Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ændring og Funktionalisering af guanidingruppen ved Skræddersyede Forstadier

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

En protokol til syntese af alkyl-modificerede guanidiner baseret på anvendelsen af ​​de tilsvarende forstadier præsenteres.

Abstract

Guanidingruppen er en af ​​de vigtigste farmakofore grupper i medicinsk kemi. Den eneste aminosyre, der bærer en guanidingruppe er arginin. I denne artikel tilvejebringes en nem metode til modificering af guanidingruppen i peptidiske ligander, med et eksempel på RGD-bindende integrin ligander. Det blev for nylig vist, at den særskilte modifikation af guanidingruppen i disse ligander muliggør selektiv modulering af subtype (for eksempel mellem undertyperne av og α5). Desuden blev en tidligere ukendt strategi for funktionaliseringen via guanidingruppen påvist, og det syntetiske tilgang revideret i dette dokument. De her beskrevne modifikationer inddrage terminalt (N ω) alkylerede og acetylerede guanidingrupperne. Til syntesen, er skræddersyede precursormolekyler syntetiseret, som derefter underkastes en reaktion med en ortogonalt afbeskyttet amin at overføre præ-modificeret guanidingruppe. Til syntese af alkylerede guanidiner, forstadier baseret på N, N'-di-Boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin anvendes til at syntetisere acylerede forbindelser, precursoren for valg bliver en tilsvarende acyleret derivat af N-Boc-S - methylisothiourinstof, der kan opnås i en- og to-trins-reaktioner.

Introduction

Blandt de mest udbredte farmakofore grupper i naturlige ligander er guanidingruppen, som er involveret i flere interaktioner 1, 2. For eksempel tjener den som en potentiel firedobbelt hydrogendonor i hydrogenbinding interaktioner og er involveret i elektrostatiske vekselvirkninger, såsom saltbroer eller kation-π-interaktioner. I medicinsk kemi, er denne gruppe ofte findes i lægemidler og lægemiddelkandidater 4, selv om meget ofte som guanidin mimetiske 5, 6. Årsagen til udviklingen af ​​guanidinderivater mimetika er fjernelse af den allestedsnærværende, positivt ladet guanidingruppe, såvel som reguleringen af ​​lipofiliciteten af ​​liganden. I peptidiske ligander, den eneste guanidin-indeholdende aminosyre er arginin, som derfor ofte findes i det bioaktive region peptidiske ligander.

En meget PRominent eksempel for en arginin-holdig ligand familien er underfamilien af ​​RGD-bindende integriner. Generelt integriner er en klasse af celleadhæsionsreceptorer, som overtager vigtige funktioner i alle højere organismer. Nogle af disse funktioner involverer celleadhæsion, migrering, og celle overlevelse. De er således også involveret i patologiske indikationer, såsom cancer og fibrose. Integriner er transmembran heterodimere proteiner bestående af en α- og en β-underenhed, som danner 24 tiden kendte integrin undertyper; 8 af dem genkende tripeptidsekvensen Arg-Gly-Asp (= RGD) i deres ligander 7. Bindingsregionen er placeret ved grænsefladen mellem disse to undertyper i den ekstracellulære del, den såkaldte integrin hovedgruppe 8. RGD genkendes af to fælles interaktioner: metallet-ion-afhængig adhæsion site (MIDAS) region, som er beliggende i beta-underenheden, og som binder carboxylsyren i liganderne (side chai af Asp); og guanidingruppen i liganderne, som er beliggende i alfa-subunit'en. De fleste af de integrin undertyper er promiskuøse og del i det mindste en del af deres naturlige ekstracellulære matrix (ECM) ligander 9. Således for udviklingen af ​​kunstige integrin ligander, den store fokus er, foruden en høj bindingsaffinitet, subtype selektivitet. For nylig kunne vi afsløre et nøgleelement til generering af subtypeselektive ligander: guanidingruppen. Gennem distinkte modifikationer, biselective ligander for αv- og α5-holdige integrin undertyper kan vendes til selektive forbindelser ved simple modifikationer på guanidingruppen, som derefter kan skelne de forskellige α-underenheder 10.

I lommen på av, guanidingruppen interagerer side-på via en bidentat saltbro med Asp218 11, 12. Denne interaktion cen også observeres i α5β1 (her med Asp227 i α5), men derudover er en ende-mod interaktion guanidingruppen med en Gin rest (Gln221) observerede der 13. Således har vi modificeret guanidingruppen i to modsatte måder: i det ene tilfælde, ved at blokere side-om interaktion med methylering af den N δ af guanidingruppen, og i det andet tilfælde, med methylering af guanidin N ω, blokerer udgangen på interaktion. Overraskende denne lille modifikation førte til en fuldstændig selektivitet skift i liganderne. Ud over den alkylering blev en ny funktionalisering metode introduceret i denne publikation. Den klassiske funktionalisering metode for denne type pentapeptidic ligand er gennem sidekæden konjugering af en aminosyre ikke er involveret i binding (fx K ic (RGDfK)) 14, 15. Her,viser vi, at funktionalisering er også mulig ved at modificere guanidin - som er afgørende for binding - med en acyl- eller alkyleret linker. Den positive ladning, der er væsentligt for binding bevares, og modeller tyder på, at langkædede point ud af bindingslommen og tilvejebringer således en ideel mulighed for fastgørelse af yderligere linkere og mærkning enheder (for eksempel et fluorescerende mærke eller en chelator til molekylær billeddannelse).

I dette arbejde, vi koncentrere os om de præparative trin til modifikation af guanidingruppen i arginin-holdige ligander. Dette involverer syntesen af N ω -methylated arter, samt guanidiner med længere linker-enheder. De forskellige modifikationer omfatter acyl- og alkylgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle reagenser og opløsningsmidler blev opnået fra kommercielle leverandører og blev anvendt uden yderligere oprensning.

Forsigtig: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Brug venligst alle passende sikkerhedsudstyr, når du udfører kemiske synteser (fx stinkskab, sikkerhedsbriller, handsker, lab coat, fuld længde bukser, og lukkede tå sko).

1. Syntese af de Guanidinylation Forstadier

  1. alkylerede arter
    1. denatureret arter
      1. Opløs 1,0 g N, N'-di-Boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1 ækv.) Og 1,0 g triphenylphosphin (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 ækv.) I 10 ml tørt tetrahydrofuran (THF) i en 50 ml rundbundet kolbe i en inert atmosfære under anvendelse af en gummiskillevæg ved stuetemperatur (RT). Tilføj 194 pi tør methanol under anvendelse af en injektionssprøjte (4,8 mmol, 1,5 ækv.) Og let det omrøre ved stuetemperatur.
      2. Separat fremstilles en opløsning med 747 pi diisopropylazodicarboxylat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 ækv.) I 2 ml tør THF i et lille hætteglas. Under omrøring tilsættes en opløsning af DIAD i THF dråbevis til opløsningen af N, N '-di-Boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin, PPh3, og methanol ved anvendelse af en sprøjte (over 15 min). Lad opløsningen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur.
      3. Fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper, og opløse det rå produkt i 1 ml dichlormethan (DCM). Indlæse en flashsøjle (2,5 cm x 20 cm) med 100 g silica i 10% ethylacetat (EtOAc) i en pentanopløsning. Indlæse det opløste råprodukt på søjlen og tilføj opløsningsmidlet under tryk (1,5 bar).
      4. Saml fraktionerne (opløsningsmiddelsystem: isokratisk 10% EtOAc i pentan), identificere den ønskede forbindelse plet ved tyndtlagskromatografi (TLC), og indsamle det (Rf = 0,4, EtOAc / pentan 1: 9, UV). Kombiner den ønskedefraktioner, og opløsningsmidlet afdampes under formindsket tryk under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af 0,85 g af titelforbindelsen som en gul, viskos olie (2,6 mmol, 81% udbytte). Opbevar gav forbindelse ved stuetemperatur til videre anvendelse.
    2. Hexylamin-modificerede arter
      1. Opløs 1,0 g N, N'-di-boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1,0 ækv.), 0,9 g Dde-6-aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 ækv.) Og 1,0 g af PPh3 (3,8 mmol, 1,2 ækv.) i 10 ml tør THF i en 50 ml rundbundet kolbe i inert atmosfære under anvendelse af en gummiskillevæg ved stuetemperatur.
      2. Separat fremstilles en opløsning med 747 pi DIAD (3,8 mmol, 1,2 ækv.) I 2 ml tør THF i et lille hætteglas. Under omrøring tilsættes en opløsning af DIAD i THF dråbevis til opløsningen af N, N '-di-Boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin, PPh3, og Dde-6-aminohexanol anvendelse af en sprøjte (over 15 min) . Lad opløsningen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur.
      3. Fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper, og tage det rå produkt op i 1 ml DCM. Indlæse en flashsøjle (2,5 cm x 20 cm) med 100 g silica i en opløsning af pentan / EtOAc (2: 1). Anvende det opløste råprodukt på søjlen og tilføje opløsningsmiddel under tryk (1,5 bar).
      4. Saml fraktionerne (opløsningsmiddelsystem: isokratisk 2: 1 pentan / EtOAc), identificere de ønskede fraktioner med TLC, og samle dem (Rf = 0,66, 2: 1 pentan / EtOAc, UV). De ønskede fraktioner kombineres, og opløsningsmidlet afdampes under formindsket tryk under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af 1,6 g af titelforbindelsen som en gul, viskos olie (2,8 mmol, 88% udbytte). Opbevar gav forbindelse ved stuetemperatur til videre anvendelse.
  2. Acylerede arter (2 reaktionstrin)
    1. Opløs 1,4 g S -methylisothiuronium hemisulfat (10 mmol, 1,0 ækv.) Og 2,2 g di (tert-butyl) dicarbonat (10 mmol, 1,0 ækv.) I en kraftigt omrørtring bifasisk opløsning af DCM / mættet. aq. NaHCO3 og lad det omrøre i 24 timer ved stuetemperatur.
    2. Lagene adskilles i en skilletragt, og den vandige fase ekstraheres tre gange med DCM. Kombiner de organiske faser, tør dem med Na2SO 4, og fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper. Tag råproduktet op i 1 ml hexan.
    3. Indlæse en flashsøjle (2,5 cm x 20 cm) med 100 g silica i en opløsning af 4: 1 hexan / EtOAc. Indlæse det opløste råprodukt på søjlen. Tilføje opløsningsmiddel under tryk. Identificere de ønskede fraktioner med TLC (opløsningsmiddelsystem: 4: 1 isokratisk hexan / EtOAc (detektion UV: 254 nm), og samle dem (Rf = 0,30).
    4. De ønskede fraktioner kombineres, og opløsningsmidlet afdampes under formindsket tryk under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af 1,1 g af titelforbindelsen som en gul, viskos olie (5,8 mmol, 58% udbytte). Opbevar reagenset, N - (tert-butoxycarbonyl) - S-Methylisothiourea, ved stuetemperatur til videre anvendelse.
    5. Opløs 250 mg N - (tert-butoxycarbonyl) - S-methylisothiourinstof (1,3 mmol, 1,0 ækv.) I 10 ml tørt N, N-dimethylformamid (DMF) i en 50 ml rundbundet kolbe i en inert atmosfære ved RT. Tilføj 440 pi N, N-diisopropylethylamin (DIPEA) (2,6 mmol, 2 ækv.) Under anvendelse af en sprøjte. Under omrøring tilsættes 245 pi Ac2O (5,2 mmol, 4,0 ækv.) Dråbevis ved hjælp af en sprøjte og lad det omrøre i 1 time ved stuetemperatur.
    6. Tilføje et overskud af methanol (2 ml) til blandingen ved hjælp af en sprøjte og lad det omrøre i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper. Tag råproduktet op i 1 ml DCM.
    7. Indlæse en flashsøjle (2,5 cm x 20 cm) med 60 g silica i en opløsning af 3: 1 hexan / EtOAc 3: 1. Anvende det opløste råprodukt til søjlen. Tilføje opløsningsmiddel (3: 1 hexan / EtOAc) og tryk (1,5 bar). Identificere de ønskede fraktioner med TLC (3: 1 hexan / EtOAc, UV: 220 nm), og colLect dem (Rf = 0,62).
    8. De ønskede fraktioner kombineres, og opløsningsmidlet afdampes under formindsket tryk under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af 210 mg af titelforbindelsen som et hvidt fast stof (0,9 mmol, 70% udbytte). Opbevar forbindelsen ved stuetemperatur til videre anvendelse.

2. Syntese af cyklisk peptid Forstadier

  1. Lastning og capping TCP harpiks
    1. Tilføje 1,00 g 2-chlortriyl chlorid (CTC) harpiks (0,9 mmol / g) og 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 ækv.) I en plastik 20-ml sprøjte med en fritte. Fremstille en opløsning af 313 pi DIPEA (2 ækv.) I 5 ml tørt DCM og føje den til sprøjten. Lad det roterer i 1 time ved stuetemperatur under anvendelse af en roterende enhed.
    2. Mellemtiden forbereder en 2-ml opløsning af 5: 1 methanol / DIPEA (v / v; capping opløsning). Tilsæt capping løsning på sprøjten og lad den rotere i yderligere 15 minutter. Vask af harpiksen med DCM (5x) og DMF (3x).
  2. On-harpiks Fmoc-afbeskyttelse
    1. Behandle det harpiksbundne Fmoc-Gly med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og derefter i 5 min. Vask af harpiksen med DMF (3x).
  3. On-harpiks binding af Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Tilføj 934 mg Fmoc-l-Orn (Dde) -OH (2 ækv.), 684 mg 1- [bis (dimethylamino) methylen] -1-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxid (HATU) (2 ækv.), og 245 mg af 1-hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 ækv.) til en lille glasbeholder og opløses det i 5 ml DMF. Tilføj 814 uL af DIPEA.
    2. Tilføje denne opløsning til Fmoc-afbeskyttet, vasket og harpiksbundet Gly og lad den rotere i 1 time. Vask af harpiksen med DMF (3x).
  4. On-harpiks Fmoc-afbeskyttelse
    1. Behandle det harpiksbundne Fmoc-Orn (Dde) -Gly med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og derefter i 5 min. Vask af harpiksen med DMF (3x).
  5. On-harpiks binding af Fmoc-Val-OH
    1. Tilføj 610 mg Fmoc-Val-OH (2 ækv.), 684 mg HATU (2 ækv.) Og 245 mg HOAt (2 ækv.) Til en lille glasbeholder og opløses det i 5 ml DMF. Tilføj 814 uL af DIPEA.
    2. Tilføje denne opløsning til Fmoc-afbeskyttet, vasket og harpiksbundet Orn (Dde) -Gly og lad den rotere i 1 time.
  6. On-harpiks Fmoc-afbeskyttelse
    1. Behandle det harpiksbundne Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og derefter i 5 min. Vask af harpiksen med DMF (3x).
  7. On-harpiks N- Methylering
    1. Vask af harpiksen med DCM (3x). Opløs 887 mg 2-nitrobenzensulfonylchlorid (o -NBS-CI, 4 ækv.) I DCM, og der tilsættes 1,2 ml 2,4,6-collidin (10 ækv.).
    2. Tilsæt opløsningen til det harpiksbundne peptid og lad det inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur.
    3. Resinen vaskes med CH2C 2 (3x) og med THF (5x). Fremstille en opløsning med 1,18 g PPh3 (5 ækv.) Og 365 pi methanol i THF. Tilføj denne løsning påsprøjte.
    4. Fremstille en opløsning med 883 pi DIAD i 2 ml THF og føje den til sprøjten. Lad det inkuberes i 15 min. Vask harpiksen med THF (5x) og med DMF (5x).
  8. o -NS afbeskyttelse
    1. Fremstille en opløsning med 570 pi mercaptoethanol (10,0 ækv.) Og 672 pi diazabicycloundecen (DBU) i 2 ml DMF. Tilføj denne løsning på sprøjten og lad det inkubere i 5 min.
    2. Gentag afbeskyttelsestrinnet og derefter vaske harpiksen med DMF (5x).
  9. On-harpiks kobling af Fmoc d-Phe-OH
    1. Tilføj 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 ækv.), 684 mg HATU (2 ækv.), Og 245 mg HOAt (2 ækv.) Til en lille glasbeholder og opløses det i 5 ml DMF . Tilføj 814 uL af DIPEA.
    2. Tilføje denne opløsning til Fmoc-afbeskyttet, vasket og harpiksbundne peptid og lad den rotere i 1 time.
  10. On-harpiks Fmoc-afbeskyttelse
    1. Behandl harpiks-bound peptidet med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og derefter i 5 min. Vask af harpiksen med DMF (3x).
  11. On-harpiks binding af Fmoc-Asp (OtBu) -OH
    1. Tilføj 741 mg Fmoc- Asp (OtBu) -OH (2 ækv.), 684 mg HATU (2 ækv.), Og 245 mg HOAt (2 ækv.) Til en lille glasbeholder og opløses det i 5 ml DMF. Tilføj 814 uL af DIPEA.
    2. Tilføje denne opløsning til Fmoc-afbeskyttet, vasket og harpiksbundne peptid og lad den rotere i 1 time.
  12. Spaltning af det lineære peptid fra harpiksen
    1. Vask af harpiksen med DCM (3x) og derefter fremstille 10 ml af en opløsning af hexafluorisopropanol (HFIP) i DCM (1: 4; v / v).
    2. Tilsæt opløsning til harpiksen, og lad den rotere i 15 min. Opsaml opløsning i en rundbundet kolbe. Gentag spaltning og opløsningsmidlet afdampes på en rotationsfordamper.
  13. Cyklisering af det lineære peptid
    1. Dissolve 384 mg NaHCO3 (5,0 ækv.) og 582 pi diphenylphosphorylazid (DPPA) (3,0 ækv.) i 50 ml DMF og føje den til det rå produkt. Lad det omrøre natten eller indtil der ikke lineært peptid observeres med ESI-MS (10 h) 17.
    2. Under reduceret tryk, reducere opløsningsmidlet til et lille volumen under anvendelse af en rotationsfordamper. Fremstille en mættet vandig opløsning af NaCl (saltvand). Anvendelse af en Pasteur-pipette, tilsæt cykliseret peptid dråbevis til 40 ml mættet vandig opløsning af NaCl i et centrifugeglas.
    3. Centrifugeres suspensionen (5000 xg, 5 minutter) og bundfaldet vaskes med HPLC-kvalitet vand (2x). Lyofilisere produktet.

3. Guanidinylation og Afbeskyttelse i Løsning

  1. Guanidinylation med skræddersyede forstadier
    1. Opløs en lille mængde (for eksempel 25 mg) af ortogonalt afbeskyttes cykliske peptid i et lille volumen DMF (for eksempel 2 mL). Tilsæt 2 ækv. af guanidinylation forstadiet og 2 ækv. DIPEA til opløsningen, og lad den omrøre i 2 timer ved stuetemperatur.
    2. Overvåge forløbet af reaktionen med HPLC-MS. Efter at reaktionen er afsluttet, fjernes opløsningsmidlet igen opløse guanidinylated cykliske peptid i acetonitril, og udfør semipræparativ HPLC-oprensning 16.
  2. Fjernelse af syrelabile sidekædebeskyttelsesgrupper
    1. Forbered 2 ml af en opløsning indeholdende trifluoreddikesyre (TFA), vand, og triisopropylsilan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5 v / v / v). Tilføje denne opløsning til det rensede produkt i et lille hætteglas og lad det omrøre ved stuetemperatur i mindst 1 time. Observere fuldstændig afbeskyttelse med ESI-MS 17.
    2. Opløsningsmidlet afdampes under reduceret tryk til et lille volumen. Forberede iskold ether og tilsættes 10 ml i en 50 ml centrifugerør. Udfælde det afbeskyttede peptid i iskold ether under anvendelse af en Pasteur-pipette ved at tilsætte detdråbevis. Centrifugeres suspensionen (5000 xg, 5 min) for at opnå en pellet.
    3. Bundfaldet vaskes med iskold ether og centrifugere det (5000 xg, 5 min, 2x). Opløs produktet i 2 ml HPLC-kvalitet vand og rense det med semipræparativ HPLC 16.

4. Analytiske data og parametre for Oprensning

  1. Analytisk HPLC-ESI-MS
    1. Udføre analytisk HPLC-ESI-MS med en LCQ massespektrometer under anvendelse af en C18-søjle (12-nm porestørrelse, 3-um partikelstørrelse, 125 mm x 2,1 mm) eller en C8-søjle (20-nm porestørrelse, 5 um partikelstørrelse størrelse, 250 mm x 2,1 mm), med H2O (0,1% vol / vol myresyre) / acetonitril (0,1% vol / vol myresyre) som elueringsmidler.
  2. Semi-præparativ HPLC
    1. Udføre semipræparativ HPLC under anvendelse af en præparativ HPLC-instrument med en ODS-A-søjle (20 x 250 mm, 5 um), en strømningshastighed på 8 ml / min, og lineære gradienterH2O (0,1% vol / vol TFA) og acetonitril (0,1% vol / vol TFA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det cykliske peptid forstadium blev syntetiseret som et lineært peptid, ringsluttes, og ortogonalt Dde-afbeskyttet. Efter fældningen blev renheden af forbindelsen analyseret med HPLC-MS (figur 1). At overvåge forløbet af reaktionen blev en HPLC-analyse udføres efter 2-h reaktionstid (figur 2).

For større rester på guanidingruppen, omsætningen på 2 t er ofte ikke nok. I dette tilfælde blev reaktionen fortsat og overvåget med LC-MS. Efter omsætning og endelig afbeskyttelse blev forbindelserne oprenset ved anvendelse af semipræparativ HPLC-udstyr (udbytter typisk i lav-mg område). De endelige forbindelser blev analyseret med HPLC-MS for at evaluere renheden (se figur 3).

En lille mængde blev afvejet i et mikrocentrifugerør og fortyndet med DMSO til opnåelse af en stamme løsning for biologisk evaluering af forbindelsen i et ELISA-lignende, fast-fase bindingsassay. Resultaterne er afbildet i figur 4. Standard molekyle Cilengitid (umodificeret guanidingruppe) er medtaget som reference. Alle forbindelser har en relativ høj affinitet for integrin subtype avp3 og høj selektivitet mod α5β1.

figur 1
Figur 1: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% acetonitril (ACN) i et tofaset opløsningsmiddelsystem med H2O og ACN) af ortogonalt Dde-afbeskyttet derivat c (OrnGD (OtBu) f (N Me) V ) (beregnet masse: 602,34 g / mol), som blev opnået efter ringslutning af det lineære peptid, efterfølgende Dde-afbeskyttelse og fældning.ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% ACN i et bifasisk opløsningsmiddelsystem med H2O og ACN) af reaktionsblandingen efter guanidinylation omsætning af den ortogonalt afbeskyttes cykliske peptid og det methylerede forløber for guanidinylation. Udover peak produkt (Rt = 7,50 min, beregnet masse = 858,49 g / mol), kan observeres kun overskuddet af guanidinylation precursor (Rt = 6,38 min) og basen DIPEA (Rt = 0,90 min). Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% ACN i et bifasisk opløsningsmiddelsystem med H2O og ACN) af den rå forbindelse 2 (Rt = 3,69 min, beregnet masse = 603,32 g / mol) efter afbeskyttelsen de syrelabile sidekæder forud for semipræparativ oprensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Funktionalisering af guanidiner i opløsning og biologisk evaluering. Forbindelse 1, med en uændret guanidingruppe, er Cilengitid. Modifikationerne rettet i dette håndskrift er den methylerede (2), funktionaliseret (her, acetyl amino hexan; 3), og acetylerede (4) derivater. Than bindingsaffinitet blev bestemt i et fastfase-bindingsassay under anvendelse af isolerede proteiner 18. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forstadiet for guanidinylation er et ortogonalt afbeskyttes cyklisk peptidderivat, (c (OrnD (OtBu) Gf (N Me) V)), som er syntetiseret ved en standard Fmoc protokol af fastfase-peptidsyntese (SPPS). Ornithin blev anvendt som ortogonalt beskyttede derivat, (Fmoc-Orn (Dde) -OH), som kan afbeskyttes med hydrazin i DMF efter cykliseringen af ​​peptidet stilladset. Peptidet forstadium renses ved udfældning af forbindelsen og ved den efterfølgende lyofilisering.

Alkylerede forstadier for guanidinylation kan opnås i gode udbytter i en ettrins reaktion startende fra det kommercielt tilgængelige stof N, N'-di-Boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin gennem en alkyleringsreaktion under Mitsunobu-betingelser (PPh3 , DIAD, THF) 19, 10. Med denne reaktion, et stort udvalg af forstadier er accessible fra de tilsvarende alkoholer. Den guanidinylation omsætning med de alkylerede forstadier giver det definerede produkt i en ren reaktion. Overholdes fuldstændig omdannelse af reaktanten efter 2 timer, bør reaktionen fortsættes. Under betingelserne i protokollen, kun dannet mindre biprodukter; dog kan højere mængder urenheder ikke udelukkes for alle, især forskelligt beskyttet, substrater bærer større dele.

Hvis anvendelse guanidin-funktionaliserede peptider (længere linkere), Dde-beskyttelsesgruppen på den terminale amin af linkeren er fjernet, og kan konjugeres ved amidkobling til en tilsvarende syre. Afbeskyttelsen af Dde udføres i en opløsning af 2% hydrazin i DMF og giver den ortogonalt afbeskyttede peptid, som skal renses (f.eks semipræparativ HPLC) før yderligere anvendelse. I dette tilfælde blev en enkelt acetyleringsreaktion udføres in situ.

Hvisanvendelse acetylerede guanidiner, bør anvendes en anden precursor strategi. Begyndende fra S-methylisothiourinstof, er en totrins reaktion sekvens kræves 20. For det første skal en mono Boc beskyttelse af S-udføres 21, inden acetylering med en syre med valg (her, eddikesyre). Den guanidinylation reaktion er en meget ren og hurtig reaktion, den endelige forbindelse opnås efter den endelige afbeskyttelse af syrelabile sidekædebeskyttelsesgrupper.

Som allerede nævnt i indledningen, muliggør denne fremgangsmåde til modifikation og funktionalisering af enhver peptidisk guanidingruppe. Vi demonstrerede denne teknik på integrin ligander, der tillader, i dette tilfælde, tuning af subtype selektivitet ligander. Den uændrede integrinantagonisten Cilengitid er biselective for avp3 / a5p1 undertyper. Gennem methylering af den terminale N ω afguanidingruppen, en avp3-selektiv ligand viste. Dette blokerer en vigtig ende-mod interaktion, der er unikt observeret i α5β1, således inaktivere liganden for denne integrin. Den vigtigste interaktion med det bindingssted avp3 subtype er en ende-mod interaktion, der ikke forstyrres af denne vekselvirkning 10.

Ved at ændre liganden med længere linker enheder ( "funktionalisering"), kan to mål nås på én gang: selektivitet genereres gennem bryde enden-af interaktion med α5β1 undertype og, på den anden side, de linker point ud af den bindende lomme, hvilket tillader konjugation til store enheder (fx chelatorer eller fluorescerende farvestoffer til billeddannelsesteknikker) 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

TGK anerkender Den Internationale Forskerskolen for Science and Engineering (IGGSE) af Technische Universität München for deres økonomiske støtte. HK anerkender Center for Integreret Protein Science München (CIPSM) for deres støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Tags

Biokemi guanidin arginin peptid modifikation guanidinylation alkylering Mitsunobu
Ændring og Funktionalisering af guanidingruppen ved Skræddersyede Forstadier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler,… More

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter