Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

3D الكمي doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

قمنا بتطوير منهجية ل3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) من دماغي اميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر. ويمكن تعميم هذه الطريقة لتحديد الكميات من أي بلعمة تقريبا في الجسم الحي.

Abstract

يتم الاعتراف Neuroinflammation الآن باعتباره عاملا مسببا رئيسيا في الأمراض العصبية التنكسية. البالعات وحيدات النوى هي الخلايا المناعية الفطرية المسؤولة عن البلعمة وإزالة الأنقاض والمخلفات. وتشمل هذه الخلايا الضامة الجهاز العصبي المركزي المقيمين المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة، والبالعات وحيدات النوى التسلل من المحيط. وعموما استخدمت المجهر الضوئي لتصور البلعمة في القوارض أو عينات الدماغ البشري. ومع ذلك، لم تقدم الطرق النوعية دليل قاطع في الجسم الحي البلعمة. هنا، نحن تصف 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM)، وسيلة قوية تسمح الكميات 3D الحقيقية للاميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في القوارض مرض الزهايمر (AD) نماذج. الطريقة ينطوي على fluorescently تصور Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي في أقسام الدماغ القوارض. مجموعات البيانات مبائر كبيرة زي الأبعاد ثم يتم بناؤها 3D لتحديد الكميات من A &# 946؛ colocalized مكانيا داخل يحلول يبلوعي. ونحن لشرح التطبيق الناجح لq3DISM إلى الماوس والفئران العقول، ولكن يمكن تمديد هذه المنهجية إلى أي بلعمة تقريبا في أي نوع من الأنسجة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مرض الزهايمر (AD)، والأكثر شيوعا المرتبطة بالعمر الخرف يتميز تراكم الدماغية اميلويد β (Aβ) كما ويحات "خرف"، β اميلويد، المزمن neuroinflammation على مستوى منخفض، tauopathy، وفقدان الخلايا العصبية، واضطراب الإدراك 2 . في ميلادي أدمغة المرضى، وخصصت neuroinflammation بواسطة الخلايا النجمية والبالعات وحيدات النوى رد الفعل (ويشار إلى الخلايا الدبقية الصغيرة، على الرغم من المركزية مقابل الأصل المحيطي يزال غير واضح بهم) المحيطة الودائع Aβ 3. كما رقيب المناعة الفطرية للجهاز العصبي المركزي، يتم وضع الخلايا الدبقية الصغيرة مركزيا لمسح الدماغ Aβ. ومع ذلك، ويرافق التوظيف دبقية لويحات Aβ بواسطة القليل جدا، إن وجدت، Aβ البلعمة 4،5. فرضية واحدة هي أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي اعصاب في البداية من قبل phagocytozing التجمعات الصغيرة من Aβ. ومع ذلك، في نهاية المطاف هذه الخلايا تصبح السمية العصبية كما عبء Aβ ساحق و / أو د الوظيفي المرتبط بالعمرecline، يثير الخلايا الدبقية الصغيرة في النمط الظاهري proinflammatory مختلة وظيفيا، والمساهمة في العصبية والمعرفية تراجع 6.

وقد حددت الدراسات رابطة الجينوم على نطاق الأخيرة (GWAS) مجموعة من الأليلات خطر م ينتمون إلى جوهر مسارات المناعية الفطرية 7 التي تعدل البلعمة 8-11. ونتيجة لذلك، أصبحت الاستجابة المناعية لترسب الأميلويد في الدماغ وهي منطقة رئيسية من الاهتمام، سواء من حيث فهم المسببات م ولتطوير أساليب علاجية جديدة 12-14. ومع ذلك، وهناك حاجة ماسة إلى منهجية لتقييم البلعمة Aβ في الجسم الحي. لتلبية هذه الحاجة غير الملباة، وقد وضعنا 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) لتمكين الحقيقية الكميات 3D من الدماغ البلعمة Aβ بواسطة البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر تشبه.

قلة فقط من المدى الذي ألخص المرض، والنماذج الحيوانية لهاثبت لا تقدر بثمن لفهم م pathoetiology ولتقييم العلاجات التجريبية. ونظرا لحقيقة أن الطفرات في الجينات Presenilin (PS) واميلويد السلائف البروتين (APP) يسبب بشكل مستقل وراثي جسمي م، وقد استخدمت هذه الجينات المحورة متحولة على نطاق واسع لتوليد نماذج القوارض المعدلة وراثيا. الفئران المعدلة وراثيا APP / PS1 coexpressing في وقت واحد "السويدي" متحولة APP البشري (سوي APP) وΔ اكسون 9 متحولة presenilin البشري 1 (PS1ΔE9) الحالي مع الداء النشواني الدماغي المتسارع وneuroinflammation 15،16. وعلاوة على ذلك، ونحن قد ولدت الفئران المعدلة وراثيا ثنائية coinjected مع APP سوي ويبني PS1ΔE9 (خط TgF344-AD، على خلفية فيشر 344). وخلافا للنماذج الماوس المعدلة وراثيا من الداء النشواني الدماغي والجرذان TgF344-AD تطوير اميلويد في الدماغ التي تسبق tauopathy، وفقدان أفكارك من الخلايا العصبية، وضعف السلوكي 17.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول للIMMunostaining الخلايا الدبقية الصغيرة، جسيم حال بلعمي ودائع Aβ في أقسام الدماغ من الفئران APP / PS1 والجرذان TgF344-AD، والحصول على الصور مبائر كبيرة زي الأبعاد. نحن من التفصيل في توليد وتحليل عمليات إعادة البناء 3D الحقيقية من مجموعات البيانات مبائر يسمح الكميات من Aβ امتصاص إلى جسيم حال بلعمي دبقية SILICO. وعلى نطاق أوسع، ومنهجية أننا التفاصيل هنا يمكن أن تستخدم لقياس تقريبا أي شكل من أشكال البلعمة في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد وافق جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات بالتفصيل في هذه الوثيقة من قبل جامعة جنوب كاليفورنيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، وأجرى بما يتفق بدقة مع المعاهد الوطنية للإرشادات الصحة والتوصيات الصادرة عن جمعية للتقويم والاعتماد للمختبر: بيان من أخلاقيات البحث رعاية الحيوان الدولية.

1. القوارض عزل الدماغ والتحضير لالمناعية

اليوم 1:

  1. ضع الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران TgF344-AD (من العمر 14 شهرا) أو APP / الفئران PS1 (عمره 12 شهرا) تحت التخدير المستمر الأيزوفلورين العميق (4٪). تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميها، وعدم وجود رد فعل الانسحاب.
  2. قطع طريق جانبي القفص الصدري ورفع لفضح القلب. إدراج 23 G الإبرة في البطين الأيسر من القلب وإجراء شق صغير في الأذين الأيمن. انتقل إلى استنزاف من قبل نضح transcardial مع الفوسفات مخزنة المالحة المثلج(PBS) باستخدام مضخة تحوي (30 مل للفئران، 150 - 200 مل بالنسبة للفئران).
  3. جعل شق خط الوسط الذيلية في الجلد ونقل الجلد والعضلات جانبا. قطع طريق الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط وبين العينين. إزالة لوحات العظام وعزل كامل الدماغ من الجمجمة.
  4. وضع الدماغ في الاكليلية مصفوفة الدماغ القوارض وشريحة إلى أرباع. احتضان أرباع الخلفية O / N (16 ساعة) في تثبيتي بارافورمالدهيد (4٪ PFA في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية. غسل 3X في برنامج تلفزيوني، ونقل بعد ذلك إلى 70٪ من الإيثانول. تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها تحت غطاء الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

يوم 2:

  1. ضع أرباع الدماغ إلى أشرطة تضمين وتدريجيا يذوى الأنسجة في أكثر تركيزا على التوالي الحمامات الايثانول 1 ساعة (70٪، 80٪، 95٪، و 100٪ X3).
  2. الإيثانول واضح من الأنسجة مع ثلاثة حمامات زيلين 100٪ المتعاقبة (1 ساعة لكل منهما). تحذير: الزيلين غير سامة وSHولد التعامل معها تحت غطاء الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. تضمين الأنسجة في كتل البارافين بعد حمامات اثنين المنصهرة شمع البارافين (56-58 درجة مئوية، 90 دقيقة لكل منهما).

اليوم 3:

  1. قطع 10 أقسام ميكرون سميكة من العقول جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مشراح. أقسام تراجع في حمام مائي (50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)، وتنطبق على المجهر الشرائح. ترك الشرائح لتجف O / N، وضمان التصاق الأنسجة إلى الشريحة.

2. المناعية

ملاحظة: يمكن استخدام مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة لهذا الإجراء تلطيخ هو موضح أدناه. وترد الكوكتيلات الأجسام المضادة متوافقة مع أنسجة المخ من الجرذان والفئران في الجدول 1.

اليوم 4:

  1. Deparaffinize أقسام الدماغ باستخدام 2X حمامات زيلين 100٪ (12 دقيقة لكل منهما).
  2. ترطيب أقسام الدماغ في الحمامات الايثانول المتعاقبة - 100٪ لمدة 10 دقيقة، و 95٪ لمدة 5 دقائق، و 80٪ لمدة 10 دقيقة، وأخيرا 70٪ لمدة 15 دقيقة - اتباعها!د يغسل PBS 3X [5 دقائق على RT، مع الإثارة الخفيفة]. وفي الوقت نفسه، الحرارة استرجاع مستضد حل 95-97 درجة مئوية على طبق ساخن مع شريط التحريك المغناطيسي.
  3. احتضان أقسام الدماغ في مستضد حل استرجاع في 95-97 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، وغسل 3X في برنامج تلفزيوني (5 دقائق على RT، مع الإثارة الخفيفة).
  4. بسرعة الشرائح الجافة باستخدام مساحات مهمة حساسة لتجنب تجفيف الأنسجة، ورسم حاجز مسعور حول منطقة الأنسجة باستخدام قلم حاجز مسعور. ملء منطقة الأنسجة مطوقة مع عازلة تمنع [برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 و 10٪ عادي حمار المصل (NDS)]، واحتضان في RT لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب.
  5. استبدال عازلة تمنع مع الأجسام المضادة الأولية Iba1 (المخفف في المخزن حجب) لتسمية البالعات وحيدات النوى، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب. المضيفين الأجسام المضادة والتخفيفات العمل، انظر الجدول رقم 1 وجدول المواد.

اليوم 5:

  1. شطفالأجسام المضادة الأولية مع حمامات 3X PBS (5 دقائق على RT مع الإثارة الخفيفة). احتضان مع الأجسام المضادة الفلورسنت الثانوي (مترافق مع fluorophore انبعاث 594 نانومتر) لمدة 1 ساعة (في عرقلة العازلة في RT في الظلام) تليها حمامات 3X PBS (5 دقائق على RT مع الإثارة الخفيفة). في هذا الوقت، والحفاظ على المقاطع في الظلام لتجنب تبييض إشارة الفلورسنت.

DAY 6-7:

  1. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 مع CD68 (أدمغة الفئران) أو LAMP1 (الأنسجة الماوس) الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية المناسبة (إلى جانب وجود fluorophore انبعاث 488 نانومتر) لتسمية جسيم حال بلعمي.

DAY 7-8:

  1. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 مع OC (أنسجة الفئران) أو 4G8 (أدمغة فئران) الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية المناسبة (بالإضافة إلى fluorophore 647 نانومتر) لتسمية الودائع Aβ.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة 6E10 بنجاح سواء على الماوس والفئران الأنسجة. لمجموعات الأجسام المضادة المناسبة، انظر جدول المواد
  2. تسمح المقاطع لكامل يا جاف / N في RT في الظلام. ثم، غطاء عينات مع زلة تغطية مختومة من قبل مضان وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي دابي.

3. اكتساب كبير Z كومة متحد البؤر مجموعات البيانات

ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب مؤتمتة بالكامل المسح بالليزر المجهر متحد البؤر مجهزة الهدف 60X و 405 نانومتر، 488 نانومتر، 594 نانومتر، والليزر 647 نانومتر. جميع أجهزة الكمبيوتر التي تسيطر عليها التصوير والمراقبة ليزر البرمجيات. قبل بداية بروتوكول التصوير، والطاقة على جهاز الكمبيوتر، مصباح epifluorescent، المجهر، وأشعة الليزر والكاميرا.

يوم 9:

  1. حدد الهدف المجهر 60X. إضافة زيت الغمر إلى العدسة، ووضع العينة على حامل المجهر مرحلة الشرائح. رفع الهدف حتى يجعل النفط اتصال مع الشريحة. ضبط البؤري لتحديد موقع اللويحات النشوانية في قرن آمون أو القشرة الدماغية باستخدام الإضاءة epifluorescent من خلال oculars.
  2. الحصول على ايم متحد البؤرالأعمار من البالعات وحيدات النوى تنشيط المحيطة الودائع اميلويد في قرن آمون أو قشرة من القوارض بواسطة المجهر متحد البؤر (60X التكبير، خطوات ض المكدس: 0.25 ميكرون <ض <0.40 ميكرون، عددا من الخطوات 25 <ن <35).

4. q3DISM

ملاحظة: من أجل تحقيق نتائج هامة، فإننا نقترح تحليل ما لا يقل عن 3 صور لكل حيوان / المنطقة من اهتمام. لكل صورة، وفرة من الخلايا لتحليل قد تختلف اعتمادا على النماذج التجريبية. في نتائج تمثيلية هو مبين في هذا التقرير، قمنا بتحليل 3 خلايا / حالة (على سبيل المثال، البالعات وحيدات النوى بعيدة عن أو المرتبطة ويحات، وانظر الأرقام 1C - D و2C - D).

اليوم 10:

  1. تحليل مجموعات البيانات متحد مع colocalization معالجة الصور 3D العلمي وتحليل البرمجيات (coloc) وحدة للقرب المكاني للIba1 / CD68 (أنسجة الفئران) أو Iba1 / LAMP1 (الأنسجة الماوس) تلطيخ في جميع الطائرات ض في وقت واحد.إنشاء إيبا + / CD68 + أو + إيبا / LAMP1 + colocalization القنوات التي تتوافق مع جسيم حال بلعمي داخل البالعات وحيدات النوى تفعيلها.
    1. اختر TRITC لقناة ألف (الموافق Iba1 تلطيخ جانب 594 نانومتر fluorophore) وFITC للقناة ب (الموافق CD68 أو تلطيخ LAMP1 إلى جانب 488 نانومتر fluorophore). على الجانب الأيمن من نافذة البرنامج ل"وضع الاختيار، '' عتبة،" اختيار ول 'شدة coloc،' اختر 'قنوات المصدر'.
    2. انقر على "تحرير" لتحديد "اللون coloc" على الجانب الأيمن من نافذة البرنامج.
    3. لكل قناة بشكل مستقل، وضبط عتبات لتشمل تلطيخ محددة واستبعاد / إشارات خلفية غير محددة. مرة واحدة تعديلها، لا تتغير عتبات بين الصور لضمان تحليل غير متحيز. سوف تظهر voxels colocalized (بكسل من كل مداخن ض) في اللون المحدد في الخطوة 4.1.2 في كل رزمة ض SIMultaneously.
    4. انقر على "بناء قناة coloc". سوف قناة colocalization إنشاؤها تظهر في إطار تعديل العرض.
    5. انقر على قناة coloc لفتح إحصاءات القناة. و'٪ من حجم / المواد ألف أعلاه عتبة colocalized "تمثل٪ من إشارة Iba1 (voxels المقابلة لfluorophore 594 نانومتر) colocalized مع LAMP1 أو إشارة CD68 (voxels المقابلة لfluorophore 488 نانومتر). ببساطة أكثر، وهذا هو حجم الوحيدات التي كتبها جسيم حال بلعمي (انظر الأرقام 1C و2C) المحتلة.
      ملاحظة: '٪ من حجم / المواد (ب) أعلاه عتبة colocalized "يناظر٪ من LAMP1 أو CD68 إشارة colocalized مع Iba1. وينبغي أن تكون قريبة من 100٪، كما جسيم حال بلعمي هي هياكل داخل الخلايا. تستند القيم على نسبة إشارة من كل مداخن ض فوق عتبة colocalized.
  2. باستخدام وحدة coloc، وتحليل قناة coloc بإنشائه في الخطوة 4.1 لقربها المكاني مع OC (الفئران منظمة الشفافية الدوليةssue) أو 4G8 (الأنسجة الماوس) إشارات Aβ. وهذا يسمح لتحديد الكميات من Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي.
    1. حدد القناة مجموعة البيانات coloc (المقابلة لIba1 / CD68 أو قناة Iba1 / LAMP1 coloc بإنشائه في الخطوة 4.1) وCy5 لقناة B (الموافق OC أو 4G8 تلطيخ جانب 647 نانومتر fluorophore).
    2. بناء قناة coloc كما هو موضح في الخطوات 4.1.2 إلى 4.1.5.
    3. انقر على قناة coloc لفتح إحصاءات القناة. و'٪ من حجم / المواد ألف أعلاه عتبة colocalized "تمثل٪ من Iba1 / LAMP1 أو Iba1 / CD68 (voxels المقابلة لقناة coloc بنيت في الخطوة 4.1.5.) colocalized مع OC أو إشارة 4G8 (voxels المقابلة ل647 fluorophore نانومتر). هذا هو حجم phagolysosomal بواسطة Aβ (انظر الأرقام 1D و 2D) المحتلة.
      ملاحظة: '٪ من حجم / المواد (ب) أعلاه عتبة colocalized "يتوافق مع٪ من إجمالي إشارة Aβ colocalized مع جسيم حال بلعمي.وهذا يمكن أن تستخدم لتقييم نسبة من إجمالي الودائع Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي (لا يظهر في نتائج تمثيلية الحالية).
  3. استخدم تجاوز وحدة لإعادة بناء مداخن صورة مبائر وتوليد نماذج 3D من Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي الوحيدات.
    1. في الإطار "تعديل عرض"، حدد TRITC (لإظهار تلطيخ فقط Iba1). في الإطار "خصائص الصوت"، انقر فوق "إضافة سطح جديد".
    2. في خطوة "1/5 خوارزمية"، في "ضبط"، اختر "سطح". أيضا، في "اللون"، اختر نوع اللون في لوحة أو RGB وضبط الشفافية (يتم تعيين الأحمر في 60٪ من الشفافية في الأرقام 1B و 2B). خانة الاختيار "تحديد المنطقة ذات الاهتمام. انقر فوق التالي.
    3. في الخطوة '2/5 المنطقة من اهتمام، "رسم نافذة حول الخلية من الفائدة من خلال تعديل س، ص والإحداثيات ض (انظر المربعات البيضاء في أرقام 1A و2A). انقر فوق التالي.
    4. في الخطوة '3/5 قناة مصدر "، حدد قناة مصدر TRITC. ضع علامة في المربع "ناعمة"، وتعيين مستوى التفاصيل المساحة إلى 0.4 ميكرون. ل"العتبة"، اختر كثافة المطلقة. انقر فوق التالي.
    5. في الخطوة '4/5 عتبة، "ضبط عتبة حتى أن حجم إنشاؤها يتداخل تماما مع إشارة قناة TRITC. انقر فوق التالي.
    6. في الخطوة '5/5 تصنيف السطوح، "في قسم" نوع التصفية، "تحديد كائنات حسب حجمها ليتم تضمينها أو استبعادها من الكميات المراد إنشاؤه. انقر فوق إنهاء وتنفيذ جميع الخطوات الخلق، وإنهاء المعالج.
    7. كرر الخطوات من 4.3.1 إلى 4.3.6 لخلق سطح 3D لقناة FITC (LAMP1 + أو CD68 + جسيم حال بلعمي).
    8. كرر الخطوات من 4.3.1 إلى 4.3.6 لخلق سطح 3D لقناة Cy5 (OC + أو الودائع 4G8 + Aβ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

باستخدام منهجية متعددة المراحل لq3DISM المفصلة أعلاه، ونحن قادرون على تحديد Aβ امتصاص إلى جسيم حال بلعمي الوحيدات في أدمغة APP / الفئران PS1 (الشكل 1) والجرذان TgF344-AD (الشكل 2). ولذلك، فقد مكنت منهجية q3DISM تحليل البالعات وحيدات النوى في الماوس والفئران نماذج من م. ومن المثير للاهتمام، وزاد حجم التداول بنسبة CD68 + جسيم حال بلعمي المحتلة بشكل كبير في Iba1 + البالعات وحيدات النوى المرتبطة مقارنة بعيدة عن لويحات على حد سواء في APP / الفئران PS1 (الشكل 1B، C) والجرذان TgF344-AD (الشكل 2B، C). وتشير هذه البيانات إلى أن البالعات وحيدات النوى قرب ويحات تستعد لالبلعمة مقارنة مع خلايا تقع بعيدا عن اللوحة. من أجل توضيح مجموعة من البيانات من تلطيخ المتشاكلات Aβ مختلفة، وكنا الأجسام المضادة المختلفة في الماوس والأنسجة الفئران (المفصل في تابلي 1 و المناقشة) - نحن لا نسعى للمقارنة مباشرة الماوس والفئران نماذج من م فيما يتعلق Aβ البلعمة. ومع ذلك، فإنه من الجدير بالملاحظة أن اللوحة المرتبطة البالعات وحيدات النوى زادت Aβ امتصاص في الفئران APP / PS1 مقارنة مع الخلايا البعيدة من لويحات (1D الشكل). كانت الفئران TgF344-AD امتصاص متواضع جدا من الألياف Aβ عموما، وأي تغيير في Aβ ليفية البلعمة بوصفها وظيفة من المسافة من لويحات (الشكل 2D).

الجدول 1
الجدول 1: المناعية وحيدات النوى البالعات، جسيم حال بلعمي واميلويد β في أنسجة المخ من الفئران APP / PS1 أو الجرذان TgF344-AD. وترد الفئران أو الماوس الكوكتيلات الأجسام المضادة مع المضيف كل منهما بين قوسين. وتشير ألوان fluorophore المستخدمة في الضد الثانوية. الأحمر: فلور اليكسا 594. الأخضر: فلور اليكسا 488.أرجواني: فلور اليكسا 647.

شكل 1
الشكل 1: التصور والكميات من اميلويد β البلعمة في أدمغة APP / PS1 ماوس. (A) صور متحد البؤر من أقسام الدماغ من APP / الماوس PS1 تظهر Iba1 خلايا + (الحمراء)، LAMP1 + جسيم حال بلعمي (الخضراء) و4G8 + الودائع اميلويد (أرجواني). أقحم 1 يسلط الضوء على بلعمية وحيدات النوى البعيدة من اللوحة، في حين أقحم 2 يظهر بلعمية وحيدات النوى المرتبطة البلاك. شريط مقياس يدل 50 ميكرون. لوحات صغيرة على اليمين هي التوسعات من Iba1، LAMP1 و4G8 إشارات داخل إدراجات 1 وإعادة الإعمار 2. (ب) 3D من Iba1، LAMP1 وإشارات 4G8 عن إدراجات 1 و 2. شريط مقياس يدل 3 ميكرون. (C) الكميات من Iba1 + حجم وحيدات النوى بلعمية التي كتبها LAMP1 + جسيم حال بلعمي المحتلة. ( + phagolysosomal حجم التداول بنسبة 4G8 + Aβ المحتلة. تستند القيم على نسبة إشارة (voxels) أعلاه العتبة التي colocalized. وأظهرت البيانات يعني كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(ن = 6 خلايا) لالبالعات وحيدات النوى بعيدة عن لوحات (1)، أو المرتبطة ويحات (2). ** ف <0.01 كتبها t-اختبار الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التصور والكميات من اميلويد β البلعمة في أدمغة الفئران TgF344-AD. (A) صور متحد البؤر من أقسام الدماغ من الفئران TgF344-AD تظهر Iba1 + الخلايا (الحمراء)، CD68 + جسيم حال بلعمي (الأخضر)، وOC + قابل للذوبان لييفي A & # 946؛ (أرجواني). أقحم 1 يسلط الضوء على بلعمية وحيدات النوى البعيدة من اللوحة، في حين أقحم 2 يظهر بلعمية وحيدات النوى المرتبطة البلاك. شريط مقياس يدل 50 ميكرون. لوحات صغيرة على اليمين هي التوسعات من Iba1، CD68 وإشارات OC ضمن الأشكال 1 و 2. (ب) 3D اعادة اعمار Iba1، CD68 وإشارات OC للإدراجات 1 و 2. شريط مقياس يدل على 3 ميكرون. (C) الكميات من Iba1 + حجم وحيدات النوى بلعمية التي كتبها CD68 + جسيم حال بلعمي المحتلة. (د) الكميات من الخلايا CD68 + phagolysosomal حجم التداول بنسبة OC + Aβ المحتلة. تستند القيم على نسبة إشارة (voxels) أعلاه العتبة التي colocalized. وأظهرت البيانات يعني كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(ن = 6 خلايا) لالبالعات وحيدات النوى بعيدة عن لوحات (1)، أو المرتبطة ويحات (2). ** ف <0.01 كتبها t-اختبار الطالب.rge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البروتوكول الذي وصفنا في هذا التقرير لتحديد الكميات 3D الحقيقية للAβ البلعمة في الحي بواسطة البالعات وحيدات النوى يعتمد على وضع العلامات المحددة من المقصورات الخلوية والتحت خلوية وكذلك الودائع Aβ. على وجه التحديد، ونحن نستخدم Iba1 (مؤين الكالسيوم ملزم محول جزيء 1)، وهو البروتين الذي يشارك في الإزعاج غشاء والبلعمة على تنشيط الخلايا 18، 19، إلى وصمة عار البالعات وحيدات النوى الدماغية. في حين تعتبر خلايا Iba1 + عموما الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين في الدماغ، فإنه لا يزال من الممكن أن التسلل محيطيا البالعات وحيدات النوى وتضم مجموعة فرعية من الخلايا immunolabeled. وكشف جسيم حال بلعمي الخلايا مع الأجسام المضادة التي تعترف أفراد الأسرة الليزوزومية / المصاحب endosomal غشاء بروتين سكري (LAMP): LAMP1 20 أو CD68 21. يتم ترجمة هذا الأخير في المقام الأول إلى الجسيمات الحالة والإندوسومات، مع جزء أصغر تنتشر إلى الخلية الصورةوجهك. وسواء استخدمت LAMP1 وCD68 الأجسام المضادة بنجاح في الجرذان والفئران الأنسجة، والقرار الذي لاستخدام يعتمد في المقام الأول على مجموعة من الأجسام المضادة الأخرى المستخدمة للمشاركة في تلطيخ (انظر الجدول 1). من المهم أن ندرك أن الأجسام المضادة المختلفة يمكن أن تستخدم للكشف عن Aβ. في الأنسجة الماوس، 4G8 (الاعتراف بقايا الأحماض الأمينية الماوس الإنسان و17-24 من Aβ الببتيد 22، الشكل 1) و6E10 (الاعتراف بقايا الأحماض الأمينية البشرية 1-17 23، لا تظهر البيانات) وقد استخدمت بنجاح، مما يسمح للكشف وتحديد الكميات من محتوى Aβ في LAMP1 + أو CD68 + جسيم حال بلعمي الحالية في البالعات وحيدات النوى Iba1 +. باستخدام منهجية q3DISM لدينا، لاحظنا زيادة الحمل Aβ في Iba1 + الخلايا المرتبطة مع تخفيض العالمي للتحميل Aβ في أدمغة APPPS1 / IL-10 - / - الفئران 16، في حين أظهر آخرون انخفاض امتصاص Aβ إلى Iba1 + < / sup> في خلايا يرافقه زيادة Aβ الحمل والبلاك حجم في أدمغة خرقة-5xfAD الفئران 24. وتشير هذه النتائج إلى أن هذه الظاهرة لوحظت هي "لقطة" من النشطة البلعمة Aβ، على الرغم من أن منهجيتنا لا يمكن استخدامها للتنبؤ إذا يهضم المواد المبتلعة بكفاءة وتطهيرها.

في أنسجة الفئران، اكتشفنا الودائع Aβ باستخدام OC (الاعتراف القابلة للذوبان Aβ 42 الأوليغومرات / الألياف 25،26، الشكل 2) أو 6E10 17 (لا يظهر). ومن المثير للاهتمام، وكانت صغيرة جدا OC + الألياف الموجودة في جسيم حال بلعمي الوحيدات في أدمغة الفئران TgF344-AD. وقد سبق أن ذكرت هذه الظاهرة في الفئران المعدلة وراثيا APP23 باستخدام تلطيخ immunogold و 3D إعادة الإعمار 27. ملاحظة: مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة للكشف عن مختلف Aβ الأنواع / المتشاكلات متاحة ويحتمل أن يتم اختبارها والمستخدمة في تقدير المستخدم.

الإقليم الشمالي "> وقد تم اعتماد تقنية q3DISM لدينا من قبل الولايات المتحدة وغيرها لتحديد Aβ البلعمة في سياق م 16،24،28. ومع ذلك، فإن الطريقة يمكن تكييفها لتقييم تقريبا أي شكل من أشكال البلعمة. ويمكن أيضا تطبيقه على أنسجة البعض من الدماغ، والأنواع الحيوانية الأخرى (بما في ذلك البشر). الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول تعتمد على المناعية القياسية، مع الكشف عن مضان والمصورة مع المجهر متحد البؤر. وفي هذا التقرير، وقد استخدمنا الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين وفقا للمبادئ التوجيهية المقدمة من قبل الشركات المصنعة للأجسام المضادة. إذا رغبت في ذلك، ويمكن أيضا أن يكون الأمثل في هذا البروتوكول للأنسجة جديدة (جزءا لا يتجزأ في 2٪ الاغاروز في برنامج تلفزيوني)، ويمكن أيضا أن يكون الأمثل بروتوكول للكشف عن البلعمة من coaggregating البروتينات. وقد أصبح هذا ممكنا من قبل تلطيخ واكتساب الصور تتكون من أكثر من 4 ألوان الفلورسنت (29). وفي هذه الحالة، سيتبع إنشاء قناة colocalization الأولى (الوحيدات / يحلول يبلوعي) من خلال خلققناة colocalization الثانية (تجميع البروتين 1 / تجميع شارك في البروتين 2). ثم، فإن القناتين أن تستخدم لتحليل 3D والنمذجة.

تقنية q3DISM يقتصر أساسا من خصوصية وحساسية المناعية، ونوعية الأجسام المضادة، ونهج colocalization. هذا الإجراء متعددة الخطوات لديها عدد قليل من المزالق المحتملة التي يمكن أن تؤثر على نوعية تلطيخ، وبالتالي، 3D الكميات من Aβ امتصاص. الخطوة الأولى الحاسمة من هذا الإجراء هو عزل أدمغة القوارض. في الواقع، والتعامل مع الأنسجة دقيق أمر أساسي لتجنب تلف في خلايا المخ وضمان أن تكون هياكل الدماغ لا تزال سليمة عندما مقطوع. ثانيا، الساعة تثبيت الأنسجة من المهم جدا منذ أكثر التثبيت (أكثر من 16 ساعة في PFA 4٪) يحد الكشف عن جسيم حال بلعمي التحت خلوية والمحتوى Aβ. الأهم من ذلك أن تلطيخ على التوالي من 1) حيدات، 2) جسيم حال بلعمي و3) Aβ أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه الطريقة. ومن ESSENTالاتحاد العالمي للتعليم لاستخدام الأجسام المضادة consecutively- ليس في نفس الوقت. بالإضافة إلى ذلك، واقتناء الصور مبائر ض المكدس هو من أهمية قصوى، منذ النمذجة 3D من الخلايا، جسيم حال بلعمي وAβ الببتيد وكذلك colocalization تحليلات تعتمد على جودة التصوير من الهياكل الخلوية والتحت خلوية من خلال سمك من قسم الأنسجة. وأخيرا، وتعديل عتبات في البرنامج هو أمر حاسم لالنمذجة 3D ولتحليل colocalization. في الواقع، لا بد من اختيارها بعناية، لأنها ستحدد إشارة يتم تضمين (محددة) أو استبعاد (الخلفية) من تحليل العتبات لقنوات مختلفة. بل هو أيضا الأساسي الذي العتبات اختيار تبقى ثابتة بين العينات في حالة المقارنة بين مختلف الحيوانات / العينات. حتى الآن، كانت immunohistostaining الكلاسيكية، التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني أساليب التصوير من خيار في الجسم الحي التصور والكميات من Aβ30. على الرغم من المفيد للغاية لتحديد الكميات الكبيرة من عبء اميلويد في أدمغة القوارض أو المرضى ميلادي، وهذه الأساليب غير فعالة لرؤية الخلايا Aβ. تقنيات أخرى باستخدام المجهر متحد البؤر، التحليل الطيفي مضان والتدفق الخلوي موجودة وتم استخدامها من قبل الولايات المتحدة وغيرها للتمييز وتحديد محتوى Aβ الخلايا في المختبر 16،31،32. تلطيخ Immunogold إلى جانب إعادة الإعمار 3D كانت تستخدم في السابق لتسليط الضوء على عدم وجود الألياف اميلويد داخل الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي في APP23 الفئران المعدلة وراثيا 27، ودراسة أخرى استخدمت بنجاح متحد البؤر التصوير و 3D إعادة الإعمار سطح الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة مع ويحات β اميلويد لإظهار Aβ محدود التفاعل وامتصاص 33. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تسمح الكميات من داخل phagolysosomal الأنواع Aβ. تطورت الآخرين مؤخرا المستندة إلى مضان في فحص الجسم الحي والسماح للقياسالنشاط أكلة الضامة الطرفية في الفئران (34). هذا الأسلوب يسمح مبدع لتحديد الكميات من bioprobes الفلورسنت في جسيم حال بلعمي في الجسم الحي، ولكن البيانات المتاحة محدودة حتى الآن إلى المحيط.

على حد علمنا، q3DISM هو الأسلوب الأول الذي يتيح التصور 3D والكميات من Aβ البلعمة في أدمغة نماذج القوارض م. مما لا شك فيه أن هذه أداة هائلة تمهد الطريق إلى فهم أعمق لالدماغية البلعمة Aβ، ويمكن أن تكون مفيدة في سياقات أخرى أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7, (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16, (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330, (6012), 1774 (2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28, (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39, (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518, (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88, (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33, (12), 2949 (2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. 314185 (2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38, (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17, (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85, (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33, (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88, (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60, (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285, (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22, (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7, (278), 33 (2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6, (230), 46 (2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59, (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36, (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36, (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12, (3), 239-246 (2015).
3D الكمي<em&gt; في السيليكو</em&gt; النمذجة (q3DISM) من الدماغيه اميلويد بيتا البلعمة في نماذج القوارض من مرض الزهايمر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter