Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

kvantitativ 3D doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

Vi utvecklat en metod för kvantitativ 3D in silico-modellering (q3DISM) av cerebral amyloid-β (A-beta) fagocytos av mononukleära fagocyter i gnagarmodeller av Alzheimers sjukdom. Denna metod kan generaliseras för kvantifiering av praktiskt taget alla fagocytisk händelse in vivo.

Abstract

Neuroinflammation erkänns nu som en viktig etiologisk faktor i neurodegenerativa sjukdomar. Enkärniga fagocyter är medfödda immunceller som är ansvariga för fagocytos och röjning av skräp och smuts. Dessa celler innefattar CNS-residenta makrofager kallas mikroglia, och mononukleära fagocyter infiltrerar från periferin. Ljusmikroskopi har i allmänhet använts för att visualisera fagocytos i gnagare eller humana hjärnprover. Emellertid har kvalitativa metoder inte tillgänglig definitiva bevis för in vivo-fagocytos. Här beskriver vi kvantitativ 3D in silico-modellering (q3DISM), en robust metod som möjliggör äkta 3D kvantifiering av amyloid β (A-beta) fagocytos av mononukleära fagocyter i gnagare Alzheimers sjukdom (AD) modeller. Metoden innebär fluorescerande visualisering Ap inkapslad i phagolysosomes i gnagare hjärnan sektioner. Stora z-dimensionell konfokala datamängder sedan 3D rekonstrueras för kvantifiering av A &# 946; spatialt samlokaliserades inom phagolysosome. Vi demonstrerar den framgångsrika tillämpningen av q3DISM till mus- och råtthjärnor, men denna metod kan utvidgas till praktiskt taget alla fagocytiska händelse i någon vävnad.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alzheimers sjukdom (AD), den vanligaste åldersrelaterad demens ett, kännetecknas av cerebral amyloid-β (A-beta) ackumulering som "senil" p-amyloid plack, kronisk låg nivå neuroinflammation, tauopathy, neuronal förlust och kognitiva störningar 2 . I AD patientens hjärna är neuroinflammation reserveras av reaktiva astrocyter och mononukleära fagocyter (kallas mikroglia, även om deras centrala kontra perifera ursprung är fortfarande oklart) som omger Ap insättningar 3. Som det medfödda immunvaktposter i CNS, är mikroglia centralt placerad för att rensa hjärnan Ap. Emellertid är microglial rekrytering till Ap-plack åtföljs av mycket lite, om någon, Ap fagocytos 4,5. En hypotes är att mikroglia initialt neuroprotektiva genom phagocytozing små församlingar Ap. Men så småningom dessa celler blir neurotoxiska som överväldigande Ap börda och / eller åldersrelaterad funktionell decline, framkallar mikroglia i en dysfunktionell proinflammatoriska fenotyp, vilket bidrar till neurotoxicitet och kognitiv nedgång sex.

Senaste Genome-wide association studies (GWAS) har identifierat ett kluster av AD riskalleler tillhör kärn medfödda immun vägar 7 som modulerar fagocytos 8-11. Följaktligen har immunsvaret mot cerebral amyloid nedfall blivit ett stort område av intresse, både när det gäller att förstå AD etiologi och för att utveckla nya terapeutiska metoder 12-14. Ändå finns det ett stort behov av metoder för att utvärdera Ap fagocytos in vivo. För att lösa detta otillfredsställda behov har vi utvecklat kvantitativa 3D in silico-modellering (q3DISM) för att möjliggöra äkta 3D kvantifiering av cerebral Ap fagocytos av mononukleära fagocyter i gnagarmodeller av Alzheimer-liknande sjukdom.

endast begränsas av i vilken utsträckning de sammanfatta sjukdom, djurmodeller harvisat sig ovärderlig för att förstå AD pathoetiology och för utvärdering av experimentella läkemedel. Beroende på det faktum att mutationer i de Presenilin (PS) och Amyloid Precursor Protein (APP) gener oberoende orsaka autosomalt dominant AD, har dessa mutanttransgener i stor utsträckning använts för att generera transgena gnagarmodeller. Transgena APP / PS1 möss samtidigt samuttrycker "svenska" mutant human APP (APP eng) och Δ exon 9 mutant human presenilin 1 (PS1ΔE9) närvarande med accelererad cerebral amyloidos och neuroinflammation 15,16. Vidare har vi genererat bi-transgena råttor saminjicerades med APP swe och PS1ΔE9 konstruktioner (linje TgF344-AD, på en Fischer 344 bakgrund). Till skillnad från transgena musmodeller av cerebral amyloidos, TgF344-AD råttor utvecklar cerebral amyloid som föregår tauopathy, apoptotiska förlust av nervceller, och beteendefunktion 17.

I denna rapport beskriver vi ett protokoll för immunostaining mikroglia, phagolysosomes och Ap insättningar i hjärnan sektioner från APP / PS1 möss och TgF344-AD råttor och förvärv av stora Z-dimensionell konfokala bilder. Vi detalj in silico generering och analys av verkliga 3D rekonstruktioner från konfokala datauppsättningar som tillåter kvantifiering av Ap upptag i microglial phagolysosomes. Mer allmänt kan den metod som vi detalj här användas för att kvantifiera praktiskt taget varje form av fagocytos in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Uttalande av forskningsetik: Alla försök med djur som anges häri godkändes av University of Southern California Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och utförs i strikt överensstämmelse med National Institutes of Health riktlinjer och rekommendationer från Föreningen för bedömning och ackreditering för laboratorie Animal Care International.

1. Gnagare Brain Isolering och förberedelse för immunfärgning

DAG 1:

  1. Placera åldern TgF344-AD råttor (14 månader gamla) eller APP / PS1 möss (12 månader gamla) under kontinuerlig djup isoflurananestesi (4%). Utvärdera anestesidjupet av tå nypa och frånvaron av tillbakadragande reflex.
  2. Skär igenom båda sidor av bröstkorgen och lyft att exponera hjärtat. Infoga en 23 G nål i den vänstra ventrikeln av hjärtat och gör ett litet snitt i höger förmak. Fortsätt till blodtappning genom transcardial perfusion med iskall fosfatbuffrad saltlösning(PBS) med hjälp av en peristaltisk pump (30 ml för möss, 150-200 ml för råttor).
  3. Gör en kaudal mittlinjesincision in i huden och flytta huden och muskeln åt sidan. Skär genom toppen av skallen längs mittlinjen och mellan ögonen. Ta bort benplattor och isolera hela hjärnan från skallen.
  4. Placera hjärnan i en frontal gnagare hjärna matris och skär den i fjärdedelar. Inkubera bakre fjärde O / N (16 h) i paraformaldehyd fixativ (4% PFA i PBS) vid 4 ° C. Tvätta 3x i PBS, och sedan överföra till 70% etanol. Varning: PFA är giftig och bör hanteras under en kemisk huva med lämplig personlig skyddsutrustning.

DAG 2:

  1. Placera hjärnan kvartal i inbäddning kassetter och gradvis torkar vävnaden i successivt mer koncentrerad en h etanol bad (70%, 80%, 95% och 100% x3).
  2. Rensa etanol från vävnaden med tre på varandra följande 100% xylen bad (1 h vardera). Varning: Xylen är giftig och shOuld hanteras under en kemisk huva med lämplig personlig skyddsutrustning.
  3. Bädda in vävnad i paraffinblock efter två smälta paraffin vax bad (56-58 ° C, 90 min vardera).

DAG 3:

  1. Skär 10 um tjocka sektioner av paraffininbäddade hjärnor med hjälp av en mikrotom. Doppa sektioner i ett vattenbad (50 ° C under 1 minut) och gäller för objektglas. Låt objektglasen torka O / N, se vävnad vidhäftning till bilden.

2. Immunfärgning

Notera: Olika kombinationer av antikroppar kan utnyttjas för färgningsproceduren som beskrivs nedan. Antikropps cocktails som är kompatibla med hjärnvävnad från råtta och mus är listade i tabell 1.

DAG 4:

  1. Avparaffinera hjärnsektioner med hjälp av 2x 100% xylen bad (12 min vardera).
  2. Rehydrera hjärnsektioner i successiva etanol bad - 100% under 10 minuter, 95% under 5 minuter, 80% under 10 minuter, och slutligen 70% under 15 min - followed av 3x PBS tvättar [5 min vid RT, med lätt agitation]. Under tiden, värmeantigenåtervinning lösningen till 95-97 ° C på en het platta med magnetisk bar omröring.
  3. Inkubera hjärnsektioner i antigenåtervinning lösning vid 95-97 ° C under 30 min. Sedan tvätta 3x i PBS (5 minuter vid RT, med lätt omrörning).
  4. Snabbt torra bilder med hjälp grannlaga uppgift vindrutetorkare för att undvika vävnadstorkning, och rita en hydrofob barriär runt vävnaden med en hydrofob barriär penna. Fyll det inringade vävnadsområdet med blockeringsbuffert [PBS innehållande 0,3% Triton X-100 och 10% Normal Donkey Serum (NDS)], och inkubera vid RT under 1 timme i en fuktad kammare.
  5. Ersätta blockerande buffert med Iba1 primära antikroppen (utspädd i blockeringsbuffert) för att märka mononukleära fagocyter, och inkubera O / N vid 4 ° C i en fuktad kammare. För värdar antikropps och arbetsspäd, se tabell 1 och tabell of Materials.

DAG 5:

  1. Sköljprimär antikropp med 3x PBS bad (5 min vid RT med ljus agitation). Inkubera med fluorescerande sekundär antikropp (konjugerad med en 594 nm emission fluorofor) under 1 timme (i blockerande buffert vid RT i mörker), följt av 3x PBS bad (5 min vid RT med ljus agitation). Vid denna tidpunkt, bibehålla sektionerna i mörker för att undvika fluorescerande signal blekning.

DAG 6 - 7:

  1. Upprepa steg 2,5 och 2,6 med CD68 (råtthjärnor) eller LAMP1 (mus vävnad) antikroppar och lämpliga sekundära antikroppar (i kombination med en 488 nm emission fluorofor) att märka phagolysosomes.

DAG 7-8:

  1. Upprepa steg 2,5 och 2,6 med OC (råttvävnad) eller 4G8 (mushjärnor) antikroppar och lämpliga sekundära antikroppar (kopplad till en 647 nm fluorofor) att märka Ap insättningar.
    OBS: Alternativt kan 6E10 antikropp användas framgångsrikt både på mus och råtta vävnad. För lämpliga antikroppskombinationer, se tabell of Materials
  2. Tillåt avsnitt till helt torr O / N vid RT i mörker. Då prover täck med ett täckglas tätas med fluorescensmonterings media som innehåller DAPI.

3. Förvärv av stora Z-stack Confocal datamängder

Obs: Detta protokoll kräver en helautomatisk laserskanning konfokalmikroskop utrustad med en 60X objektiv och 405 nm, 488 nm, 594 nm och 647 nm lasrar. All utrustning är datorstyrd genom avbildning och laserstyrprogram. Innan du påbörjar avbildningsprotokoll, slå på datorn, epifluorescent lampa, mikroskop, laser och kamera.

DAG 9:

  1. Välj mikroskop målet 60X. Lägg immersionsolja till linsen och placera provet på mikroskop scenen diapositivhållaren. Höja målet tills oljan kommer i kontakt med sliden. Justera fokalplanet att lokalisera amyloida plack i hippocampus eller hjärnbark med hjälp epifluorescent belysning genom okularen.
  2. Förvärva konfokal imåldrarna aktiverade mononukleära fagocyter som omger amyloid insättningar i hippocampus eller cortex av gnagare av konfokalmikroskopi (60X förstoring, z-stack steg: 0,25 um <z <0,40 um, antalet steg 25 <n <35).

4. q3DISM

Obs: För att ge betydande resultat, föreslår vi att analysera minst 3 bilder per djur / region av intresse. För varje bild, kan det överflöd av celler för att analysera variera beroende på experimentella paradigm. I representativa resultat som visas i denna rapport, analyserade vi 3 celler / skick (t.ex. mononukleära fagocyter avlägsna från eller i samband med plack, se figur 1C - D och 2C - D).

DAG 10:

  1. Analysera konfokala dataset med vetenskaplig 3D-bildbearbetning och analys colocalization (coloc) modul för rumslig närhet av Iba1 / CD68 (råttvävnad) eller Iba1 / LAMP1 (mus vävnad) färgning i alla z-plan samtidigt.Skapa Iba + / CD68 + eller Iba + / Lamp1 + colocalization kanaler som motsvarar phagolysosomes inom aktiverade mononukleära fagocyter.
    1. Välj TRITC för kanal A (motsvarande Iba1 färgning tillsammans med 594 nm fluorofor) och FITC för kanal B (motsvarande CD68 eller LAMP1 färgning tillsammans med 488 nm fluorofor). På den högra sidan av fönstret programvara för "lägeskontroll" väljer "tröskel" och "coloc intensiteter" väljer "källkanaler".
    2. Klicka på "Redigera" för att välja "coloc färg" på den högra sidan av fönstret programvara.
    3. För varje kanal oberoende justera trösklar för att inkludera specifik färgning och utesluta bakgrund / icke-specifika signaler. När justeras inte ändra trösklar mellan bilderna för att säkerställa en opartisk analys. De samlokaliserades voxlar (pixlar från alla z-stackar) visas i den färg som valts i steg 4.1.2 i alla z-stackar Simultaneously.
    4. Klicka på "bygga coloc kanal". Den colocalization kanalen skapade visas i fönstret skärmjustering.
    5. Klicka på coloc kanalen för att öppna kanalstatistik. Den "% av volymen / material A ovan tröskeln samlokaliserades" representerar% av Iba1 signal (voxlar som motsvarar 594 nm fluoroforen) samlokaliserades med LAMP1 eller CD68 signal (voxlar som motsvarar 488 nm fluoroforen). Enklare, är detta den monocyt volym som upptas av phagolysosomes (se figurerna 1C och 2C).
      OBS: '% av volymen / material B över tröskeln samlokaliserades "motsvarar% av LAMP1 eller CD68 signal samlokaliserades med Iba1. Detta bör vara nära 100%, som phagolysosomes är intracellulära strukturer. Värdena baseras på förhållandet mellan signal från alla z-stackar över tröskeln samlokaliserades.
  2. Med hjälp av coloc modulen analysera coloc kanalen skapade i steg 4,1 för rumslig närhet med OC (råtta tissue) eller 4G8 (mus vävnad) Ap-signaler. Detta gör det möjligt för kvantifiering av A-beta inkapslad i phagolysosomes.
    1. Välj kanal A coloc dataset (motsvarande Iba1 / CD68 eller Iba1 / LAMP1 coloc kanal som skapats i steg 4,1) och Cy5 för kanal B (motsvarande OC eller 4G8 färgning tillsammans med 647 nm fluorofor).
    2. Bygg en coloc kanal som beskrivs i steg 4.1.2 till 4.1.5.
    3. Klicka på coloc kanalen för att öppna kanalstatistik. Den "% av volymen / material A ovan tröskeln samlokaliserades" representerar% av Iba1 / LAMP1 eller Iba1 / CD68 (voxlar som motsvarar coloc kanal byggdes i steg 4.1.5.) Samlokaliserades med OC eller 4G8 signal (voxlar som motsvarar 647 nm fluorofor). Detta är phagolysosomal volym som upptas av Ap (se figurerna 1D och 2D).
      OBS: '% av volymen / material B över tröskeln samlokaliserades "motsvarar% av den totala Ap signal samlokaliserades med phagolysosomes.Detta kan användas för att utvärdera den del av den totala Ap-insättningar inkapslade i phagolysosomes (ej visade i de föreliggande representativa resultat).
  3. Använd överträffa modulen för att rekonstruera konfokala bildstaplar och generera 3D-modeller av Ap inkapslade i monocyt phagolysosomes.
    1. I "justerings display" fönstret väljer TRITC (för att visa endast Iba1 färgning). I "volym egenskaper" fönstret, klicka på "lägg till ny yta.
    2. I steg '1/5 algoritm ", i" Inställningar "väljer" yta ". Även i "färg" väljer färgtyp i paletten eller RGB och justera insyn (rött är satt till 60% transparens i figurerna 1B och 2B). Kryssrutan "Välj område av intresse". Klicka på Nästa.
    3. I steg "2/5 regionen av intresse," dra ett fönster runt cellen av intresse genom att justera x, y och z-koordinater (se vita rutor i figurerna 1A 2A). Klicka på Nästa.
    4. I steg '3/5 källkanalen ", välj TRITC källkanalen. Markera rutan "mjuk" och ställa yta detaljnivå till 0,4 pm. För "tröskel" väljer absolut intensitet. Klicka på Nästa.
    5. I steg "4/5 tröskel" justera tröskeln så att den volym som skapas lappar perfekt med TRITC kanalsignalen. Klicka på Nästa.
    6. I steg '5/5 klassificera ytor "i avsnittet" filter typ, "markera objekt beroende på deras storlek som ska inkluderas eller exkluderas från de volymer som ska skapas. Klicka på finish, utföra alla steg skapa och avsluta guiden.
    7. Upprepa steg 4.3.1 till 4.3.6 för att skapa en 3D-yta för FITC-kanal (LAMP1 + eller CD68 + phagolysosomes).
    8. Upprepa steg 4.3.1 till 4.3.6 för att skapa en 3D-yta för Cy5 kanal (OC + eller 4G8 + Ap insättningar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Använda flerstegsmetod för q3DISM beskrivs ovan, har vi möjlighet att kvantifiera Ap upptag i monocyt phagolysosomes i hjärnan hos APP / PS1 möss (Figur 1) och TgF344-AD råttor (Figur 2). Därför har q3DISM metodik möjlig analys av mononukleära fagocyter i mus- och råttmodeller av AD. Intressant nog är den volym som upptas av CD68 + phagolysosomes signifikant förhöjd i Iba1 + mononukleära fagocyter som är förknippade med i jämförelse med på avstånd från plack i både APP / PS1 möss (Figur 1B, C) och TgF344-AD-råttor (Figur 2B, C). Dessa data visar att mononukleära fagocyter i närheten av plack är redo för fagocytos jämfört med celler som ligger bort från plattan. För att åskådliggöra de olika data från färgning olika Ap-konformerer, använde vi olika antikroppar i mus och råttvävnad (beskrivs i Table en och diskussion) - vi strävar inte efter att direkt jämföra mus och råttmodeller av AD med avseende på A-beta fagocytos. Ändå var det anmärkningsvärt att plack i samband mononukleära fagocyter hade ökat Ap upptag i APP / PS1 möss jämfört med celler långt från plack (figur 1D). TgF344-AD råttor hade mycket blygsamma upptagning av Ap fibriller övergripande, och ingen förändring i Ap fibrill fagocytos som en funktion av avståndet från plack (figur 2D).

bord 1
Tabell 1: immunfärgning mononukleära fagocyter, Phagolysosomes och Amyloid-β i hjärnvävnad från APP / PS1 möss eller TgF344-AD råttor. Råtta eller mus specifika cocktails antikropps listas med deras respektive värden inom parentes. Färger indikerar fluoroforen som används för den sekundära antikroppen. Röd: Alexa Fluor 594; grön: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.

Figur 1
Figur 1: Visualisering och kvantifiering av amyloid β Fagocytos i APP / PS1 mushjärnor. (A) Confocal bilder av hjärnsektioner från en APP / PS1 mus visar Iba1 + celler (röd), LAMP1 + phagolysosomes (grön) och 4G8 + amyloidavsättningar (magenta). Inset en belyser en enkärnig fagocyter avstånd från plack, medan infälld 2 visar en enkärnig fagocyt samband med plack. Skalstreck betecknar 50 pm. Mindre paneler till höger är utvidgningar av Iba1, LAMP1 och 4G8 signaler inom inläggningar 1 och 2. (B) 3D-rekonstruktion av Iba1, LAMP1 och 4G8 signaler för inläggningar 1 och 2. Skala bar betecknar 3 mikrometer. (C) Kvantifiering av Iba1 + mononukleära fagocytsystemet volym som upptas av LAMP1 + phagolysosomes. ( + phagolysosomal volym som upptas av 4G8 + Ap. Värdena baseras på förhållandet mellan signal (voxlar) över tröskeln som samlokaliserades. Data visas som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (n = 6 celler) för mononukleära fagocyter avlägsna från plack (1), eller i samband med plack (2). ** P <0,01 med Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Visualisering och kvantifiering av amyloid β Fagocytos i TgF344-AD råtthjärnor. (A) Confocal bilder av hjärnsektioner från en TgF344-AD råtta visar Iba1 + celler (röd), CD68 + phagolysosomes (grön), och OC + löslig fibrillärt A & # 946; (magenta). Inset en belyser en enkärnig fagocyter avstånd från plack, medan infälld 2 visar en enkärnig fagocyt samband med plack. Skalstreck betecknar 50 pm. Mindre paneler till höger är utvidgningar av Iba1, CD68 och OC signaler inom inläggningar 1 och 2. (B) 3D-rekonstruktion av Iba1, CD68 och OC signaler för inläggningar 1 och 2. Skala bar betecknar 3 mikrometer. (C) Kvantifiering av Iba1 + mononukleära fagocyter volym som upptas av CD68 + phagolysosomes. (D) Kvantifiering av intracellulär CD68 + phagolysosomal volym som upptas av OC + Ap. Värdena baseras på förhållandet mellan signal (voxlar) över tröskeln som samlokaliserades. Data visas som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (n = 6 celler) för mononukleära fagocyter avlägsna från plack (1), eller i samband med plack (2). ** P <0,01 med Students t-test.rge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som vi beskriver i denna rapport för äkta 3D kvantifiering av Ap fagocytos in vivo genom mononukleära fagocyter bygger på särskild märkning av cellulära och subcellulära fack samt Ap insättningar. Speciellt använder vi Iba1 (joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1), ett protein som är involverat i membranruffling och fagocytos vid cellaktivering 18, 19, för att färga cerebrala mononukleära fagocyter. Medan Iba1 + celler är i allmänhet betraktas som hjärnan-resident mikroglia, är det fortfarande möjligt att perifert infiltrerande mononukleära fagocyter innefattar en delmängd av immunolabeled celler. Intracellulära phagolysosomes avslöjas med antikroppar som känner igen medlemmar av det lysosomala / endosomala associerade membran glykoprotein (LAMP) familj: Lamp1 20 eller CD68 21. Den senare är i första hand lokaliserad till lysosomer och endosomer, med en mindre fraktion som cirkulerar till cell surface. Lamp1 och CD68 antikroppar har båda använts med framgång i råtta och mus vävnad, och beslutet om vilka som ska användas i första hand beroende på mängd andra antikroppar som används för samverkan färgning (se tabell 1). Det är viktigt att vara medveten om att olika antikroppar kan användas för detektering av AP. I mus vävnad, 4G8 (erkänna mänskliga och mus aminosyraresterna 17-24 av Ap-peptid 22, figur 1) och 6E10 (erkänna mänskliga aminosyrarester 1-17 23, data ej visade) har använts med framgång, möjliggör detektion och kvantifiering av A-beta-innehåll i LAMP1 + eller CD68 + phagolysosomes närvarande i Iba1 + mononukleära fagocyter. Med hjälp av vår q3DISM metodik, observerade vi en ökad Ap last i Iba1 + celler associerade med global minskning av A-beta last i hjärnan hos APPPS1 / IL-10 - / - möss 16, medan andra uppvisade minskad Ap upptag in Iba1 + < / sup> celler tillsammans med ökad Ap belastning och plackvolymen hjärnan hos Rag-5xfAD möss 24. Dessa resultat tyder på att fenomenet observeras är en "ögonblicksbild" av aktiv Ap fagocytos, även om vår metod inte kan användas för att förutsäga om fagocyteras material effektivt smälta och rensas.

I råttvävnad, vi upptäckt Ap insättningar med hjälp av OC (erkänna lösliga Ap 42 oligomerer / fibriller 25,26, Figur 2) eller 6E10 17 (ej visad). Intressant, mycket små OC + fibriller fanns i monocyt phagolysosomes i TgF344-AD råtthjärnor. Detta fenomen har tidigare rapporterats i APP23 transgena möss med immunogold färgning och 3D-rekonstruktion 27. Obs: en mängd olika antikroppar för detektering av olika Ap-arter / konforma finns tillgängliga och kan potentiellt testas och användas på användarens diskretion.

nt "> Vår q3DISM teknik har antagits av oss och andra för att kvantifiera Ap-fagocytos i samband med AD 16,24,28. Emellertid kan förfarandet anpassas för att utvärdera praktiskt taget varje form av fagocytos. Den kan också tillämpas på vävnader annat än hjärnan, och andra djurarter (inklusive människan). de förfaranden som beskrivs i detta protokoll förlitar sig på standardimmunfärgning, detekteras med fluorescens och avbildas med en konfokalmikroskop. i denna rapport har vi använt paraffininbäddad vävnad enligt riktlinjer tillhandahålls av de antikropps tillverkare. Om så önskas kan detta protokoll kan också optimeras för färsk vävnad (inbäddade i 2% agaros i PBS). protokollet kan också optimeras för att detektera fagocytos av coaggregating proteiner. Detta möjliggörs genom färgning och förvärva bilder som består av mer än 4 fluorescerande färger 29. i detta fall skulle skapandet av den första colocalization kanal (monocyt / phagolysosome) följas av skapelsenav en andra colocalization kanal (aggregerade protein 1 / co-aggregerat protein 2). Då skulle de två kanalerna användas för 3D-analys och modellering.

Den q3DISM tekniken huvudsakligen begränsas av specificitet och sensitivitet av immunfärgning, kvalitet av antikroppar, och colocalization tillvägagångssätt. Detta flerstegsförfarande har några potentiella fallgropar som kan påverka kvaliteten på färgningen och följaktligen 3D kvantifiering av A-beta-upptag. Det första kritiska steget av förfarandet är isoleringen av gnagar hjärnor. I själva verket är noggrann hantering vävnad grundläggande för att undvika skador på hjärnan och att garantera att hjärnstrukturer förblir intakt när sektione. För det andra, är ganska viktigt vävnadsfixering tid sedan över fixering (mer än 16 timmar i 4% PFA) begränsar detektering av subcellulära phagolysosomes och Ap innehåll. Viktigare, 3) Ap är den successiva färgning av 1) monocyter, 2) phagolysosomes och kritisk för att lyckas med metoden. Det är EssentIAL att använda antikropparna consecutively- inte samtidigt. Dessutom är förvärvet av z-stack konfokala bilder av yttersta vikt, eftersom 3D-modellering av celler, phagolysosomes och Ap-peptid samt colocalization analyser beroende på kvaliteten på avbildning av cellulära och subcellulära strukturer genom tjockleken av vävnadssnittet. Slutligen, är avgörande för 3D-modellering och för samlokalisering analys justering av trösklar i programvaran. Faktum är att tröskelvärden för de olika kanalerna måste väljas med omsorg, eftersom de kommer att avgöra vilken signal ingår (specifik) eller uteslutits (bakgrund) från analysen. Det är också avgörande att de trösklar som valts förblir konsekvent mellan prover när det gäller att jämföra olika djur / prover. Hittills har klassisk immunohistostaining, magnetisk resonanstomografi och positronemissionstomografi varit avbildningsmetoder för val för in vivo visualisering och kvantifiering av Ap30. Visserligen är mycket användbart för storskalig kvantifiering av amyloidbördan i hjärnorna hos gnagare eller AD-patienter, dessa metoder är ineffektiva för visualisering av intracellulär Ap. Andra tekniker som använder konfokalmikroskopi, fluorescensspektroskopi och flödescytometri finns och har använts av oss och andra att diskriminera och kvantifiera intracellulära Ap innehåll in vitro 16,31,32. Immunogold färgning tillsammans med 3D-rekonstruktion har tidigare använts för att markera frånvaron av amyloidfibriller inom mikroglia in vivo i APP23 transgena möss 27, och en annan studie användes framgångsrikt konfokal avbildning och 3D-yta rekonstruktion av mikroglia associerade med p-amyloidplack att visa begränsad Ap interaktion och upptag 33. Men dessa tekniker inte tillåter kvantifiering av inom phagolysosomal Ap arter. Andra har nyligen utvecklat en fluorescensbaserad analys in vivo som tillåter mätningenav fagocytisk aktivitet av perifera makrofager hos råtta 34. Denna metod tillåter sinnrikt för kvantifiering av fluorescerande bioprobes i phagolysosomes in vivo, men data tillgängliga hittills är begränsade till periferin.

Såvitt vi vet är q3DISM den första metoden som ger 3D-visualisering och kvantifiering av A-beta fagocytos i hjärnorna hos gnagare AD-modeller. Detta formidabel verktyg kommer utan tvekan att bana väg för en djupare förståelse av cerebral AP fagocytos, och kan också vara användbar i andra sammanhang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7, (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16, (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330, (6012), 1774 (2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28, (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39, (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518, (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88, (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33, (12), 2949 (2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. 314185 (2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38, (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17, (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85, (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33, (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88, (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60, (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285, (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22, (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7, (278), 33 (2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6, (230), 46 (2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59, (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36, (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36, (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12, (3), 239-246 (2015).
kvantitativ 3D<em&gt; In silico</em&gt; Modeling (q3DISM) av cerebral amyloid-beta Fagocytos i gnagarmodeller av Alzheimers sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter