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Biochemistry

ऑनलाइन आकार अपवर्जन और एक SAXS Beamline पर आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी

Published: January 5, 2017 doi: 10.3791/54861
Automatic Translation
1, 2,3, 4
1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale

Summary

छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (SAXS) द्वारा एक प्रोटीन का समाधान संरचना के निर्धारण monodisperse के नमूने की आवश्यकता है। यहाँ, हम दो संभावनाएं पेश नमूना तैयार करने और डाटा अधिग्रहण के बीच कम से कम देरी सुनिश्चित करने के लिए: ऑनलाइन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) और ऑनलाइन आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी)।

Abstract

जैविक छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (BioSAXS) समाधान संरचना, कण आकार और आकार और सतह करने वाली मात्रा अणुओं के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल आणविक और संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली तकनीक है। तकनीक समाधान की स्थिति सांद्रता, पीएच मान, आयनिक ताकत, तापमान, additives, आदि की एक विस्तृत रेंज में फैले का एक बहुत व्यापक विविधता के लिए लागू है, लेकिन नमूना monodisperse जाने की आवश्यकता है। यह चेतावनी SAXS beamlines पर तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के कार्यान्वयन के लिए नेतृत्व किया। यहाँ, हम एक beamline पर आकार अपवर्जन (एसईसी) और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी) के अपस्ट्रीम एकीकरण का वर्णन है, इष्टतम पृष्ठभूमि घटाव, और डेटा की कमी के लिए विभिन्न तरीकों। एक उदाहरण के रूप में, हम वर्णन कैसे हम सेकंड और आईईसी SAXS का उपयोग आवश्यक चेचक वायरस प्रोटीन D5 का एक टुकड़ा, एक D5N helicase डोमेन से मिलकर। हम उसके समग्र आकार और आणविक वजन का निर्धारण, वीं की hexameric संरचना दिखाई प्रोटीन।

Introduction

BioSAXS नैनो आकार की वस्तुओं 1-4 के आकार निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एक समाधान अणुओं, एनएम रेंज में आकार युक्त द्वारा एक्स-रे का बिखरने, बहुत कम कोण पर दर्ज की गई है। इस कोणीय रेंज वैश्विक मानकों के बारे में जानकारी होती है: परिचलन की त्रिज्या; सबसे बड़ा intraparticle दूरी; कण आकार; और तह, विकृतीकरण, या विकार की डिग्री। तकनीक क्रिस्टल की आवश्यकता नहीं है, और macromolecule समाधान में रहता है और इस तरह इस तरह के ईओण ताकत, पीएच, आदि इन कारकों के ज्ञान के रूप में सेल के कुछ महत्वपूर्ण पैरामीटर, नकल उतार परिस्थितियों में रखा जा सकता है निर्धारित करने के लिए मदद कर सकता है, उदाहरण के लिए, या ब्याज की एक प्रोटीन की physiologically प्रासंगिक oligomeric राज्य के एक परिसर के प्रस्तावित मॉडल को मान्य करने के लिए। अलग बफर की स्थिति में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लक्षण वर्णन, लापता डोमेन के मॉडल का निर्माण, अनुरूपता मॉडल के शोधन, और डीअसतत मुड़ा और सामने आया राज्यों की समाप्ति जल्दी और आसानी से 5 प्रदर्शन किया जा सकता है।

एकत्रित या विकृत नमूने, कणों का मिश्रण, विषम नमूने, विकिरण क्षति, और बफर बेमेल संयुक्त राष्ट्र के व्याख्या डेटा में परिणाम हो सकता है: किसी भी तकनीक के साथ के रूप में, BioSAXS आंतरिक कमजोरियों है। कई विश्लेषण के तरीकों के लिए, यह संकेत भी माना जाता है कि नमूना monodisperse है, एक आवश्यकता है कि व्यवहार में प्राप्त करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है। कई मामलों में, नमूना की गिरावट सूक्ष्म है और अपने दम पर डेटा में पता नहीं किया जा सकता है, और डेटा की व्याख्या करने के लिए किसी भी प्रयास को गलत या भ्रामक भी परिणाम देता है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) और SAXS के संयोजन में कई beamlines पर लागू किया गया था डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए और तेजी से मुश्किल नमूने 6-11 के लिए इस तकनीक को और अधिक सुलभ बनाने के लिए। हाल ही में, हम ऑनलाइन आयन एक्सचेंज के विकास के द्वारा प्रदर्शनों की सूची के लिए एक नई विधि का जोड़ाक्रोमैटोग्राफी (आईईसी) SAXS 12 -coupled। दोनों तकनीकों जैविक कणों का विश्लेषण करने के लिए पूर्व में असंभव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए SAXS खोल रहे हैं। जो विधि का उपयोग करने का विकल्प ब्याज के कणों की biophysical गुणों पर निर्भर करता है।

एसईसी उनके आकार, जिससे कम से कम स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में 10% का अंतर जुदाई के लिए आवश्यक है द्वारा बड़े अणुओं को अलग करती है। स्तंभ और नमूने के शारीरिक गुणों की भौतिक सीमाओं, हाइड्रोफोबिक सतहों, लचीलापन, और स्थिरता की कमी तरह, यह भी डेटा संग्रह, विश्लेषण और व्याख्या जटिल।

आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, जो आईईसी स्तंभ के लिए अपने आरोप पर आधारित अणुओं को अलग करती है और, इसलिए, उनकी बंधन आत्मीयता के बजाय, या एसईसी के अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल शुल्क आसानी से नियंत्रित एल के लिए पीएच बदल रहा है, या बफर के नमक एकाग्रता बदलती उपलब्ध कराने, एक अपेक्षाकृत सरल विधि द्वारा हेरफेर किया जा सकताआईईसी स्तंभ से अणुओं के संविधान। प्रभारी का उपयोग करके, समान प्रकार के और अणुओं के आकार, जो अन्यथा अलग करने के लिए मुश्किल होगा की जुदाई, आईईसी के साथ नियमित रूप से किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, आईईसी पतला नमूनों के साथ सौदा करने के लिए, एक एकाग्रता कदम है, जो प्रोटीन denaturing के संभावित खतरे से बचने के लिए ले जाने के लिए अनुमति देने में सक्षम होने का लाभ दिया है। दुर्भाग्य से, के रूप में प्रभार वितरण अत्यधिक नमूना पर निर्भर है, आईईसी पीएच और नमक सांद्रता 13,14 के बारे में अनुकूलन की आवश्यकता है।

कई प्रोटीन है कि, एक्सप्रेस को शुद्ध, या दोनों के लिए मुश्किल हो जाता है के लिए, नमूना के ही कम मात्रा में अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं। यह महत्वपूर्ण कुशल होने के लिए और नुकसान शुद्धि चरणों की संख्या को कम करने के लिए और इसलिए, है। इस कारण से, पिछले शुद्धि कदम ऑनलाइन के क्रम में एक अच्छा डेटा सेट इकट्ठा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए सीधे SAXS डाटा अधिग्रहण करने से पहले है।

यहाँ, हम वर्तमान और ऑनलाइन एसईसी-SAXS और आईईसी SAXS की तुलना करें। दोनों तकनीकों ग्रेनोबल, फ्रांस में 15 में यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF) पर BioSAXS beamline BM29 पर लागू किया गया। एक परीक्षण के मामले के रूप में, हम चेचक वायरस प्रोटीन D5, जो बल्कि अन्य तरीकों का उपयोग कर संरचनात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए मुश्किल था की D5N और helicase डोमेन इस्तेमाल किया। चेचक वायरस Poxviridae परिवार का एक सदस्य है और शीतला वायरस, चेचक के कारण करने के लिए 98% समान है। चेचक प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम प्रतिकृति मशीनरी का अध्ययन, आवश्यक helicase-primase D5 पर यहाँ ध्यान दे।

D5 एक एन टर्मिनल archeo-यूकेरियोटिक primase (एईपी) डोमेन 16 एक सिस्टीन क्लस्टर क्षेत्र (आरईएस। 240-345) 16 के द्वारा पीछा के साथ एक 95-केडीए प्रोटीन होता है। सी टर्मिनस की दिशा में आगे एक D5N डोमेन (आरईएस। 340-460) आता है, जो हमेशा अंत में एक superfamily 3 (SF3) helicase डोमेन D5 प्रकार helicases साथ जुड़ा हुआ है, और (आरईएस। 460-785) 17 (Figurई 1 ए)। D5 की helicase डोमेन एक hexameric अंगूठी संरचना है कि तंग डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए की जरूरत है बनाता है। हाल SAXS और ईएम के अध्ययन के लिए धन्यवाद, primase की कम संकल्प संरचनाओं और helicase डोमेन अब 18 से जाना जाता है।

यहाँ, हम कैसे सी टर्मिनल टुकड़ा (छाछ 323-785) D5 की की संरचना में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए ESRF पर BioSAXS beamline BM29 पर कार्यान्वित ऑनलाइन क्रोमैटोग्राफी तकनीक का उपयोग करने के लिए दिखा।

Protocol

1. ऑफलाइन तैयारी का विवरण और एक d5 विलोपन प्रोटीन का नमूना जनरेशन

नोट: D5 323-785 निर्माण (चित्रा 1 ए), क्लोन किया गया था व्यक्त की, और शुद्ध रूप में वर्णित 18।

  1. PProEx HTB वेक्टर में निर्माण क्लोन
    1. 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC -3 'और 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA -3' प्राइमर और पोलीमर्स के साथ एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण, निर्माता की सलाह के बाद का उपयोग कर एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) D5R पर प्रदर्शन करना।
    2. स्पिन स्तंभों के माध्यम से पीसीआर टुकड़े शुद्ध, निर्माता की सलाह के बाद।
    3. पीसीआर टुकड़े और NcoI और HindIII प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्लाज्मिड डाइजेस्ट, बफर संरचना और ऊष्मायन समय के लिए निर्माता की सिफारिशों के बाद।
    4. 0.5x TAE बफर में एक 1% agarose जेल पर टुकड़े (20 मिमी Tris, 10 मिमी एसिटिक एसिड भागो,और 0.5 मिमी EDTA) और एक डीएनए डाई के साथ जेल दाग।
    5. पराबैंगनी प्रकाश को जेल बेनकाब।
      सावधानी: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहन लो! पच पीसीआर टुकड़े के बैंड और पचा प्लाज्मिड बाहर कट और एक जेल शुद्धि स्पिन स्तंभ किट का उपयोग डीएनए को शुद्ध, निर्माता की सिफारिशों के बाद।
    6. एक तेजी से बंधाव किट का उपयोग निर्माता की सिफारिशों के बाद प्लाज्मिड में शुद्ध पीसीआर टुकड़े ligate।
    7. सक्षम बैक्टीरिया प्लाज्मिड प्रवर्धन के लिए अनुकूलित में बंधाव प्रतिक्रिया से गर्मी के झटके के माध्यम से रूपांतरण उत्पाद।
      1. जीवाणुओं की एक शीशी बंधाव उत्पाद के आधे से जोड़ें।
      2. 20 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया ट्यूब सेते हैं।
      3. 30 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
      4. बर्फ पर ट्यूब 2 मिनट के लिए रखें।
      5. 1 एंटीबायोटिक दवाओं के बिना Luria Bertani एमएल (पौंड) शोरबा (मिलर) जोड़ें और कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वसूली करते हैं।
      6. 16,100 XG fo पर कोशिकाओं नीचे स्पिनआर एक टेबलटॉप microtube सेंट्रीफ्यूज में 3 और मध्यम के सबसे को हटा दें।
      7. एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) के साथ एक लेग अगर प्लेट पर कोशिकाओं बिखरा हुआ है और कालोनियों में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
    8. एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) के साथ लेग के 3 एमएल में एक कॉलोनी रखो और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति विकसित करने, रात भर में 160 rpm पर मिलाते हुए।
    9. miniprep किट प्लाज्मिड निकालने के निर्देश का पालन करें।
    10. अनुक्रमण के लिए प्लाज्मिड का एक नमूना भेजने और म्यूटेशन की अनुपस्थिति के लिए और सही प्रविष्टि के लिए अनुक्रम का विश्लेषण।
    11. रूपांतरण pProEx HTB D5 323-785 प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित बैक्टीरिया में निर्माण (1 μL का उपयोग करें और कदम 1.1.7 में चरणों का पालन करें)। एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) के साथ एक लेग अगर प्लेट पर बैक्टीरिया बिखरा हुआ है।
    12. एक प्रारंभिक संस्कृति पैदा करने के लिए, एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) के साथ लेग के 300 एमएल में एक कॉलोनी डाल दिया है और 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ने, 160 आर में मिलाते हुएPM रात भर।
  2. (50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम), 37 डिग्री सेल्सियस पर pProEx HTB D5 323-785 बैक्टीरिया स्टार्टर संस्कृति के 20 एमएल के साथ प्रत्येक एक आयुध डिपो तक एम्पीसिलीन की उपस्थिति में टीका लगाना पौंड की 12 एक्स 1 एल 600 = 0.3 पर पहुंच गया है। 18 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने और एक आयुध डिपो के 600 = 0.5 1 मिमी IPTG के साथ कम से अभिव्यक्ति प्रेरित। संस्कृतियों सेते हैं, उन्हें 160 आरपीएम और 18 डिग्री सेल्सियस रात भर में मिलाते हुए।
  3. 50,000 XG पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया हार्वेस्ट। लगभग 150 lysis बफर एमएल में बैक्टीरिया छर्रों Resuspend (50 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 7], 150 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी β-mercaptoethanol, और 10% ग्लिसरॉल) 1x protease अवरोध के साथ और 25 इकाइयों ( यू) / 10 एमएल DNase। sonication के माध्यम से Lyse बैक्टीरिया बर्फ पर (1 इंच जांच, 50% बिजली, 0.5-एस नाड़ी, 0.5-एस ठहराव, 3x 5 मिनट)।
  4. एक निकल आत्मीयता के स्तंभ (नी-स्तंभ, 1.5 एमएल बिस्तर मात्रा) पर सतह पर तैरनेवाला लोड, और ख के 10 कॉलम की मात्रा (सीवी) के साथ इसे धोनेबफर inding (50 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 7], 150 मिमी NaCl, 10 मिमी β-mercaptoethanol, और 10% ग्लिसरॉल), वॉशिंग बफर के 10 सीवी (50 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 7], 1 एम NaCl, 10 मिमी β-mercaptoethanol, और 10% ग्लिसरॉल), और imidazole धोने के 10 सीवी (50 मिमी Tris एचसीएल [7 पीएच], 150 मिमी NaCl, 10 मिमी β-mercaptoethanol, 10% ग्लिसरॉल, और 30 मिमी imidazole)। Elute D5 323-785 (20 मिमी Tris एचसीएल [7 पीएच], 150 मिमी NaCl, 10 मिमी β-mercaptoethanol, 10% ग्लिसरॉल, और 200 मिमी imidazole)।
  5. सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) -polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) के माध्यम से विभिन्न शुद्धि चरणों का निरीक्षण किया।
    1. लोड 2-20 की μL प्रत्येक शुद्धि कदम प्रवाह के माध्यम से 1x लोडिंग डाई के साथ मिश्रित (2x: 4% एसडीएस, 20% ग्लिसरॉल, 120 मिमी Tris एचसीएल [6.8 पीएच], और 0.02% वजन / मात्रा bromophenol नीला) एक 10 पर % एसडीएस जेल और बफर चल रहे 200 वी 1x Laemmli में कम से उन्हें चलाने (25 मिमी Tris, 0.192 एम ग्लाइसिन, और 0.1% एसडीएस)।
    2. एक के लिए तैयार करने के लिए उपयोग Coomassie नीले रंग के समाधान के साथ जेल दाग।
  6. exchange बफर बाध्यकारी निर्माता की पुस्तिका के अनुसार एक desalting स्तंभ का उपयोग के साथ eluted प्रोटीन के बफर।
  7. प्रोटीन समाधान करने के लिए तंबाकू खोदना वायरस परमाणु शामिल किए जाने-एक endopeptidase (TEV, प्रोटीन की 1 मिलीग्राम / 100 मिलीग्राम) जोड़कर उनकी टैग फोड़ना। रात भर कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  8. एसडीएस पृष्ठ के प्रदर्शन से पाचन चेक (1.5 कदम देखें)
  9. बाध्यकारी बफर में नी-स्तंभ संतुलित करना। प्रोटीन समाधान के माध्यम से गुजरती हैं और प्रवाह के माध्यम से एकत्रित करते समय imidazole धोने बफर के 2 सीवी के साथ मोती धो दें।
  10. 0.5 एमएल के अंतिम मात्रा करने के लिए एक केन्द्रापसारक concentrator का उपयोग प्रोटीन ध्यान लगाओ।
  11. एक आकार अपवर्जन स्तंभ जेल निस्पंदन बफर के साथ equilibrated पर केंद्रित प्रोटीन इंजेक्षन (20 मिमी Tris एचसीएल [7 पीएच], 150 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी dithiothreitol [डीटीटी])।
  12. 0.5 एमएल भागों में प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए।
  13. चोटी के नमूनों में उपस्थिति और प्रोटीन की शुद्धता की जांचएसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन (1.5 कदम देखें)।
  14. D5 323-785 की eluted चोटी के भागों का मिश्रण। 25 मिमी NaCl के लिए नमूना और 5% ग्लिसरॉल पतला Tris और डीटीटी सांद्रता निरंतर (प्रोटीन समाधान के 5 एमएल के लिए 20 मिमी Tris एचसीएल [7 पीएच], 150 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी डीटीटी में रखते हुए, पहले 20 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 7] और 1 मिमी डीटीटी के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर 20 मिमी Tris एचसीएल [7 पीएच], 5% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी डीटीटी) के 20 एमएल जोड़ने।
  15. एक आयन एक्सचेंज स्तंभ पर नमूना लोड। बफर का उपयोग एक (20 मिमी Tris [पीएच 7], 25 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी डीटीटी) और बफर बी (20 मिमी Tris [पीएच 7], 1 एम NaCl, 5% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी डीटीटी) 25 मिमी से 1 एम के लिए एक नमक ढाल के रूप में करने के लिए
  16. 1.5 एमएल भागों में eluted प्रोटीन ले लीजिए।
  17. एसडीएस पृष्ठ के प्रदर्शन से उपस्थिति और चोटी के नमूनों में प्रोटीन की शुद्धता की जांच (1.5 कदम और चित्रा 1 बी देखें)
  18. 0.5 एमएल के अंतिम मात्रा करने के लिए एक केन्द्रापसारक concentrator में प्रोटीन समाधान Reconcentrate।
  19. Rerun जेल निस्पंदन बफर में एक आकार अपवर्जन स्तंभ पर केंद्रित प्रोटीन (20 मिमी Tris एचसीएल [7 पीएच], 150 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी डीटीटी; कदम 1.11 देखें)।

2. डेटा संग्रह

नोट: अनुरोध किरण समय जितनी जल्दी हो सके। ESRF के लिए, उपलब्ध पहुँच प्रकार पर और कैसे एक आवेदन प्रस्तुत करने पर दिशा निर्देश पर पाया जा सकता है:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying । प्रस्ताव की स्वीकृति और प्रयोग के लिए एक निमंत्रण के बाद, सभी प्रतिभागियों को एक सुरक्षा प्रशिक्षण पूरा करना है। प्रशिक्षण के सत्यापन के बाद, "एक फार्म" (ESRF उपयोगकर्ता पोर्टल के माध्यम से) में भरने के प्रयोग के लिए beamline, नमूने पर आवश्यक सुरक्षा जानकारी के साथ-साथ जाकर शोधकर्ताओं की घोषणा। प्रयोग के बारे में चर्चा करने के लिए स्थानीय संपर्क व्यक्ति से संपर्क करें।

  1. एसईसी-SAXS डेटा संग्रह
    नोट: onl के लिएine शुद्धि, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली BM29 पर स्थापित का उपयोग करें। प्रणाली एक लाइन में degasser, एक द्विआधारी पंप, बफर चयन और ढ़ाल, एक autosampler, एक यूवी तुलना सरणी photospectrometer, और एक conductometer के लिए एक वाल्व के होते हैं। यह सीधे SAXS जोखिम इकाई 19 के माध्यम से प्रवाह केशिका से जुड़ा हुआ है।
    1. जेल निस्पंदन बफर के 1 एमएल तरफ रख दिया। एसईसी व्यवस्था करने के लिए बफर बोतल कनेक्ट (डिफ़ॉल्ट पोर्ट एक है)।
    2. उपयोग में स्तंभ के आधार पर प्रवाह की दर चुनें। नोट: आकार अपवर्जन यहां इस्तेमाल स्तंभ के लिए, प्रवाह की दर 0.1 एमएल / मिनट है। , स्तंभ के लिए अधिकतम दबाव परिभाषित वापस दबाव का ध्यान रखना, और कम से कम 1.2 CV के अधिग्रहण के समय निर्धारित किया है।
    3. "ऑटो शुद्ध" समारोह के माध्यम से पंप और नदी के ऊपर नलियों फ्लश।
    4. जब तक सिस्टम बफर से भर जाता है रुको और स्तंभ कनेक्ट। कम से कम 1.5 सीवी से गुजर रहा स्तंभ संतुलित करना।
    5. गूंथनाहच और बफर कदम 2.1.1 में अलग सेट को मापने, नमूना परिवर्तक का उपयोग विकिरण क्षति के कारण सिग्नल की भिन्नता को नियंत्रित करने के लिए। अगर वहाँ बफर करने के लिए कोई विकिरण क्षति है केवल जारी है।
    6. एचपीएलसी मोड के लिए beamline नियंत्रण प्रणाली स्विच। बफर के एक परीक्षण चलाने बनाओ, फ्रेम प्रति 1 एस के साथ 200 फ्रेम का संग्रह। अभिव्यक्त तीव्रता साजिश में डिटेक्टर द्वारा दिए गए मामलों की संख्या को नीचे लिखें।
      नोट: संकेत पहले से मापा जाता बफर मैच चाहिए, और समय के साथ अभिव्यक्त किया तीव्रता स्थिर रहना चाहिए। संकेत मेल नहीं खाती है या स्थिर नहीं है, प्रणाली की एक लंबी संतुलन की आवश्यकता है।
    7. नीचे कम से कम 10 मिनट के लिए एक टेबलटॉप microtube सेंट्रीफ्यूज में 13,000 XG पर नमूना स्पिन।
    8. एक एचपीएलसी-संगत कांच की शीशी (प्रदान) में नमूना भरें और यह ऑटो इंजेक्टर में डाल दिया। नोट अच्छी तरह से स्थिति।
    9. प्रयोगात्मक हच मानक प्रक्रिया का उपयोग कर आलिंगन, के रूप में उपयोगकर्ता सुरक्षा प्रशिक्षण में विस्तार से बताया।
    10. में प्रवेश करें और beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से डेटा भंडारण के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ।
    11. "जल्दी बैच" सुविधा का उपयोग एचपीएलसी प्रणाली कार्यक्रम। कदम 2.1.10 में बनाए गए फ़ोल्डर के लिए यूवी डेटा भंडारण के लिए स्थान निर्धारित करें। यूवी डेटा की स्वत: ASCII रूपांतरण सक्रिय करने के लिए एक ही फ़ोल्डर में ASCII फ़ाइल भंडारण के लिए सुनिश्चित करें।
      1. इंजेक्शन की मात्रा और अच्छी तरह से स्थिति को चुनें। माप "प्रारंभ" बटन दबाने से क़तार में जोड़ें। सॉफ्टवेयर बैच को बचाने के लिए पूछना होगा। बचाने के लिए तैयार है, लेकिन जैसा कि यह स्वतः माप शुरू होता है "सहेजें" बटन प्रेस नहीं है।
    12. सेट अप beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर में डाटा संग्रह मापदंडों। तख्ते की संख्या चुनें तो यह है कि कुल डेटा संग्रह समय अधिग्रहण के समय कदम 2.1.2 में परिभाषित से कुछ अधिक है।
    13. सुरक्षा शटर खुला और beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर SAXS डेटा संग्रह शुरू करते हैं। सत्यापित करें कि डेटा भ्रष्टाचार हैंrectly हासिल कर ली। कदम 2.1.6 में एकत्र आंकड़ों के नव एकत्र आंकड़ों की तुलना करें और जाँच करें कि अभिव्यक्त तीव्रता में गिनती की संख्या कम से कम 100 फ्रेम के लिए लगातार बना रहता है और कदम 2.1.6 से मान से मेल खाता।
      1. कदम 2.1.11 में तैयार के रूप में एसईसी, "सहेजें" बटन दबाने से चलाने प्रारंभ करें, और ध्यान दें जब इंजेक्शन पूरा हो गया है और यूवी डाटा अधिग्रहण शुरू होता है camserver सॉफ्टवेयर में दिखाया गया है फ्रेम संख्या।
    14. डेटा संग्रह के बाद, "डाटा अधिग्रहण" टैब ओपन में ISPyB डेटाबेस 20 खोलने के लिए और डेटा सेट और स्वत: विश्लेषण 21 के परिणामों का उपयोग करने के लिए बटन "जाओ" दबाएँ।
  2. आईईसी SAXS डेटा संग्रह
    नोट: निरंतर रैखिक ढाल सामान्यतः आईईसी प्रयोगों में लागू करने के बजाय, एक कदम वार ढाल जिसमें बफर बी की राशि पूर्व निर्धारित असतत चरणों में बढ़ जाती है का उपयोग करें।
    1. एक sampl के लिए एचपीएलसी कार्यक्रम बनाएंई-मुक्त बफर रन। एक कदम वार ढाल से 0% बफर बी शुरू करने और दो सीवी के बाद 5 प्रतिशत अंकों से बढ़ रही है, जब तक बफर बी के 100% तक पहुँच गया है जो प्रोग्राम।
    2. प्रत्येक बफर के कुछ तरफ रख दिया। बंदरगाह के लिए कम नमक बफर ए और बी बंदरगाह के लिए उच्च नमक बफर बी के साथ एक साथ बोतल कनेक्ट
    3. प्रवाह की दर चुनें और स्तंभ के दबाव सीमा से नीचे रहने (इस उदाहरण में, 1 एमएल / मिनट)।
    4. कदम 2.1.3 के रूप में, "ऑटो शुद्ध" समारोह का उपयोग करके पंप और नदी के ऊपर ट्यूबिंग फ्लश।
    5. कम नमक बफर में प्रणाली संतुलित करना (कदम 1.15 देखें) और आयन एक्सचेंज स्तंभ कनेक्ट। रुको जब तक स्तंभ पूरी तरह से equilibrated है (कम से कम 1.5 सीवी)।
    6. , नमूना परिवर्तक का उपयोग कदम 2.1.5 के रूप में विकिरण क्षति के लिए बफ़र्स ए और बी की जांच करने के लिए कदम 2.2.2 में बफर अलग सेट का प्रयोग करें।
    7. बफर कदम 2.1.6 के रूप में स्तंभ से बाहर आने की जाँच करें। बफर के संकेत कदम 2.2.6 में दर्ज करने के लिए संकेत की तुलना करें। फिर नोटअभिव्यक्त तीव्रता साजिश में गिना जाता है की संख्या।
    8. बफर रन के लिए डेटा भंडारण के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ।
    9. एचपीएलसी प्रणाली मोड में डेटा संग्रह सेट करें। तख्ते की संख्या चुनें तो यह है कि कुल डेटा संग्रह समय आईईसी रन के कुल समय से अधिक है (कदम 2.2.1 देखें)।
    10. सुरक्षा शटर खुला और SAXS डेटा संग्रह शुरू करते हैं। सत्यापित करें कि इसे सही ढंग से आगे बढ़ता है और डबल जाँच करें कि अभिव्यक्त तीव्रता कम से कम 100 फ्रेम के लिए कदम 2.2.7 में नोट मूल्य पर स्थिर बनी हुई है।
    11. एचपीएलसी सॉफ्टवेयर की "रन" सुविधा का उपयोग करें और कदम वार ढाल कदम 2.2.1 में प्रोग्राम शुरू करते हैं। इंजेक्शन के लिए, क्रम में इस चरण में कोई नमूना इंजेक्षन करने में -1 शीशी संख्या सेट करें। के रूप में कार्यक्रम शुरू होता है का अधिग्रहण फ्रेम की संख्या नीचे लिखें।
    12. नमूना रन के लिए एचपीएलसी कार्यक्रम बनाएं। एक कदम वार ढाल बफर बी अनुमान के 0% प्रत्येक चोटी पर बफर बी का प्रतिशत कदम 1.1.5 में ऑफ़लाइन मापा से शुरू कार्यक्रम ( (चित्रा 1 सी) के लिए प्रत्येक सेट करें। 2.5 CV के लिए 100% बफर B में अंतिम चरण के लिए जोड़ें।
    13. नीचे कम से कम 10 मिनट के लिए एक टेबलटॉप microtube सेंट्रीफ्यूज में 13,000 XG पर नमूना स्पिन।
    14. बफर (25 मिमी) के नमक एकाग्रता में D5 323-785 पतला 20 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 7], 10% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी डीटीटी के साथ मिश्रण से।
    15. स्तंभ पर मैन्युअल नमूना लोड। बफर पंप रोक हवा के बुलबुले के गठन से बचने के बाद पतला नमूना में एक इनपुट ट्यूब रखो। डिटेक्टरों से स्तंभ डिस्कनेक्ट सीधे प्रवाह के माध्यम स्तंभ से इकट्ठा करने के लिए।
      1. जब नमूना कंटेनर लगभग खाली है, बफर में इनपुट ट्यूब वापसी (फिर पंप रोक जबकि ट्यूब चलती) और स्तंभ के लिए ट्यूबिंग से नमूना हस्तांतरण करने के लिए बफर के साथ पंप को पुनः आरंभ। एक बार पूरे नमूना दिया गया हैभरी हुई है, बफर के 2 सीवी के पास है, और फिर डिटेक्टरों के लिए स्तंभ जोड़ने।
    16. नमूना रन के लिए, डेटा भंडारण के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ।
    17. सुरक्षा शटर खुला और SAXS डेटा संग्रह शुरू करते हैं। सत्यापित करें कि डेटा संग्रह को सही ढंग से आगे बढ़ता है और डबल जाँच करें कि अभिव्यक्त तीव्रता कम से कम 100 फ्रेम के लिए कदम 2.2.7 में नोट मूल्य पर स्थिर बनी हुई है।
    18. कदम वार ढाल कदम 2.2.12 में प्रोग्राम शुरू करने के लिए एचपीएलसी सॉफ्टवेयर की "रन" सुविधा का उपयोग करें। इंजेक्शन के लिए, क्रम में इस चरण में कोई नमूना इंजेक्षन करने में -1 शीशी संख्या सेट करें। के रूप में कार्यक्रम शुरू होता है का अधिग्रहण फ्रेम की संख्या नीचे लिखें।
    19. ओपन "डाटा अधिग्रहण" ISPyB 20 में और प्रेस "जाओ" डेटा सेट और स्वत: विश्लेषण 21 में देखने के लिए।
    20. "Postrun विश्लेषण" सॉफ्टवेयर के माध्यम से ASCII स्वरूप को एचपीएलसी सिस्टम से यूवी डेटा निर्यात करें।

3।एसईसी-SAXS डेटा न्यूनीकरण एवं विश्लेषण

  1. बटन "जाओ" दबाकर ISPyB में डाटा अधिग्रहण में डेटा खोलें। सिंहावलोकन जो SAXS डेटा संग्रह के फ्रेम में निर्धारित बनाने के लिए क्षालन चोटी के अनुरूप हैं। सत्यापित करें कि परिचलन की त्रिज्या चोटी के दौरान स्थिर है।
  2. पुष्टि करें कि स्वचालित बफर सुधार सही ढंग से प्रदर्शन किया गया था। एक प्रोग्राम है कि 22 फाइलें और उन्हें औसत प्रयोगात्मक SAXS डेटा के साथ जोड़तोड़ करता है में चोटी के मध्य भाग से लोड फ्रेम। फिर, स्वतः उत्पन्न बफर फाइल लोड और क्या औसतन तख्ते की उच्च क्ष क्षेत्रों और बफर फ्रेम मैच की जाँच करें।
  3. फ्रेम चोटी मात्रात्मक CORMAP परीक्षा 23 का उपयोग कर भर का अधिग्रहण की तुलना करें।
    1. स्वचालित रूप से बनाया subtractions (* _sub.dat फ़ाइलें) ब्याज के क्षेत्र को कवर फ्रेम का भार।
    2. "स्केल" बटन दबाने से एक दूसरे के लिए उन्हें पैमाने।
    3. comparउन्हें ई "डेटा तुलना" सुविधा का उपयोग कर। चोटी के दौरान फ्रेम के बीच कोई व्यवस्थित बदलाव नहीं होना चाहिए।
  4. सभी * -_ ब्याज की sub.dat फ्रेम खोलें, "मर्ज" बटन का उपयोग कर उन्हें मर्ज, और .dat प्रारूप में विलय फ़ाइल सहेजें।
  5. कार्यक्रम में "परिचलन की त्रिज्या" उपकरण के साथ परिचलन की त्रिज्या का निर्धारण करते हैं, कम संकल्प पर डेटा के बाद फसल के लिए Guinier श्रेणी में पहले डेटा बिंदु टिप्पण।
  6. कार्यक्रम में "दूरी वितरण" उपकरण के साथ जोड़ी दूरी वितरण समारोह का निर्धारण और gnom.out रूप में जिसके परिणामस्वरूप .out फ़ाइल सहेजें।

4. अब initio मॉडलिंग

  1. एक यूनिक्स मशीन पर, समरूपता प्रतिबंध के बिना एक 40 x आदितः मॉडल पुनर्निर्माण कार्यक्रम चलाते हैं। एक नया फ़ोल्डर बनाएँ और इसे करने के लिए gnom.out फाइल कॉपी। कार्यक्रम चलाने के लिए इस प्रकार है:
    ((I = 1; मैं <= 40; i ++)) के लिए; dammif gnom.out एमएस -p dammifp1_ $ मैं करना; घएक
  2. तुलनात्मक रूप से, एक दूसरे फ़ोल्डर में छह गुना समरूपता के लिए समरूपता प्रतिबंध के साथ एक अटल बिहारी प्रभाव के तहत मॉडल पुनर्निर्माण कार्यक्रम चलाने:
    ((I = 1; मैं <= 40; i ++)) के लिए; Do dammif gnom.out एमएस एस पी 6 -p dammifp6_ $ मैं; किया हुआ
  3. सभी आदितः मॉडल पुनर्निर्माण कार्यक्रम आउटपुट फाइल संरेखित (* -1.pdb)। कदम 4.1 और 4.2 से दो फ़ोल्डरों में, damaver -एक * -1.pdb चलाते हैं।
  4. सभी मॉडलों (damaver.pdb) के साथ ही मॉडल सही मात्रा (damfilt.pdb) के लिए फ़िल्टर एक उपयुक्त आणविक दृश्य सॉफ्टवेयर 26 में से संघ खोलें और उनकी तुलना।
  5. एक पाठ संपादक में damsel.log फ़ाइल खोलें। मॉडल फ़ाइल के तल पर "संदर्भ" के रूप में सूचीबद्ध सबसे अधिक प्रतिनिधि मॉडल है।

5. आईईसी SAXS डेटा कमी, विश्लेषण, और मॉडलिंग

  1. प्रोग्राम है कि प्रयोगात्मक SAXS डेटा फ़ाइलों को 22 के साथ हेरफेर करता है, लोड के बारे में 50 SAXS के प्रत्येक मिश्रण कदम से तख्तेबफर रन, 'औसत' बटन दबाएँ, और परिणाम को बचाने के।
  2. ऑटो प्रसंस्करण ISPyB के माध्यम से उपलब्ध परिणामों के आधार पर पहचान प्रयोग के फ्रेम जो प्रोटीन की क्षालन के अनुरूप और सत्यापित करें कि (प्रारंभिक) परिचलन की त्रिज्या चोटी के दौरान स्थिर है।
  3. प्रयोगात्मक SAXS डेटा फ़ाइलों हेरफेर कार्यक्रम 22 में फ्रेम लोड और उन्हें औसत, के रूप में बफर फ्रेम (5.1 कदम देखें) के लिए किया गया। फिर, 5.1 कदम में उत्पन्न बफर फ़ाइलों को लोड और एक बफर कि शिखर से औसत मैच खोजने के लिए (4.2 एनएम -1 ऊपर) उच्च क्ष क्षेत्रों की तुलना करें।
    नोट: कोई व्यवस्थित चोटी और बफर से औसत के बीच ऑफसेट किया जाना चाहिए। नमूना वक्र दो बफर घटता के बीच गिरने लगता है, तो औसत की गणना के द्वारा उनकी घटता बैठाना।
  4. बफर शिखर अंश की औसत बिखरने की अवस्था से सबसे अच्छा मैच के रूप में पहचान घटाएँ और जिसके परिणामस्वरूप subtr बचाअभिनय किया है फ़ाइल। इसके अलावा, पूर्ववर्ती और निम्न मिश्रण कदम से औसत बफर घटता का उपयोग घटाव की त्रुटि मार्जिन अनुमान लगाने के लिए घटाया घटता पैदा करते हैं।
  5. दोहराएँ चोटी के बाएँ और दाएँ हिस्सों के लिए 5.3 और 5.4 कदम को व्यक्तिगत रूप से और चोटी के दौरान संकेत की स्थिरता के लिए जाँच करने के लिए कदम 5.4 से उन लोगों के लिए परिणामों की तुलना करें।
  6. 3.5 और 3.6 कदम 5.4 से सभी तीन घटाया घटता के लिए चरणों का पालन करें।
  7. सभी तीन घटाया घटता के लिए परिणामों की तुलना करें।
    नोट: केवल परिणाम है कि घटाव की त्रुटि मार्जिन के भीतर मजबूत रहने पर भरोसा किया जा सकता है।
  8. के रूप में कदम 4.1 और 4.2 अच्छी घटाव 5.3 चरण में पहचान के लिए मॉडलिंग प्रदर्शन करना।
  9. 4.5 4.3 चरण मॉडल के लिए पंक्ति में और सबसे अधिक प्रतिनिधि एक की पहचान करने के लिए का पालन करें।

6. का परिणाम तुलना

  1. 3 डी संरचनाओं मिलाना एसईसी के प्रतिनिधि मॉडलों पर 12 एक कार्यक्रम चलाने के (4.5 कदम) एकडी आईईसी SAXS डेटा (कदम 5.9) पी 6 समरूपता के साथ: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. model_sec.pdb और एक आणविक दृश्य सॉफ्टवेयर में model_iec-r.pdb आयात करें।
  3. modelsec.pdb की .fir फ़ाइलें और एक स्प्रेडशीट में modeliec-r.pdb खोलें और प्रयोगात्मक और गणना बिखरने घटता की एक 2 डी ग्राफ बनाने के लिए।

Representative Results

मॉडल-मुक्त अपरिवर्तनीय विश्लेषण के परिणाम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। D5 323-785 एसईसी-SAXS डेटा के विश्लेषण के 345 केडीए बनाम 338 केडीए के (एक Porod विश्लेषण से) एक आणविक जन अनुमान से पता चला है, आईईसी SAXS का उपयोग कर मनाया। दोनों एक hexamer के लिए 6 बार 53.5 केडीए (321 केडीए) की उम्मीद जन के साथ समझौते में हैं। दोनों डेटा सेट के प्रभाव के तहत अब मॉडलिंग कोई लगाया समरूपता के साथ किया गया था (एसईसी-SAXS: χ 2 = 0.88, आईईसी SAXS: χ 2 = 3.1) और C6 समरूपता का उपयोग कर (एसईसी-SAXS: χ 2 = 1.0, आईईसी SAXS : χ 2 = 4)। दोनों के रूप में पुनर्निर्माण के लिए बिखरने के आंकड़ों के समग्र फिट बैठता है दोनों ही मामलों (चित्रा -1 और ई) में तुलना कर रहे हैं, C6 समरूपता माना जा सकता है। इस प्रकार, मॉडल एक केंद्रीय चैनल, जो आंशिक रूप से बाधित प्रतीत होता है (एसईसी के साथ एक हेक्सागोनल शंकु की तरह संरचना से मेल खाती है: चित्रा 1F, आईईसी: चित्रा 1H)। औसत से पहले अलग-अलग मॉडलों में से एक परीक्षा से पता चलता है कि इस बाधा औसत प्रक्रिया के एक विरूपण साक्ष्य होने की संभावना है।

आकृति 1
चित्रा 1: SAXS डेटा विश्लेषण और तुलना D5 323 -785 (आंकड़ा सन्दर्भ 12 और 18 से अनुकूलित)। ए) D5 प्रोटीन और d5 323-785 के योजनाबद्ध डोमेन संरचना। बी) के तीन चोटियों के संकेत के साथ ऑफलाइन आयन एक्सचेंज वर्णलेख। ऑरेंज वक्र: 280 एनएम (एयू), नीले रंग की अवस्था पर absorbance: चोटियों पर बफर बी के बफर बी प्रतिशत का प्रतिशत संकेत कर रहे हैं। सी) ऑनलाइन आयन एक्सचेंज वर्णलेख। बी में के रूप में रंग कुंजी इसके अतिरिक्त, मापा तीव्रता हरे रंग में संकेत दिया है। प्रयोगात्मक बिखरने की अवस्था एकएन डी मॉडल एसईसी-SAXS डी) और आईईसी ई) D5 323-785 के डेटा विश्लेषण के द्वारा प्राप्त की वक्र गणना की थी। D5 323-785 की एफ) मनका मॉडल एसईसी डेटा और जी) आईईसी डेटा पर आधारित है। एच) एसईसी और आईईसी मॉडल के ओवरले। एफ में पैनल) एच) एक आणविक दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 24 बनाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डाटा संग्रह के मापदंडों
साधन: ESRF BM29
वेवलेंथ (एक) 0.99
क्यू रेंज (ए -1) 0,0032 - 0.49
नमूना डिटेक्टर दूरी 2.864 मीटर
जोखिम समय (सेकंड) 1 फ्रेम प्रति
एकाग्रता रेंज NA
तापमान (कश्मीर) 293
डिटेक्टर Pilatus 1M (Dectris)
फ्लक्स (फोटॉनों / s) 1 * 10 से 12
बीम आकार (माइक्रोन 2) 700 × 700
D5 323-785, एसईसी के लिए संरचनात्मक मापदंडों
मैं 0 (सेमी -1) [Guinier से] 0.0237
आरजी (एक) [Guinier से] 48
आर जी मिनट क्यू - क्यू अधिकतम आर जी Guinier के लिए इस्तेमाल किया 0.77 - 1.24
डी मैक्स (एक) [पी से (आर)] 145
क्यू रेंज पी के लिए प्रयोग किया जाता है (r) (क -1) 0.02 - 0.17
Porod मात्रा वी पी (ए 3) [तितर बितर से] (570 ± 5) × 10 3
आण्विक जन एम आर (केडीए) [V पी से] 345
अनुक्रम से monomeric श्री परिकलित (केडीए) 321
D5 323-785, आईईसी के लिए संरचनात्मक मापदंडों
मैं 0 (सेमी -1) [Guinier से] 0.386
आरजी (एक) [Guinier से] 46.5 ± 0.1
आर जी मिनट क्यू - क्यू अधिकतम आर जी Guinier के लिए इस्तेमाल किया 0.44 - 1.29
डी मैक्स (एक) [पी से (आर)] 120
क्यू रेंज पी के लिए प्रयोग किया जाता है (r) (क -1) 0.03 - 0.18
Porod मात्रा वी पी (& #197; 3) [तितर बितर से] (577 ± 5) × 10 3
आण्विक जन एम आर (केडीए) [V पी से] 339
अनुक्रम से hexameric श्री परिकलित (केडीए) 321

तालिका 1: SAXS डेटा मापदंडों। तालिका SAXS डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के मापदंडों का सार।

Discussion

कई बड़े अणुओं के लिए, एक अंतिम शुद्धि क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कदम के लिए एक अच्छी गुणवत्ता डेटा सेट प्राप्त करने के लिए SAXS डेटा संग्रह करने से पहले आवश्यक है। हालांकि, सभी नमूने स्थिर रहते हैं; वे oligomerization राज्यों का एक मिश्रण करने के लिए एकत्रीकरण या फिर से संतुलन के लिए खतरा हो सकता है। इसलिए, beamline पर अंतिम ऑनलाइन शुद्धि कदम क्रम में सबसे अच्छा गुणवत्ता SAXS डेटा प्राप्त करने के लिए शुद्धि और डेटा संग्रह के बीच के समय को कम करने के लिए आवश्यक है। ब्याज की प्रोटीन की biophysical गुणों पर निर्भर करता है, एसईसी-SAXS या आईईसी SAXS इष्टतम नमूना गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए चुना जा सकता है। इधर, एक प्रोटीन का निर्माण helicase / primase D5 से निकाली गई पर, दोनों तकनीकों के बारे में बताया और चर्चा कर रहे हैं।

एसईसी-SAXS डेटा के अधिग्रहण के लिए अधिक से अधिक मानकीकृत बनने और कई BioSAXS beamlines पर उपलब्ध है। डेटा विश्लेषण, विशेष रूप से पृष्ठभूमि घटाव, अपेक्षाकृत सरल और आसान है। हालांकि, एक स्थिर बफर संकेतऔर macromolecular प्रजातियों की पर्याप्त जुदाई आवश्यक रहता है। इसलिए, यह कॉलम अच्छी तरह से संतुलित करने के लिए पर्याप्त समय आरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस विधि की विफलता ब्याज, कम सांद्रता, और विकिरण के प्रति संवेदनशील buffers की प्रोटीन के समान आकार की लगातार contaminants के कारण हो सकता है।

अभ्यास में, शुरू में, एसईसी-SAXS सबसे macromolecular नमूने के लिए पसंद की विधि के रूप में इस्तेमाल किए जाने की संभावना है। फिर भी, कई शुद्धि प्रोटोकॉल एक पूर्व आईईसी contaminants या एकत्रीकरण की उपस्थिति के कारण कदम की आवश्यकता है। यह देखते हुए कि प्रत्येक एकाग्रता और क्रोमैटोग्राफी कदम नमूना (30-50% का अनुमान) और समय की हानि के साथ जुड़ा हुआ है, प्रत्यक्ष आईईसी SAXS फायदेमंद है। नमूने है कि एसईसी द्वारा शुद्ध नहीं किया जा सकता है, यह समान आकार "contaminants" की उपस्थिति के कारण या क्योंकि वे गंभीर रूप से आवश्यक मात्रा में कुल, आईईसी SAXS हमेशा बेहतर अनुकूल दृष्टिकोण हो जाएगा। इसके अलावा, उच्च प्रवाह दरों का समर्थन कियाकई ने आईईसी कॉलम शुद्धि और माप के बीच पारगमन के समय को कम करने में मदद कर सकते हैं। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, आईईसी एक कदम क्षालन, जो ध्यान से नमक एकाग्रता कदम का चयन करके contaminants से D5 323-785 के करीब चोटियों के अलग होने के लिए अनुमति देता है के साथ इस्तेमाल किया गया था। सिद्धांत रूप में, चरणों की संख्या असीमित है, लेकिन व्यावहारिक रूप से, शिखर के अनुसार कम से कम 1 कदम की आवश्यकता है, और भी कई नहीं चुना जाना चाहिए। ऊपर वर्णित पृष्ठभूमि घटाव विधि के लिए, यह क्रम मिलान एक खोजने के लिए अलग-अलग बफर रचनाओं की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या को मापने के लिए महत्वपूर्ण है।

दोनों तकनीकों का एक साझा नकारात्मक पक्ष सटीक प्रोटीन एकाग्रता जानकारी का अभाव है। इस के कारण, सटीक जन आगे बिखरने के आधार पर दृढ़ संकल्प संभव नहीं है। ऐसे D5 323-785 के रूप में गोलाकार प्रोटीन के लिए, Porod मात्रा लेकिन अत्यधिक लचीला या अव्यवस्थित प्रोटीन के लिए, एक वैकल्पिक, कम सटीक, जन अनुमान यद्यपि प्रदान करता है, इस दृष्टिकोण मान्य नहीं होगा।

कदम वार ढाल आईईसी SAXS यहाँ प्रस्तुत विधि के एक बदलाव के लिए एक रेखीय ढाल के बजाय का उपयोग है। हालांकि यह संभव है रैखिक ढाल दृष्टिकोण में, के रूप में एक कदम वार क्षालन का उपयोग करते हुए उप चोटियों को अलग-थलग करने के लिए वांछित के रूप में कई कदम के साथ काम करने के लिए, यह क्रम चोटियों को अलग करने में सावधानी से ढाल शर्तों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है पूरी तरह SAXS शुरू करने से पहले प्रयोग। इस दृष्टिकोण में पृष्ठभूमि घटाव फ्रेम के लिहाज से किया जा सकता है और व्यक्तिगत तख्ते की तुलना द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, लेकिन इसे और अधिक उन्नत डेटा से निपटने की आवश्यकता है, और एक समर्पित सॉफ्टवेयर अभी तक मौजूद नहीं है।

के रूप में यह macromolecular प्रजातियों की जुदाई निर्धारित करता है एक उपयुक्त स्तंभ की पसंद, दोनों तकनीकों के लिए महत्वपूर्ण है। आकार अपवर्जन कॉलम, लदान क्षमता, वियोज्य अणुओं के आकार की सीमा, और संकल्प में मतभेद है, जबकि आयन एक्सचेंज कॉलम तरह की और घनत्व में भिन्नताउनकी स्थिर आरोपों की।

जबकि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ESRF beamline BM29, अनुकूलन किसी अन्य SAXS beamline है, सिद्धांत रूप में, सीधा करने के लिए विशिष्ट है। मुख्य आवश्यकताओं एक पर्याप्त उच्च एक्स-रे प्रवाह और एक उपयुक्त डिटेक्टर (आदर्श एकल फोटान गिनती), सेकंड या उससे कम की रेंज में उचित संकेत करने वाली शोर डेटा प्राप्त करने के लिए, और एक ऑनलाइन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली बनाने में सक्षम हैं ढ़ाल। सटीक क्रियान्वयन, ज़ाहिर है, स्थानीय beamline पर्यावरण पर निर्भर करेगा।

दो विधियों का उपयोग D5 323-785 पर प्राप्त परिणामों से थोड़ा भिन्न होते हैं। परिचलन की त्रिज्या एसईसी डेटा के लिए की तुलना में आईईसी डेटा के लिए थोड़ा छोटा होता है, और बिखरने की अवस्था का स्थानीय minima थोड़ा बड़ा बिखरने वैक्टर करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। इसका मतलब यह है कि D5 323-785 आईईसी SAXS के साथ मापा थोड़ा D5 323-785 एसईसी-SAXS के साथ मापा तुलना में अधिक कॉम्पैक्ट है। इस ख हो सकता हैशुद्धि और माप के बीच के समय में (आईईसी तेजी से होता है) या एसईसी-शुद्ध नमूने में एक contaminant के लिए नमूना तैयार करने में मतभेद, कम होने की संभावना के कारण ई। मनका दोनों तरीकों के साथ पूरी तरह से स्वतंत्र रूप से प्राप्त मॉडल तुलनीय (चित्रा 1H) कर रहे हैं। D5 323-785 उम्मीद खोखले, hexameric संरचना 18 से पता चलता है।

अंत में, ऑनलाइन आयन एक्सचेंज और ऑनलाइन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी महत्वपूर्ण जैव रासायनिक शुद्धि तरीकों कि सीधे SAXS 6,7,9-12,25,26 करने के लिए मिलकर किया जा सकता हैं। आईईसी SAXS डेटा की पृष्ठभूमि घटाव से थोड़ा अधिक कठिन और एसईसी-SAXS लिए की तुलना में अस्पष्ट है, लेकिन यह फिर भी संभव है। ब्याज की प्रोटीन की biophysical गुणों पर निर्भर करता है, दोनों एसईसी और आईईसी SAXS निहित लाभ के साथ प्रजाति जुदाई के अनुकूलन के लिए अनुमति देते हैं। प्रदान करना है कि सत्यापन के कदम (के रूप में वर्णित) सही ढंग से मनाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है बुद्धिज आत्मविश्वास, और मॉडल मानक उपकरण समुदाय के भीतर उपलब्ध का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। साथ में, दोनों तकनीकों जैविक अणुओं का एक व्यापक रेंज के लिए ऑनलाइन जुदाई की अनुमति है, मानक स्थिर माप के माध्यम से सुलभ नहीं डेटा उपज।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

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References

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

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Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

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