| D max (A) [fra p (r)] | 145 |
| q-serien brukes for p (r) (-1) | 0,02 til 0,17 |
| Porod volum V P (A 3) [fra Scatter] | (570 ± 5) × 10 3 |
| Molekylvekt M r (KDA) [fra V p] | 345 |
| Beregnet monomere Mr fra sekvens (KDA) | 321 |
| Strukturelle parametere for D5 323-785, IEC | |
| I 0 (cm -1) [fra Guinier] | 0,386 |
| Rg (A) [fra Guinier] | 46,5 ± 0,1 |
| q min R g - q max R g brukt for Guinier | 0,44 til 1,29 |
| D max (A) [fra p (r)] | 120 |
| q-serien brukes for p (r) (-1) | 0,03 til 0,18 |
| Porod volum V p (& #197; 3) [fra Scatter] | (577 ± 5) × 10 3 |
| Molekylvekt M r (KDA) [fra V p] | 339 |
| Beregnet heksa Mr fra sekvens (KDA) | 321 |
Tabell 1: SAXS dataparametre. Tabellen oppsummerer de parametrene for SAXS datainnsamling og analyse.
Discussion
For mange makromolekyler, er en avsluttende rensetrinn ved hjelp av kromatografi nødvendig før SAXS datainnsamling for å oppnå en god kvalitet datasett. Men ikke alle prøvene holde seg stabil; de kan være tilbøyelige til aggregering eller re-ekvilibrering av en blanding av oligomerisering tilstander. Derfor er en avsluttende rensetrinn nettet på beamline som kreves for å minimere tiden mellom rensingen og datainnsamling for å oppnå den beste kvalitet SAXS-data. Avhengig av de biofysiske egenskapene til proteinet av interesse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS velges for å oppnå optimal kvalitet prøven. Her, på en protein-konstruksjon avledet fra helikasen / primase D5, blir begge teknikkene beskrevet og diskutert.
Oppkjøp av SEC-SAXS data blir mer og mer standardisert og er tilgjengelig på mange BioSAXS beamlines. Dataanalyse, spesielt bakgrunn subtraksjon, er relativt grei og enkel. Imidlertid er en stabil buffersignalog tilstrekkelig separasjon av de makromolekylære arter som er fortsatt vesentlig. Derfor er det viktig å reservere tilstrekkelig tid til å ekvilibrere kolonnen grundig. Svikt i denne fremgangsmåten kan være på grunn av vedvarende forurensninger av tilsvarende størrelse til proteinet av interesse, lave konsentrasjoner, og strålingsfølsomme buffere.
I praksis, i første omgang, er SEC-SAXS sannsynligvis vil bli brukt som metoden for valg for de fleste makromolekylære prøver. Likevel, flere renseprotokoller krever en forutgående IEC skritt på grunn av tilstedeværelsen av forurensninger eller aggregering. Gitt at hver konsentrasjon og kromatografitrinn er forbundet med tap av prøven (anslått til 30-50%) og tid, er direkte IEC-SAXS fordelaktig. For prøver som ikke kan renses ved SEC, det være seg på grunn av tilstedeværelsen av tilsvarende størrelse "forurensninger", eller fordi de sterkt aggregert ved de nødvendige konsentrasjoner, vil IEC-SAXS alltid være bedre egnet tilnærming. Også de høyere strømningshastigheter støttesav mange IEC kolonner kan bidra til å redusere transporttiden mellom rensing og måling. I det eksempel som er presentert her, ble IEC brukt sammen med et trinn eluering, som tillater separasjon av de nære toppene av D5 323-785 fra forurensninger ved omhyggelig valg av saltkonsentrasjonstrinn. I prinsippet er det antall trinn ubegrenset, men i praksis er i det minste ett trinn pr peak nødvendig, og ikke for mange bør velges. For bakgrunnen subtraksjon fremgangsmåten beskrevet ovenfor, er det viktig å måle et relativt høyt antall forskjellige buffersammensetninger for å finne den samsvarende ett.
En felles ulempe for begge teknikkene er mangelen på nøyaktig proteinkonsentrasjon informasjon. På grunn av dette, er nøyaktig massebestemmelse basert på forover spredning ikke mulig. For globular proteiner som D5 323-785, gir Porod volum en alternativ, om enn mindre presis, masse anslag, men for svært fleksible eller uordnede proteinerDenne tilnærmingen ville ikke være gyldig.
En variant av den trinnvise gradient IEC-SAXS-metoden presentert her er anvendelse av en lineær gradient i stedet. Selv om det er mulig å arbeide med så mange trinn som ønsket for å isolere under topper ved anvendelse av en trinnvis eluering, i den lineære gradient tilnærming, er det nødvendig å optimalisere gradient betingelsene nøye for å separere toppene fullstendig før man starter SAXS eksperiment. Bakgrunn subtraksjon i denne tilnærmingen kunne gjøres ramme-klok og kunne bekreftes ved sammenligning av enkeltbilder, men det krever mer avansert datahåndtering, og en dedikert programvare ikke finnes ennå.
Valget av en egnet kolonne er kritisk for begge teknikkene, da det bestemmer separasjon av de makromolekylære arter. Størrelseseksklusjonskolonner skiller seg i lastekapasitet, størrelsesområdet separerbare makromolekyler, og oppløsning, mens ione-utvekslingskolonner variere i type og tetthetav sine immobilisert kostnader.
Mens protokollen som presenteres her er spesifikk for ESRF beamline BM29, tilpasning til en hvilken som helst annen SAXS beamline er i prinsippet enkel. De viktigste krav er tilstrekkelig høy røntgen fluks og en passende detektor (helst enkelt-foton-telle), for å skaffe gunstige signal-til-støydata i størrelsesorden av noen sekunder eller mindre, og en elektronisk væskekromatografi systemet i stand til å skape gradienter. Den nøyaktige oppbygning vil, selvfølgelig, være avhengig av den lokale beamline miljø.
De oppnådde på D5 323-785 ved hjelp av de to metodene resultatene avvike noe. Rotasjonsradien er litt mindre for IEC data enn for SEC-data, og den lokale minima av spredningskurven forskyves til litt større sprednings vektorer. Dette betyr at D5 323-785 målt med IEC-SAXS er noe mer kompakt enn D5 323-785 målt ved hjelp av SEC-SAXS. Dette kan be på grunn av forskjeller i prøveopparbeidelse, i tiden mellom rensing og måling (IEC er raskere), eller, mindre sannsynlig, til en forurensning i SEC-rensede prøven. De kule-modeller som oppnås fullstendig uavhengig av hverandre med begge metoder er sammenlignbare (figur 1 H). D5 323-785 viser ventet hul, heksa struktur 18.
I konklusjonen, online ion-exchange og online størrelse-kromatografi er viktige biokjemiske rensemetoder som kan kobles direkte til SAXS 6,7,9-12,25,26. Bakgrunnen subtraksjon av IEC-SAXS data er litt vanskeligere og tvetydig enn for SEC-SAXS, men det er ikke desto mindre mulig. Avhengig av de biofysiske egenskapene til proteinet av interesse, både SEC og IEC-SAXS tillate optimalisering av arten separasjon med iboende fordeler. Forutsatt at validerings trinnene (som beskrevet) er korrekt observeres, kan de resulterende data skal analyseres vetth tillit, og modellene kan bestemmes ved hjelp av standard verktøy tilgjengelig i samfunnet. Sammen, begge teknikker tillater nettet separasjon for et bredt spekter av biologiske makromolekyler, noe som ga data ikke er tilgjengelige via standard statiske målinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol [DTT] | Euromedex | EU0006-B | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel | Biorad | 4561033 | |
| 2x Phusion Flash PCR Master Mix | ThermoFisher scientific | F 548 | |
| acetic acid glacial | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20104.298 | |
| Agarose D-5 | Euromedex | LF45130653 | |
| Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K | Millipore Ltd | UFC903024 | |
| Ampicillin sodium salt | Euromedex | EU0400-D | |
| Benzonase | Novagene | 70750-3 | |
| bromophenol blue | MERCK | 8122 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11231400 | |
| Econo-Pac 10 DG Desalting column | Bio-rad | 732-2010 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Glycerol | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 24388.295 | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405-C | |
| HindIII | Roche | 656313 | |
| HisSelect HF Nickel Affinity Gel | Sigma | H0537 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20252.295 | |
| Imidazole | AppliChem Panreac | A1073,0500 | |
| InstantBlue | Expedeon | ISB1L | |
| LB broth Miller | Fluka Analytical | L3152 | |
| MgCl2 | ICN Biomedicals Inc. | 191421 | |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| NcoI | Fermentas | ER0571 | |
| One Shot BL21 Star (DE3) | ThermoFisher scientific | C6010-03 | |
| pProEx HTb vector | Addgene | 10711018 | |
| Primer | Eurofins mwg operon | ||
| QIAprep Spin Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAquick PCR purification kid | QIAGEN | 28106 | |
| SDS | Sigma | 75746 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen life technology | S33102 | |
| T4 ligase | ThermoFisher scientific | EL0011 | |
| TEV | home made | ||
| TOP 10 | Invitrogen life technology | C404003 | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Uno Q 1R column | Bio-rad | 720 0011 | |
| β-mercaptoethanol | MPBiomedicals, LLC | 194834 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| Camserver software | Dectris | n.a. | detector control software |
| DAMAVER | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to align ab initio models |
| DAMMIF | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | ab initio model reconstruction program |
| HPLC program Biologic Duo Flow | Bio-rad | ||
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| PRIMUS | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program, which performs the manipulation with experimental SAXS |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | https://www.pymol.org/ | software for visualization |
| SUPCOMB | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to superimpose 3D structures |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioLogic Duo Flow | Biorad | ||
| BioLogic Biofrac Fraction collector | Biorad | ||
| HPLC system | Shimadzu | ||
| Labsonic P | Sartorius Stedim biotech | BBI8535108 |
References
- Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
- Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
- Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
- Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
- Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
- Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
- Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
- Selkirk, C.
- Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
- Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
- Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
- Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
- Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
- Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
- Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
- Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
- Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
- Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
- Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).
