Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تعديل وFunctionalization مجموعة جوانيداين من السلائف مصممة خصيصا

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

ويرد بروتوكول لتركيب guanidines المعدلة ألكيل تعتمد على استخدام السلائف المقابلة.

Abstract

مجموعة غوانيدين هي واحدة من المجموعات pharmacophoric الأكثر أهمية في الكيمياء الطبية. الأحماض الأمينية الوحيد تقل مجموعة غوانيدين هو أرجينين. في هذه المقالة، يتم توفير وسيلة سهلة لتعديل مجموعة غوانيدين في بروابط ببتيدية، مع مثال بروابط إنتغرين ملزم RGD. وقد تجلى مؤخرا أن تعديل متميزة من مجموعة غوانيدين في هذه بروابط يسمح لتعديل انتقائي من النوع الفرعي (على سبيل المثال، بين الأنواع الفرعية αv وα5). وعلاوة على ذلك، وقد تجلى استراتيجية لم تكن معروفة سابقا للfunctionalization عبر مجموعة غوانيدين، ويتم مراجعة النهج الاصطناعية في هذه الوثيقة. التعديلات الموضحة هنا عضال (N ω) مجموعة غوانيدين الألكيلية والأسيتيل. لتركيب، ويتم تخليق جزيئات السلائف مصممة خصيصا، تخضع بعد ذلك إلى رد فعل مع أمين deprotected متعامد لنقل قبلمجموعة غوانيدين -modified. لتركيب guanidines الألكيلية والسلائف على أساس N، وتستخدم N '-Di-بوك-1 H-1--pyrazole carboxamidine لتجميع المركبات acylated، مقدمة من اختيار كونه مشتق acylated المقابل من N -Boc- S - methylisothiourea، والتي يمكن الحصول عليها في ردود فعل واحدة وخطوتين.

Introduction

بين المجموعات pharmacophoric الأكثر وفرة في بروابط الطبيعية هي مجموعة غوانيدين، التي تشارك في التفاعلات متعددة 1 و 2. على سبيل المثال، فإنه بمثابة أربعة أضعاف هيدروجين المحتملين في التفاعلات الرابطة الهيدروجينية وتشارك في التفاعلات كهرباء، مثل الجسور الملح أو التفاعلات الموجبة π. في الكيمياء الطبية وكثيرا ما وجدت هذه المجموعة في المخدرات والأدوية المرشحة 4، على الرغم من أن في كثير من الأحيان كما محاكيات غوانيدين 5، 6. والسبب في تطوير محاكيات غوانيدين هو إزالة أو جماعة غوانيدين في كل مكان موجبة الشحنة، وكذلك تعديل بالانجذاب ليجند. في بروابط ببتيدية، والتي تحتوي على مجموعة من الأحماض الأمينية غوانيدين الوحيد هو أرجينين، وهو لذلك غالبا ما توجد في المنطقة النشطة بيولوجيا من بروابط ببتيدية.

A العلاقات العامة جدامثال ominent لأسرة يجند التي تحتوي على أرجينين هو فصيلة من integrins ملزم RGD. بشكل عام، integrins هي فئة من مستقبلات الخلايا الالتصاق، التي تولي الوظائف الهامة في جميع الكائنات العليا. بعض هذه الوظائف تشمل التصاق الخلايا، والهجرة، وبقاء الخلية. وهكذا، أنهم متورطون أيضا في المؤشرات المرضية، مثل السرطان والتليف. Integrins هي بروتينات heterodimeric الغشاء يتكون من α- وβ-الوحيدات التي تشكل 24 فرعية إنتغرين المعروفة حاليا. 8 منهم التعرف على تسلسل ثلاثي الببتيد الارجنتين-الغليسين-آسيا والمحيط الهادئ (= RGD) في بروابط من 7. يقع في المنطقة ملزمة في مجال التفاعل بين هذه الأنواع الفرعية اثنين في الجزء خارج الخلية، ويسمى إنتغرين رئيس مجموعة 8. ومن المسلم RGD من قبل اثنين من التفاعلات المشتركة: الموقع التصاق يعتمد معدن أيون-المنطقة (MIDAS)، والذي يقع في الوحيدات بيتا والذي يربط حمض الكربوكسيلية في بروابط (تشا الجانبفي لآسيا والمحيط الهادئ)؛ ومجموعة غوانيدين في بروابط، الذي يقع في الوحيدات ألفا. معظم الأنواع الفرعية إنتغرين هي منحل وتشترك في جزء على الأقل من المصفوفة خارج الخلية الطبيعية (ECM) بروابط 9. وهكذا، لتطوير بروابط إنتغرين الاصطناعية، فإن التركيز الرئيسي هو، إلى جانب تقارب ملزم عالية، والانتقائية النوع الفرعي. في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على كشف النقاب عن العناصر الرئيسية لتوليد بروابط-النوع الفرعي الانتقائي: مجموعة غوانيدين. من خلال تعديلات متميزة، بروابط biselective لαv- وα5 التي تحتوي على أنواع فرعية إنتغرين يمكن أن تتحول إلى مركبات انتقائية تعديلات بسيطة على مجموعة غوانيدين، والتي يمكن بعد ذلك تميز مختلف α-الوحدات الصغرى 10.

في جيب αv، مجموعة غوانيدين تتفاعل جنب على طريق جسر ملح ثنائي الأسنان مع Asp218 11 و 12. هذا التفاعل جوأيضا لوحظ في α5β1 (هنا، مع Asp227 في α5)، ولكن بالإضافة إلى ذلك، لوحظ حدا على التفاعل بين مجموعة غوانيدين مع بقايا GLN (Gln221) هناك (13). وبالتالي، فإننا تعديل مجموعة غوانيدين بطريقتين المعاكس: في حالة واحدة، من خلال منع الجانب على التفاعل مع مثيلة من δ N مجموعة غوانيدين، وفي حالة أخرى، مع مثيلة من ω غوانيدين N، منع التفاعل نهاية جرا. والمثير للدهشة، وأدى هذا التعديل صغير إلى تحول الانتقائية الكامل في بروابط. بالإضافة إلى الألكلة، تم إدخال طريقة functionalization جديد في هذا المنشور. طريقة functionalization الكلاسيكية لهذا النوع من يجند pentapeptidic هو من خلال التصريف الجانبية سلسلة من الأحماض الأمينية لم يشارك في ملزمة (على سبيل المثال، K في ج (RGDfK)) 14 و 15. هنا،وتبين لنا أن functionalization من الممكن أيضا عن طريق تعديل غوانيدين - وهو أمر حاسم للربط - مع أسيل أو رابط الألكيلية. يتم الاحتفاظ شحنة موجبة التي لا غنى عنها للربط، ونماذج تشير إلى أن نقاط سلسلة طويلة من جيب ملزمة، مما يوفر إمكانية مثالية لإلحاق مزيد من الربط، والدوال وحدات وضع العلامات (على سبيل المثال، تسمية الفلورسنت أو خالب للالجزيئي التصوير).

في هذا العمل، ونحن نركز على الخطوات التحضيرية لتعديل مجموعة غوانيدين في بروابط التي تحتوي على أرجينين. وهذا ينطوي على تجميع الأنواع -methylated N ω، فضلا عن guanidines مع وحدات رابط أطول. تشمل التعديلات المختلفة أسيل وألكيل الجماعات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على جميع المواد الكيميائية والمذيبات من الموردين التجارية، وكانت تستخدم من دون مزيد من التنقية.

تنبيه: يرجى التشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الرجاء استخدام جميع معدات السلامة المناسبة عند تنفيذ التوليفات الكيميائية (مثل غطاء الدخان، ونظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، والسراويل كامل طول، والأحذية المغلقة اصبع القدم).

1. توليف من السلائف Guanidinylation

  1. الأنواع الألكيلية
    1. الأنواع مميثل
      1. حل 1.0 غرام من N، N '-di-بوك-1 H-1--pyrazole carboxamidine (3.2 مليمول، 1 مكافئ) و 1.0 غرام من ثلاثي فينيل الفوسفين (PPH 3، 3،8 مليمول، 1.2 مكافئ) في 10 مل من الجفاف رباعي هيدرو الفوران (THF) في 50 مل قارورة ذهابا والقاع في جو خامل استخدام الحاجز المطاطي في درجة حرارة الغرفة (RT). إضافة 194 ميكرولتر من الميثانول الجاف باستخدام حقنة (4.8 مليمول، 1.5 مكافئ.) ولآخرون أنه يقلب في RT.
      2. بشكل منفصل، يعد حل مع 747 ميكرولتر من diisopropyl azodicarboxylate (DIAD، 3.8 ملمول، 1.2 مكافئ) في 2 مل من THF الجافة في قنينة زجاجية صغيرة. مع التحريك، إضافة محلول من DIAD في THF قطرة قطرة في حل N، N '-di-بوك-1 H-1--pyrazole carboxamidine، PPH 3، والميثانول باستخدام حقنة (أكثر من 15 دقيقة). السماح للضجة حل لمدة 2 ساعة في RT.
      3. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار وحل الناتج الخام في 1 مل من ثنائي كلورو ميثان (DCM). تحميل عمود فلاش (2.5 سم × 20 سم) مع 100 غرام من السيليكا في 10٪ خلات الإيثيل (EtOAc) في حل البنتان. تحميل المنتج الخام حله في العمود وإضافة المذيب تحت ضغط (1.5 بار).
      4. جمع الكسور (نظام المذيبات: isocratic 10٪ EtOAc في البنتان)، وتحديد مكان المركب المطلوب من قبل طبقة رقيقة اللوني (TLC)، وجمع عليه (R و = 0.4، EtOAc / البنتان 1: 9، UV). الجمع بين المطلوبكسور وتتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار للحصول على 0.85 غرام من مركب العنوان لالأصفر، النفط اللزج (2.6 مليمول، 81٪ العائد). تخزين مجمع حققت في RT لاستخدامها مرة أخرى.
    2. الأنواع المعدلة هيكسيلامين
      1. حل 1.0 غرام من N، N '-Di-بنك الصين-1 H-1--pyrazole carboxamidine (3.2 مليمول، 1.0 مكافئ)، 0.9 غرام من DDE-6-aminohexanol (3.8 مليمول، 1.2 مكافئ)، و 1.0 غرام من PPH 3 (3.8 مليمول، 1.2 مكافئ) في 10 مل من THF الجاف في 50 مل قارورة جولة القاع في جو خامل استخدام الحاجز المطاطي على RT.
      2. بشكل منفصل، يعد حل مع 747 ميكرولتر من DIAD (3.8 مليمول، 1.2 مكافئ) في 2 مل من THF الجافة في قنينة زجاجية صغيرة. مع التحريك، إضافة محلول من DIAD في THF قطرة قطرة في حل N، N '-di-بوك-1 H-1--pyrazole carboxamidine، PPH 3، وDDE-6-aminohexanol باستخدام حقنة (أكثر من 15 دقيقة) . السماح للضجة حل لمدة 2 ساعة في RT.
      3. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار واتخاذ المنتج يصل الخام في 1 مل من DCM. تحميل عمود فلاش (2.5 سم × 20 سم) مع 100 غرام من السيليكا في حل من البنتان / EtOAc (2: 1). تطبيق المنتج الخام حله في العمود وإضافة المذيب تحت الضغط (1.5 بار).
      4. جمع الكسور (نظام المذيبات: isocratic 2: 1 البنتان / EtOAc)، وتحديد الكسور المطلوب مع TLC، وجمعها (R و = 0.66، 2: 1 البنتان / EtOAc، UV). الجمع بين الكسور المطلوب وتتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار للحصول على 1.6 غرام من مركب العنوان لالأصفر، النفط اللزج (2.8 مليمول، 88٪ العائد). تخزين مجمع حققت في RT لاستخدامها مرة أخرى.
  2. الأنواع Acylated (2 خطوات التفاعل)
    1. حل 1.4 غرام من S -methylisothiuronium hemisulfate (10 مليمول، 1.0 مكافئ.) و 2.2 غرام من دي (ثلاثي -butyl) بيكربونات (10 مليمول، 1.0 مكافئ.) في اثارة بقوةعصابة حل ثنائي الطور من DCM / جلس. عبد القدير. NaHCO 3 والسماح لها يحرك المزيج لمدة 24 ساعة عند RT.
    2. فصل طبقات في قمع فصل واستخراج المرحلة المائية ثلاث مرات مع DCM. الجمع بين المراحل العضوية، وتجفيفها مع نا 2 SO 4، وإزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار. اتخاذ هذا المنتج يصل الخام في 1 مل من الهكسان.
    3. تحميل عمود فلاش (2.5 سم × 20 سم) مع 100 غرام من السيليكا في حل من 4: 1 الهكسان / EtOAc. تحميل المنتج الخام حله في العمود. إضافة المذيب تحت الضغط. تحديد الكسور المطلوب مع TLC (نظام المذيبات: 4: 1 isocratic الهكسان / EtOAc (الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية: 254 نانومتر)، وجمعها (R و = 0.30).
    4. الجمع بين الكسور المطلوب وتتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار للحصول على 1.1 غرام من مركب العنوان لالأصفر، النفط اللزج (5.8 مليمول، 58٪ العائد). تخزين كاشف، N - (ثلاثي -butoxycarbonyl) - S -methylisothiourea، في RT لاستخدامها مرة أخرى.
    5. حل 250 ملغ من N - (-butoxycarbonyl ثالثي) - S -methylisothiourea (1.3 مليمول، 1.0 مكافئ) في 10 مل من الجفاف N، N -dimethylformamide (DMF) في 50 مل دورق كروي في جو خامل في RT. إضافة 440 ميكرولتر من N، N-diisopropylethylamine (DIPEA) (2.6 مليمول، 2 مكافئ.) باستخدام حقنة. مع التحريك، إضافة 245 ميكرولتر من ميلان 2 O (5.2 مليمول، 4.0 مكافئ.) قطرة قطرة باستخدام حقنة والسماح لها يقلب لمدة 1 ساعة عند RT.
    6. إضافة وجود فائض من الميثانول (2 مل) إلى الخليط باستخدام حقنة والسماح لها يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار. اتخاذ هذا المنتج يصل الخام في 1 مل من DCM.
    7. تحميل عمود فلاش (2.5 سم × 20 سم) مع 60 غرام من السيليكا في حل من 3: 1 الهكسان / EtOAc 3: 1. تطبيق المنتج الخام المنحل إلى العمود. إضافة المذيبات (3: 1 الهكسان / EtOAc) وضغط (1.5 بار). تحديد الكسور المطلوب مع TLC (3: 1 الهكسان / EtOAc والأشعة فوق البنفسجية: 220 نانومتر)، والعقيدlect لهم (R و = 0.62).
    8. الجمع بين الكسور المطلوب وتتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار للحصول على 210 ملغ من مجمع العنوان لأبيض صلب (0.9 مليمول، و 70٪ العائد). تخزين المجمع في RT لاستخدامها مرة أخرى.

2. تجميع دوري الببتيد السلائف

  1. تحميل والسد الراتنج TCP
    1. إضافة 1.00 غرام من 2 chlortriyl كلوريد (CTC) الراتنجات (0.9 مليمول / ز) و 320 ملغ من FMOC-الغليسين-OH (1.2 مكافئ.) في بلاستيكية حقنة 20 مل مع فريت. يعد حل من 313 ميكرولتر من DIPEA (2 مكافئ) في 5 مل من DCM الجاف وإضافته إلى الحقنة. ندعه تدوير لمدة 1 ساعة على RT باستخدام وحدة الدوارة.
    2. وفي الوقت نفسه، يعد حل 2 مل من 5: 1 الميثانول / DIPEA (ت / ت، متوجا الحل). إضافة الحل متوجا إلى الحقنة والسماح لها تناوب لمدة 15 دقيقة أخرى. غسل الراتنج مع DCM (5X) وDMF (3X).
  2. على الراتنج FMOC deprotection
    1. علاج محددة الراتنج FMOC-الغليسين مع 20٪ تأكسد في DMF لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك لمدة 5 دقائق. غسل الراتنج مع DMF (3X).
  3. على الراتنج اقتران FMOC-أورن (DDE) -OH
    1. إضافة 934 ملغ من FMOC-ل-أورن (DDE) -OH (2 مكافئ)، 684 ملغ من 1- [مكرر (dimethylamino) الميثيلين] -1 H--1،2،3 triazolo [4،5-ب] البيريدينيوم 3-OXID hexafluorophosphate (حتو) (2 مكافئ)، و 245 ملغ من 1-هيدروكسي-7-azabenzotriazole (هوات) (2 مكافئ) إلى قارورة زجاجية صغيرة وتذوب في 5 مل من DMF. إضافة 814 ميكرولتر من DIPEA.
    2. إضافة هذا الحل إلى الغليسين FMOC-deprotected، وغسلها، ومحددة الراتنج والسماح لها تناوب لمدة 1 ساعة. غسل الراتنج مع DMF (3X).
  4. على الراتنج FMOC deprotection
    1. علاج محددة الراتنج FMOC-أورن (DDE) -Gly مع 20٪ تأكسد في DMF لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك لمدة 5 دقائق. غسل الراتنج مع DMF (3X).
  5. على الراتنج اقتران FMOC-فال-OH
    1. إضافة 610 ملغ من FMOC-فال-OH (2 مكافئ)، 684 ملغ من حتو (2 مكافئ)، و 245 ملغ من هوات (2 مكافئ) إلى قارورة زجاجية صغيرة وتذوب في 5 مل من DMF. إضافة 814 ميكرولتر من DIPEA.
    2. إضافة هذا الحل إلى FMOC-deprotected، وغسلها، ومحددة الراتنج أورن (DDE) -Gly والسماح لها تناوب لمدة 1 ساعة.
  6. على الراتنج FMOC deprotection
    1. علاج محددة الراتنج FMOC-فال أورن (DDE) -Gly مع 20٪ تأكسد في DMF لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك لمدة 5 دقائق. غسل الراتنج مع DMF (3X).
  7. على الراتنج N- الميثلة
    1. غسل الراتنج مع DCM (3X). حل 887 ملغ من 2 nitrobenzenesulfonylchloride (س -NBS-CL، 4 مكافئ) في DCM وإضافة 1.2 مل من 2،4،6-collidine (10 مكافئ).
    2. إضافة إلى حل الببتيد محددة الراتنج والسماح لها احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
    3. غسل الراتنج مع CH 2 الكلورين 2 (3X) ومع THF (5X). يعد حل مع 1.18 غرام من PPH 3 (5 مكافئ) و 365 ميكرولتر من الميثانول في THF. إضافة هذا الحل إلىمحقنة.
    4. يعد حل مع 883 ميكرولتر من DIAD في 2 مل من THF وإضافته إلى الحقنة. السماح لها احتضان لمدة 15 دقيقة. غسل الراتنج مع THF (5X) ومع DMF (5X).
  8. س -Ns deprotection
    1. يعد حل مع 570 ميكرولتر من المركابتويثانول (10.0 مكافئ) و 672 ميكرولتر من diazabicycloundecen (DBU) في 2 مل من DMF. إضافة هذا الحل إلى حقنة والسماح لها احتضان لمدة 5 دقائق.
    2. كرر الخطوة deprotection ثم يغسل الراتنج مع DMF (5X).
  9. على الراتنج اقتران Fmoc- د-الفنيل ألانين-OH
    1. إضافة 697 ملغ من FMOC-D-الفنيل ألانين-OH (2 مكافئ)، 684 ملغ من حتو (2 مكافئ)، و 245 ملغ من هوات (2 مكافئ) إلى قارورة زجاجية صغيرة وتذوب في 5 مل من DMF . إضافة 814 ميكرولتر من DIPEA.
    2. إضافة هذا الحل إلى الببتيد FMOC-deprotected، وغسلها، ومحددة الراتنج والسماح لها تناوب لمدة 1 ساعة.
  10. على الراتنج FMOC deprotection
    1. علاج الراتنج-بس اوند الببتيد مع 20٪ تأكسد في DMF لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك لمدة 5 دقائق. غسل الراتنج مع DMF (3X).
  11. على الراتنج اقتران FMOC-آسيا والمحيط الهادئ (بعد التمديد بو) -OH
    1. إضافة 741 ملغ من Fmoc- آسيا والمحيط الهادئ (بعد التمديد بو) -OH (2 مكافئ)، 684 ملغ من حتو (2 مكافئ)، و 245 ملغ من هوات (2 مكافئ) إلى قارورة زجاجية صغيرة وتذوب في 5 مل من DMF. إضافة 814 ميكرولتر من DIPEA.
    2. إضافة هذا الحل إلى الببتيد FMOC-deprotected، وغسلها، ومحددة الراتنج والسماح لها تناوب لمدة 1 ساعة.
  12. انشقاق من الببتيد خطي من الراتنج
    1. غسل الراتنج مع DCM (3X) وبعد ذلك إعداد 10 مل من محلول hexafluoroisopropanol (HFIP) في DCM (1: 4؛ ت / ت).
    2. إضافة حل لراتنج والسماح لها تناوب لمدة 15 دقيقة. جمع الحل في قارورة ذهابا والقاع. تكرار الانقسام وتتبخر المذيب باستخدام المبخر الدوار.
  13. Cyclization من الببتيد خطي
    1. ديssolve 384 ملغ من NaHCO 3 (5.0 مكافئ.) و582 ميكرولتر من أزيد diphenylphosphoryl (DPPA) (3.0 مكافئ) في 50 مل من DMF وإضافته إلى الناتج الخام. ندعه يقلب بين عشية وضحاها أو حتى يلاحظ أي الببتيد خطي مع ESI-MS (10 ساعة) 17.
    2. تحت ضغط منخفض، والحد من المذيب إلى وحدة تخزين صغيرة باستخدام المبخر الدوار. تحضير محلول مائي مشبع من كلوريد الصوديوم (محلول ملحي). باستخدام ماصة باستور، إضافة قطرة قطرة الببتيد cyclized إلى 40 مل من محلول مائي مشبع من كلوريد الصوديوم في أنبوب الطرد المركزي.
    3. الطرد المركزي تعليق (5000 x ج، 5 دقائق) ويغسل الراسب مع المياه HPLC الصف (2X). يجفد المنتج.

3. Guanidinylation وDeprotection في الحل

  1. Guanidinylation مع السلائف مصممة خصيصا
    1. حل كمية صغيرة (على سبيل المثال، 25 ملغ) من الببتيد دوري deprotected متعامد في كمية صغيرة من DMF (على سبيل المثال، 2 مL). إضافة 2 مكافئ. من السلائف guanidinylation و 2 مكافئ. من DIPEA إلى الحل والسماح لها يقلب لمدة 2 ساعة عند RT.
    2. رصد التقدم المحرز في رد الفعل مع HPLC-MS. بعد رد الفعل هو الكامل، إزالة المذيبات، وإعادة حل الببتيد دوري guanidinylated في أسيتونيتريل، وأداء HPLC semipreparative تنقية 16.
  2. إزالة مجموعة حمض عطوب سلسلة جانب حماية
    1. إعداد 2 مل من محلول يحتوي على حمض trifluoroacetic (TFA)، والمياه، وtriisopropylsilane (TIPS) (95 / 2.5 / 2.5. ت / ت / ت). إضافة هذا الحل لهذا المنتج المنقى في قارورة زجاجية صغيرة والسماح لها إثارة في RT مدة 1 ساعة على الأقل. مراقبة deprotection الكامل مع ESI-MS 17.
    2. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض إلى حجم صغير. إعداد الأثير المثلج وإضافة 10 مل في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. ترسيب الببتيد deprotected في الأثير الجليد الباردة باستخدام ماصة باستور عن طريق إضافتهقطرة قطرة. الطرد المركزي تعليق (5000 x ج، 5 دقائق) للحصول على بيليه.
    3. يغسل الراسب مع الأثير الجليد الباردة وأجهزة الطرد المركزي هو (5000 x ج، 5 دقائق، 2X). حل المنتج في 2 مل من الماء HPLC الصف وتنقية مع HPLC semipreparative 16.

4. البيانات التحليلية ومعلمات لتنقية

  1. التحليل HPLC-ESI-MS
    1. أداء التحليلي HPLC-ESI-MS مع مطياف LCQ كتلة باستخدام عمود C18 (حجم 12 نانومتر المسام، 3 ميكرون حجم الجسيمات، 125 مم × 2.1 مم) أو عمود C8 (20 نانومتر حجم المسام، 5 ميكرون الجسيمات حجم 250 مم × 2.1 مم)، مع H 2 O (0.1٪ ت / ت حمض الفورميك) / أسيتونيتريل (0.1٪ ت / ت حمض الفورميك) كما eluents.
  2. HPLC شبه إعدادي
    1. أداء HPLC شبه إعدادي باستخدام أداة HPLC إعدادي مع المواد المستنفدة للأوزون-A العمود (20 × 250 مم، 5 ميكرون)، ومعدل التدفق من 8 مل / دقيقة، والتدرجات الخطيةمن H 2 O (0.1٪ ت / ت TFA) وأسيتونيتريل (0.1٪ ت / ت TFA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم توليفها الببتيد السلائف دوري كما الببتيد الخطي، cyclized، ومتعامد DDE deprotected. بعد هطول الأمطار، تم تحليل النقاء من المركب مع HPLC-MS (الشكل 1). لرصد التقدم المحرز في رد الفعل، تم إجراء تحليل HPLC بعد وقت رد الفعل 2-ساعة (الشكل 2).

لبقايا أكبر على مجموعة غوانيدين، وقت رد الفعل من 2 ساعة في كثير من الأحيان لا يكفي. في هذه الحالة، استمر التفاعل ومراقبة مع LC-MS. بعد رد الفعل وdeprotection النهائي، وتنقية المركبات باستخدام المعدات HPLC semipreparative (عوائد عادة في نطاق منخفض ملغ). وقد تم تحليل المركبات النهائية مع HPLC-MS لتقييم النقاء (انظر الشكل 3).

وكان وزنه وهناك كمية صغيرة في أنبوب microcentrifuge وتضعف مع DMSO للحصول على حل الجذعية لتقييم البيولوجي للمجمع في ELISA مثل، الصلبة مرحلة الفحص ملزمة. وصفت النتائج في الشكل (4). يتم تضمين جزيء القياسية Cilengitide (مجموعة غوانيدين معدلة) كمرجع. جميع المركبات تمتلك قابلية عالية نسبيا لαvβ3 إنتغرين النوع الفرعي وانتقائية عالية ضد α5β1.

شكل 1
الشكل 1: HPLC-MS الطيف (التدرج: 10-90٪ أسيتونيتريل (ACN) في نظام ثنائي الطور المذيبات مع H 2 O وACN) من ج مشتقة deprotected DDE-متعامد (OrnGD (بعد التمديد بو) و (N عني) V ) (الكتلة محسوب: 602.34 جم / مول)، كما تم الحصول عليها بعد cyclization من الببتيد خطي لاحق DDE-deprotection، وهطول الأمطار.عنخ "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: HPLC-MS الطيف (التدرج: 10-90٪ ACN في نظام ثنائي الطور المذيبات مع H 2 O وACN) من خليط التفاعل بعد رد الفعل guanidinylation من الببتيد دوري deprotected متعامد والسلائف الميثيلي لguanidinylation. وبالاضافة الى الذروة المنتج (R ر = 7.50 دقيقة والكتلة المحسوبة = 858.49 جم / مول)، إلا أن تزيد من السلائف guanidinylation (R ر = 6.38 دقيقة) وDIPEA قاعدة (R ر = 0.90 دقيقة) يمكن ملاحظتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): HPLC-MS الطيف (التدرج: 10-90٪ ACN في نظام ثنائي الطور المذيبات مع H 2 O وACN) من مجمع الخام 2 (R ر = 3.69 دقيقة والكتلة المحسوبة = 603.32 جم / مول) بعد deprotection من السلاسل الجانبية عطوب الحمضية قبل تنقية semipreparative. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: Functionalization من guanidines في حل والتقييم البيولوجي. مركب 1، مع مجموعة غوانيدين دون تغيير، غير Cilengitide. التعديلات تناولها في هذه المخطوطة هي ميثليته (2)، functionalized (هنا، الاسيتيل الهكسان الأمينية؛ 3)، والأسيتيل (4) المشتقات. تيكان مصمما تقارب ملزمة في فحص ملزم المرحلة الصلبة باستخدام بروتينات معزولة 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقدمة عن guanidinylation هو deprotected متعامد مشتق الببتيد دوري، (ج (OrnD (بعد التمديد بو) فرنك غيني (N عني) V))، الذي يتم تصنيعه من قبل بروتوكول FMOC القياسية من الحالة الصلبة الببتيد التوليف (SPPS). وقد استخدم Ornithin كما مشتق محمية متعامد، (FMOC-أورن (DDE) -OH)، والتي يمكن deprotected مع الهيدرازين في DMF بعد cyclization من سقالة الببتيد. يتم تنقيته مقدمة الببتيد من قبل هطول الأمطار من المجمع والتي تجفيد لاحق.

السلائف الألكيلية لguanidinylation يمكن الحصول عليها في غلة جيدة في رد فعل خطوة واحدة بدءا من المادة N متوفرة تجاريا، N '-di-بوك-1 H-1--pyrazole carboxamidine من خلال رد فعل الألكلة في ظل ظروف Mitsunobu (PPH 3 ، DIAD، THF) 19، 10. مع هذا التفاعل، ومجموعة متنوعة ضخمة من السلائف هي الملحقات وssible من الكحول المقابلة. رد فعل guanidinylation مع السلائف الألكيلية غلة المنتج المحدد في رد فعل نظيفة. إن لم يكن لوحظ تحويل كامل للالمتفاعلة بعد 2 ساعة، وينبغي أن يستمر رد الفعل. وفقا للشروط الواردة في البروتوكول، والمنتجات الجانبية طفيفة فقط شكلت. ومع ذلك، كميات أكبر من الشوائب لا يمكن استبعاد للجميع، وخاصة محمية بشكل مختلف، ركائز تحمل الأنصاف أكبر.

في حالة استخدام الببتيدات functionalized غوانيدين (linkers أطول)، وDDE حماية المجموعة على أمين محطة للرابط هو إزالة ويمكن تصريفها عن طريق اقتران أميد إلى حمض المقابلة. يتم تنفيذ deprotection من DDE في محلول 2٪ الهيدرازين في DMF وينتج الببتيد deprotected متعامد، والتي ينبغي أن تنقية (على سبيل المثال، HPLC semipreparative) قبل استخدامها مرة أخرى. في هذه الحالة، تم إجراء رد فعل أستلة بسيط في الموقع.

إذاباستخدام guanidines الأسيتيل، ينبغي تطبيق استراتيجية السلائف مختلفة. بدءا من S -methylisothiourea، لا بد من تسلسل رد فعل من خطوتين 20. أولا، أحادية حماية بوك من S -methylisothiourea يجب إجراء 21 قبل أستلة مع حمض الاختيار (هنا، وحامض الخليك). رد فعل guanidinylation هو رد فعل نظيفة جدا وسريع، يتم الحصول على المركب النهائي بعد deprotection النهائي للمجموعة حماية الحمض عطوب سلسلة جانبية.

كما سبق ذكره في المقدمة، هذا الأسلوب يسمح للتعديل وfunctionalization في أي مجموعة غوانيدين ببتيدية. أثبتنا هذه التقنية على إنتغرين بروابط، والتي تسمح، في هذه الحالة، وضبط من الانتقائية النوع الفرعي للبروابط. ومعدلة إنتغرين خصم Cilengitide هو biselective لفرعية αvβ3 / α5β1. من خلال مثيلة من ω محطة N منوحققت مجموعة غوانيدين، وهو يجند αvβ3 انتقائي. هذا يمنع تفاعل نهاية على المهم أن يلاحظ فريد في α5β1، وبالتالي تعطيل يجند لهذا إنتغرين. التفاعل الرئيسي مع موقع ملزم من النوع الفرعي αvβ3 هو نهاية على التفاعل الذي لا تشعر بالانزعاج من هذا التفاعل 10.

عن طريق تعديل يجند مع وحدات رابط أطول ( "functionalization")، هدفين يمكن الوصول دفعة واحدة: يتم إنشاء الانتقائية من خلال كسر نهاية على التفاعل مع النوع الفرعي α5β1، وعلى الجانب الآخر، ونقاط رابط من جيب ملزمة، والسماح لتصريف للكيانات كبيرة (على سبيل المثال، chelators أو الأصباغ الفلورية لتقنيات التصوير) 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

TGK يعترف المدرسة الدولية العليا للعلوم والهندسة (IGGSE) من الجامعة التقنية ميونيخ للحصول على الدعم المالي. يعترف HK مركز البروتين المتكامل العلوم ميونيخ (CIPSM) لدعمهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 122، غوانيدين، أرجينين، الببتيد، تعديل، guanidinylation، الألكلة، mitsunobu
تعديل وFunctionalization مجموعة جوانيداين من السلائف مصممة خصيصا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler,… More

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter