Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Wijziging en functionalisering van de Guanidine Group door Tailor-made Voorlopers

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

Een protocol voor de synthese van met alkyl gemodificeerde guanidinen gebaseerd op het gebruik van de overeenkomstige precursors gepresenteerd.

Abstract

De guanidine groep is een van de belangrijkste farmacofore groepen in medicinale chemie. De enige aminozuren die een guanidine groep van arginine. In dit artikel wordt een eenvoudige werkwijze voor de modificatie van de guanidinegroep in peptidische liganden voorzien, een voorbeeld van RGD bindende integrine liganden. Recent werd aangetoond dat het sterke modificatie van de guanidinegroep in deze liganden maakt de selectieve modulatie van het subtype (bijvoorbeeld tussen de subtypes av en α5). Bovendien is een voorheen onbekende strategie voor de functionalisering via de guanidine groep werd aangetoond, en de synthetische benadering wordt beoordeeld in dit document. De beschreven modificaties omvatten eindstandig (N ω) gealkyleerd en geacyleerd guanidinegroepen. Voor de synthese worden op maat precursor moleculen gesynthetiseerd, die vervolgens worden onderworpen aan een reactie met een orthogonaal ontschermd amine om de pre overdragen-gemodificeerde guanidinegroep. Voor de bereiding van gealkyleerde guanidinen, precursors basis van N worden N'-di-Boc-1H-pyrazool-1-carboxamidine gebruikt geacyleerde verbindingen, de voorloper gekozen dat een overeenkomstige geacyleerde derivaat van N-Boc-S synthetiseren - methylisothioureum, die in één of twee stappen reacties worden verkregen.

Introduction

Onder de meest voorkomende farmacofore groepen in natuurlijke liganden is de guanidinegroep, dat betrokken is bij meervoudige interacties 1, 2. Zo dient het als een potentiële viervoudige waterstofdonor in waterstofbinding interacties en is betrokken bij elektrostatische interacties, zoals zoutbruggen of kation-π interacties. In medicinale chemie, wordt deze groep vaak drugs en geneesmiddelkandidaten 4, hoewel zeer vaak guanidine mimetica 5, 6. De reden voor de ontwikkeling van guanidine nabootsers is de verwijdering van de alomtegenwoordige, positief geladen guanidinegroep, en de aanpassing van de lipofiliciteit van het ligand. In peptidische liganden, alleen guanidine-bevattend aminozuur arginine, die daarom vaak in het biologisch actieve gebied van peptidische liganden.

Een zeer prominent voorbeeld voor een arginine bevattend ligand familie is de onderfamilie van de RGD-bindende integrines. In het algemeen zijn integrinen zijn een klasse van celadhesie receptoren, die in de loop belangrijke functies aan alle hogere organismen. Sommige van deze functies omvatten celadhesie, migratie en overleving cel. Zo zijn ze ook betrokken bij pathologische indicaties, zoals kanker en fibrose. Integrinen zijn heterodimere transmembraan eiwitten die bestaan ​​uit een α- en β-subeenheid dat integrine 24 bekende subtypen vormen; 8 herkennen het tripeptide Arg-Gly-Asp (RGD =) in hun liganden 7. De bindende gebied zich op het grensvlak tussen beide subtypen in het extracellulaire deel, de zogenaamde integrine kopgroep 8. RGD wordt herkend door twee gemeenschappelijke interacties: de metaalionen-afhankelijke adhesieplaats (MIDAS) gebied, dat zich in de beta-subeenheid en waarbij het carbonzuur in de liganden bindt (side chain of Asp); en guanidine-groep van de liganden, die zich in de alfa-subeenheid. De meeste integrine subtypen promiscue en tenminste een deel van hun natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) liganden 9 delen. Daarmee voor de ontwikkeling van kunstmatige integrine liganden, het hoofddoel is, naast een hoge bindingsaffiniteit het subtype selectiviteit. Onlangs waren we in staat om een ​​belangrijk element voor het genereren van subtype-selectieve liganden onthullen: de guanidine-groep. Door verschillende modificaties, biselective liganden voor av en α5-bevattend integrine subtypes kunnen worden omgezet in verbindingen selectief door eenvoudige modificaties van de guanidinegroep, die vervolgens kunnen onderscheiden van de verschillende α-subeenheden 10.

In de zak van av, de guanidinegroep interactie zijdelingse via een bidentaat zoutbrug van Asp218 11, 12. Deze interactie ceen eveneens worden waargenomen in α5β1 (hier met Asp227 in α5), maar bovendien wordt een end-on interactie van de guanidinegroep een Gin rest (Gln221) er 13 waargenomen. Zo hebben we wijzigde de guanidinegroep in twee tegengestelde manieren in een geval blokkeert de zijdelingse interactie met de methylering van het N δ guanidine-groep, en in het andere geval met de methylering van de guanidine N ω, blokkeren van het einde-wisselwerkingen. Verrassenderwijs dit kleine modificatie leidde tot een volledige selectiviteit verschuiving van de liganden. In aanvulling op de alkylering werd een nieuwe functionalisering methode geïntroduceerd in deze publicatie. De klassieke werkwijze voor functionalisering dergelijke pentapeptidic ligand via de zijketen conjugatie van een aminozuur niet betrokken bij binding (bijvoorbeeld K c (RGDfK)) 14, 15. Hier,laten we zien dat functionalisering mogelijk door aanpassing van de guanidine - die cruciaal is voor binding - met een acyl- of gealkyleerd linker. De positieve lading die essentieel is voor binding behouden en modellen suggereren dat de langketenige punten uit de bindende pocket, waardoor een ideale mogelijkheid voor de bevestiging van verdere linkers en etiketteeraggregaten (bijvoorbeeld een fluorescent label of een chelator voor moleculaire in beeld brengen).

In dit werk concentreren we ons op de voorbereidende stappen voor de modificatie van de guanidinegroep van arginine-bevattende liganden. Dit omvat de synthese van N- ω -methylated species, alsook guanidinen met meer verbindingseenheden. De verschillende modificaties omvatten acylgroepen en alkylgroepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Alle reagentia en oplosmiddelen werden verkregen van commerciële leveranciers en werden gebruikt zonder verdere zuivering.

Let op: Neem contact op met alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Gebruik alle passende veiligheidsuitrusting bij het uitvoeren van chemische synthese (bijvoorbeeld, zuurkast, een veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, full-length broek en dichte schoenen).

1. Synthese van de Guanidinylation Precursors

  1. gealkyleerde species
    1. gemethyleerde species
      1. Ontbinding 1,0 g N, N'-di-Boc-1H-pyrazool-1-carboxamidine (3,2 mmol, 1 eq.) En 1,0 g trifenylfosfine (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 10 ml droog tetrahydrofuran (THF) in een 50 ml rondbodem kolf onder een inerte atmosfeer met een rubberen septum bij kamertemperatuur (RT). Voeg 194 pl droog methanol met een injectiespuit (4,8 mmol, 1,5 eq.) En let Het roeren bij RT.
      2. Afzonderlijk werd een oplossing bereid met 747 pl diisopropylazodicarboxylaat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml droge THF in een klein glazen flesje. Voeg al roerend de oplossing DIAD in THF druppelsgewijs aan de oplossing van N, N'-di-Boc-1H-pyrazool-1-carboxamidine, PPh3 en methanol met een injectiespuit (15 min). Laat de oplossing gedurende 2 uur roeren bij kamertemperatuur.
      3. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper en los het ruwe product in 1 ml dichloormethaan (DCM). Plaats een flash kolom (2,5 cm x 20 cm) met 100 g silicagel in 10% ethylacetaat (EtOAc) in een pentaanoplossing. Laad het opgeloste ruwe product op de kolom en voeg het oplosmiddel onder druk (1,5 bar).
      4. Verzamelen van de fracties (oplosmiddelsysteem: isocratisch 10% EtOAc in pentaan), identificeren van de gewenste verbinding vlek met dunnelaagchromatografie (TLC) en verzamelen (Rf = 0,4, EtOAc / pentaan 1: 9, UV). Combineer de gewenstefrakties en verdampt het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper om 0,85 g van de titelverbinding als een gele, viskeuze olie (2,6 mmol, 81% opbrengst). Bewaar het verschafte verbinding bij kamertemperatuur verder gebruik.
    2. -Hexylamine gemodificeerde soorten
      1. Ontbinding 1,0 g N, N'-di-boc-1H-pyrazool-1-carboxamidine (3,2 mmol, 1,0 eq.), 0,9 g Dde-6-aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.) En 1,0 g PPh3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) in 10 ml droog THF in een 50 ml rondbodemkolf in een inerte atmosfeer met een rubberen septum bij kamertemperatuur.
      2. Afzonderlijk werd een oplossing bereid met 747 gl DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml droge THF in een klein glazen flesje. Voeg al roerend de oplossing DIAD in THF druppelsgewijs aan de oplossing van N, N'-di-Boc-1H-pyrazool-1-carboxamidine, PPh3 en Dde-6-aminohexanol met een injectiespuit (gedurende 15 min) . Laat de oplossing gedurende 2 uur roeren bij kamertemperatuur.
      3. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper en neemt het ruwe product in 1 ml DCM. Plaats een flash kolom (2,5 cm x 20 cm) met 100 g silicagel in een oplossing van pentaan / EtOAc (2: 1). Breng het opgeloste ruwe product op de kolom en voeg oplosmiddel onder druk (1,5 bar).
      4. Verzamelen van de fracties (oplosmiddelsysteem: isocratisch 2: 1 pentaan / EtOAc), identificeren van de gewenste fracties met TLC en verzamelen (Rf = 0,66, 2: 1 pentaan / EtOAc, UV). Combineer de gewenste fracties en damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper om 1,6 g van de titelverbinding als een gele, viskeuze olie (2,8 mmol, 88% opbrengst). Bewaar het verschafte verbinding bij kamertemperatuur verder gebruik.
  2. Geacyleerde species (2 reactiestappen)
    1. Ontbinding 1,4 g S -methylisothiuronium hemisulfaat (10 mmol, 1,0 eq.) En 2,2 g di (tert-butyl) dicarbonaat (10 mmol, 1,0 eq.) In een heftig roerenring bifasische oplossing van DCM / verz. aq. NaHCO3 en laat het gedurende 24 h roeren bij RT.
    2. Scheid de lagen in een scheitrechter en extraheer de waterfase driemaal met DCM. Combineer de organische fasen, drogen met Na 2 SO 4, en verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper. Neem het ruwe product in 1 ml hexaan.
    3. Plaats een flash kolom (2,5 cm x 20 cm) met 100 g silicagel in een oplossing van 4: 1 hexaan / EtOAc. Laad het opgeloste ruwe product op de kolom. Voeg het oplosmiddel onder druk. Identificeer de gewenste fracties met TLC (oplosmiddelsysteem: 4: 1 isocratisch hexaan / EtOAc (detectie UV: 254 nm) en verzamelen (Rf = 0,30).
    4. Combineer de gewenste fracties en damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper om 1,1 g van de titelverbinding als een gele, viskeuze olie (5,8 mmol, 58% opbrengst). Bewaar het reagens N - (tert-butoxycarbonyl) - S -methylisothiourea bij kamertemperatuur verder gebruik.
    5. Los 250 mg N - (tert-butoxycarbonyl) - S-methylisothioureum (1,3 mmol, 1,0 eq.) In 10 ml droge N, N-dimethylformamide (DMF) in een 50 ml rondbodemkolf in een inerte atmosfeer bij RT. Voeg 440 ui N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) (2,6 mmol, 2 eq.) Via een spuit. Voeg al roerend 245 ul van AC2O (5,2 mmol, 4,0 eq.) Druppelsgewijs via een spuit en laat het 1 uur roeren bij KT.
    6. Voeg een overmaat methanol (2 ml) aan het mengsel toegevoegd met een spuit en laat het roer 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper. Neem het ruwe product in 1 ml DCM.
    7. Plaats een flash kolom (2,5 cm x 20 cm) met 60 g silica in een oplossing van 3: 1 hexaan / EtOAc 3: 1. Breng het opgeloste ruwe product aan de kolom. Voeg oplosmiddel (3: 1 hexaan / EtOAc) en druk (1,5 bar). Identificeer de gewenste fracties met TLC (3: 1 hexaan / EtOAc, UV: 220 nm) en colLECT hen (Rf = 0,62).
    8. Combineer de gewenste fracties en damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper tot 210 mg van de gewenste verbinding als een witte vaste stof (0,9 mmol, 70% opbrengst). Bewaar de verbinding bij kamertemperatuur verder gebruik.

2. Synthese van cyclische peptideprecursors

  1. Laden en aftopping TCP hars
    1. Voeg 1,00 g 2-chlortriyl chloride (CTC) hars (0,9 mmol / g) en 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 eq.) In een kunststof 20 ml spuit met een frit. Bereid een oplossing van 313 pl DIPEA (2 eq.) In 5 ml droge DCM toevoegen aan de spuit. Laten roteren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een draai-eenheid.
    2. Bereid ondertussen een 2 ml oplossing van 5: 1 methanol / DIPEA (v / v; afdekken oplossing). Voeg de aftopping oplossing aan de spuit en laat hem te draaien voor nog eens 15 min. Spoel de hars met DCM (5x) en DMF (3x).
  2. On-hars Fmoc ontscherming
    1. Behandel de harsgebonden Fmoc-Gly met 20% piperidine in DMF gedurende 10 min en vervolgens gedurende 5 minuten. Spoel de hars met DMF (3x).
  3. On-hars koppelen van Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Voeg 934 mg Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 eq.), 684 mg 1- [bis (dimethylamino) methyleen] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide (HATU) (2 eq.) en 245 mg 1- hydroxy-7-azabenzotriazool (HOAt) (2 eq.) in een klein glazen flesje en oplossen in 5 ml DMF. Voeg 814 ul van DIPEA.
    2. Voeg deze oplossing toe aan de Fmoc-bescherming verwijderd, gewassen en harsgebonden Gly en laat roteren gedurende 1 uur. Spoel de hars met DMF (3x).
  4. On-hars Fmoc ontscherming
    1. Behandel de harsgebonden Fmoc-Orn (Dde) -Gly met 20% piperidine in DMF gedurende 10 min en vervolgens gedurende 5 minuten. Spoel de hars met DMF (3x).
  5. On-hars koppelen van Fmoc-Val-OH
    1. Voeg 610 mg Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) En 245 mg HOAt (2 eq.) In een klein glazen flesje en oplossen in 5 ml DMF. Voeg 814 ul van DIPEA.
    2. Voeg deze oplossing toe aan de Fmoc-bescherming verwijderd, gewassen en harsgebonden Orn (Dde) -Gly en laat roteren gedurende 1 uur.
  6. On-hars Fmoc ontscherming
    1. Behandel de harsgebonden Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly met 20% piperidine in DMF gedurende 10 min en vervolgens gedurende 5 minuten. Spoel de hars met DMF (3x).
  7. On-hars N- methylatie
    1. Spoel de hars met DCM (3x). Oplossen 887 mg 2-nitrobenzenesulfonylchloride (o -NBS-Cl, 4 eq.) In DCM en voeg 1,2 ml 2,4,6-collidine (10 eq.).
    2. Voeg de oplossing van het harsgebonden peptide en laat het incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Spoel de hars met CH 2CI 2 (3x) en THF (5x). Bereid een oplossing met 1,18 g PPh3 (5 eq.) En 365 pl methanol in THF. Voeg deze oplossing toe aan deinjectiespuit.
    4. Bereid een oplossing met 883 gl DIAD in 2 ml THF toevoegen aan de spuit. Laat het incubeer gedurende 15 minuten. Spoel de hars met THF (5x) en met DMF (5x).
  8. o -ns ontscherming
    1. Bereid een oplossing met 570 ui mercaptoethanol (10,0 eq.) En 672 pl diazabicycloundecen (DBU) in 2 ml DMF. Voeg deze oplossing toe aan de spuit en laat het incubeer gedurende 5 min.
    2. Herhaal de ontschermingsstap en daarna wassen van de hars met DMF (5x).
  9. On-hars koppeling van Fmoc-D-Phe-OH
    1. Voeg 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) En 245 mg HOAt (2 eq.) In een klein glazen flesje en oplossen in 5 ml DMF . Voeg 814 ul van DIPEA.
    2. Voeg deze oplossing toe aan de Fmoc-bescherming verwijderd, gewassen en aan hars gebonden peptide en laat roteren gedurende 1 uur.
  10. On-hars Fmoc ontscherming
    1. Behandel het hars-bound peptide met 20% piperidine in DMF gedurende 10 min en vervolgens gedurende 5 minuten. Spoel de hars met DMF (3x).
  11. On-hars koppelen van Fmoc-Asp (OtBu) -OH
    1. Voeg 741 mg Fmoc-Asp (OtBu) -OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) En 245 mg HOAt (2 eq.) In een klein glazen flesje en oplossen in 5 mL DMF. Voeg 814 ul van DIPEA.
    2. Voeg deze oplossing toe aan de Fmoc-bescherming verwijderd, gewassen en aan hars gebonden peptide en laat roteren gedurende 1 uur.
  12. Splitsing van het lineaire peptide van de hars
    1. Spoel de hars met DCM (3x) en daarna bereiden 10 ml van een oplossing van hexafluorisopropanol (HFIP) in DCM (1: 4, v / v).
    2. Voeg de oplossing aan de hars en laat het draaien gedurende 15 minuten. Verzamelen van de oplossing in een rondbodemkolf. Herhaal de splitsing en damp het oplosmiddel met een rotatieverdamper.
  13. Cyclisatie van het lineaire peptide
    1. dissolve 384 mg NaHCO3 (5,0 eq.) en 582 pl van difenylfosforylazide (DPPA) (3,0 eq.) in 50 ml DMF toevoegen aan het ruwe product. Laat het overnacht roeren of totdat geen lineaire peptide wordt waargenomen met ESI-MS (10 h) 17.
    2. Onder verminderde druk verlagen van het oplosmiddel tot een klein volume met een rotatieverdamper. Bereid een verzadigde oplossing van NaCl (zoutoplossing). Met een Pasteur pipet het gecycliseerde peptide druppelsgewijs aan 40 ml verzadigde waterige oplossing van NaCl in een centrifugebuis.
    3. Centrifugeer de suspensie (5000 x g, 5 min) en was het neerslag door middel van HPLC-kwaliteit water (2x). Lyofiliseren het product.

3. Guanidinylation en Deprotectie in Solution

  1. Guanidinylation met de op maat gemaakte voorlopers
    1. Lossen een kleine hoeveelheid (bijvoorbeeld 25 mg) van de orthogonaal ontschermde cyclisch peptide in een klein volume DMF (bijvoorbeeld 2 mL). Voeg 2 eq. de guanidinylation precursor en 2 eq. DIPEA aan de oplossing en laat het 2 uur roeren bij kamertemperatuur.
    2. De voortgang van de reactie met HPLC-MS. Nadat de reactie is voltooid, verwijdert het oplosmiddel opnieuw oplossen guanidinylated het cyclische peptide in acetonitril en uitvoeren semi- preparatieve HPLC zuivering 16.
  2. Verwijdering van zure labiele zijketen-beschermende groepen
    1. Bereid 2 ml van een oplossing van trifluorazijnzuur (TFA), water en triisopropylsilaan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Voeg deze oplossing toe aan het gezuiverde product in een klein glazen flesje en laten roeren bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. Echter de volledige ontscherming met ESI-MS 17.
    2. Damp het oplosmiddel onder verminderde druk tot een klein volume. Bereid ijskoude ether en voeg 10 ml in een 50 ml centrifugebuis. Precipiteren de ontschermde peptide in ijskoude ether met een Pasteur pipet toe te voegendruppelsgewijs toegevoegd. Centrifugeer de suspensie (5000 x g, 5 min) om een ​​pellet te verkrijgen.
    3. Spoel het neerslag met ijskoude ether en centrifugeer deze (5000 x g, 5 min, 2 x). Los het product op in 2 ml HPLC kwaliteit water en zuiveren met semi-preparatieve HPLC 16.

4. analytische gegevens en parameters voor de zuivering

  1. Analytische HPLC-ESI-MS
    1. Uitvoeren van analytische HPLC-ESI-MS met een LCQ massaspectrometer onder toepassing van een C18 kolom (12 nm poriegrootte, 3-um deeltjesgrootte, 125 mm x 2,1 mm) of een C8 kolom (20 nm poriegrootte 5 urn deeltjesgrootte maat 250 mm x 2,1 mm), met H2O (0,1% v / v mierenzuur) / acetonitril (0,1% v / v mierenzuur) als elutiemiddelen.
  2. Semi-preparatieve HPLC
    1. Uitvoeren van semi-preparatieve HPLC met een preparatieve HPLC instrument met een ODS-A-kolom (20 x 250 mm, 5 pm), een stroomsnelheid van 8 ml / minuut, en lineaire gradiëntenH2O (0,1% v / v TFA) en acetonitril (0,1% v / v TFA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het cyclische peptide precursor werd gesynthetiseerd als een lineair peptide gecycliseerd en orthogonaal Dde-bescherming ontdaan. Na de precipitatie werd de zuiverheid van de verbinding geanalyseerd met HPLC-MS (figuur 1). De voortgang van de reactie te volgen, werd een HPLC-analyse uitgevoerd na de 2-uur reactietijd (figuur 2).

Voor grotere resten op de guanidinegroep, de reactietijd van 2 uur is vaak niet genoeg. In dit geval werd de reactie voortgezet en gevolgd met LC-MS. Nadat de reactie en uiteindelijke ontscherming werden de verbindingen gezuiverd met semi-voorbereidende HPLC-apparatuur (opbrengst gewoonlijk in het lage mg bereik). De uiteindelijke verbindingen werden geanalyseerd met HPLC-MS om de zuiverheid (zie figuur 3) te evalueren.

Een kleine hoeveelheid werd afgewogen in een microcentrifugebuis en verdund met DMSO om een ​​steel oplossing voor de biologische evaluatie van de verbinding in een ELISA-achtige, vaste fase bindingstest verkrijgen. De resultaten zijn weergegeven in figuur 4. De standaard molecule Cilengitide (ongemodificeerde guanidinegroep) wordt opgenomen als referentie. Alle verbindingen bezitten een relatief hoge affiniteit voor het avß3 integrine subtype en hoge selectiviteit tegen α5β1.

Figuur 1
Figuur 1: HPLC-MS spectrum (gradiënt: 10-90% acetonitril (ACN) in een tweefasig oplosmiddelsysteem met H2O en ACN) van de orthogonaal Dde-ontschermde derivaat c (OrnGD (OtBu) f (N Me) V ) (berekende massa: 602,34 g / mol), zoals verkregen na de cyclisatie van het lineaire peptide, Dde daaropvolgende ontscherming en precipitatie.ank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: HPLC-MS spectrum (gradiënt: 10-90% ACN in een tweefasig oplosmiddelsysteem met H2O en ACN) van het reactiemengsel na de omzetting van de guanidinylation orthogonaal ontschermde cyclische peptide en het gemethyleerde voorloper van guanidinylation. Naast de productpiek (Rt = 7,50 min, berekende massa = 858,49 g / mol), kunnen alleen de overmaat guanidinylation precursor (Rt = 6,38 min) en de basis DIPEA (Rt = 0,90 min) worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: HPLC-MS spectrum (gradiënt: 10-90% ACN in een tweefasig oplosmiddelsysteem met H2O en ACN) van de onzuivere verbinding 2 (Rt = 3,69 min, berekende massa = 603,32 g / mol) na de ontscherming van de zure labiele zijketens voor de semi-voorbereidende zuivering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: functionalisering van guanidinen in oplossing en biologische evaluatie. samenstelling 1, met een ongewijzigde guanidinegroep, is Cilengitide. De wijzigingen in dit manuscript ingediend, zijn gemethyleerd (2), gefunctionaliseerde (hier acetylamino hexaan, 3) en geacetyleerd (4) -derivaten. THij bindingsaffiniteit werd bepaald in een vaste fase bindingstest met behulp geïsoleerde eiwitten 18. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De voorloper voor guanidinylation een orthogonaal ontschermd cyclisch peptidederivaat, (c (OrnD (OtBu) Gf (N Me) V)), dat wordt gesynthetiseerd door een standaard protocol van Fmoc vaste-fase peptidesynthese (SPPS). Ornithine werd gebruikt als orthogonaal beschermde derivaat (Fmoc-Orn (Dde) -OH), die met hydrazine kan worden ontschermd in DMF na de cyclisatie van het peptide scaffold. Het peptide precursor wordt gezuiverd door de precipitatie van de verbinding en de daaropvolgende lyofilisering.

Gealkyleerde precursors voor guanidinylation kan worden verkregen met goede opbrengsten in een eenstaps reactie uitgaande van in de handel verkrijgbare stof N, N'-di-Boc-1H-pyrazool-1-carboxamidine door een alkyleringsreactie onder Mitsunobu condities (PPh3 , DIAD THF) 19 10. Met deze reactie, een grote verscheidenheid van precursoren is accessible uit de overeenkomstige alcoholen. De guanidinylation reactie met het gealkyleerde precursors levert het product gedefinieerd in een schone reactie. Als volledige omzetting van het reagens niet wordt waargenomen na 2 uur, moet de reactie voortgezet. Onder de in het protocol omstandigheden slechts geringe nevenproducten gevormd; echter kunnen grotere hoeveelheden verontreinigingen niet uitgesloten voor, vooral verschillend beschermde substraten dragen grotere eenheden.

Bij gebruik van guanidine-gefunctionaliseerde peptiden (langere linkers), de beschermende Dde-groep op de eindstandige amine van de linker en verwijderd kan worden geconjugeerd door amide- koppeling met een overeenkomstig zuur. Ontscherming van Dde wordt uitgevoerd in een oplossing van 2% hydrazine in DMF en levert het orthogonaal ontschermd peptide, die moet worden gezuiverd (bijvoorbeeld semi-voorbereidende HPLC) voor verder gebruik. In dit geval werd een eenvoudige acetyleringsreactie uitgevoerd in situ.

Alsgebruik geacetyleerde guanidinen, moet een andere precursor strategie worden toegepast. Uitgaande van S-methylisothioureum, is een tweestaps reactievolgorde vereist 20. Eerst moet een mono-Boc-bescherming van S-methylisothioureum worden uitgevoerd 21 voordat acetylering met een zuur keuze (hier, azijnzuur). De guanidinylation reactie is zeer schoon en snelle reactie, de eindverbinding wordt verkregen na de uiteindelijke ontscherming van zuurgevoelige zijketenschermgroepen.

Zoals reeds in de inleiding vermeld, maakt deze werkwijze voor de modificatie en functionalisering van elke peptidische guanidinegroep. We hebben laten zien deze techniek op integrine liganden, die het mogelijk maken, in dit geval, het afstemmen van het subtype selectiviteit van de liganden. Het ongemodificeerde integrine antagonist Cilengitide is biselective voor avß3 / α5β1 subtypen. Door de methylering van het terminale N ω vanguanidine-groep, een avß3-selectieve ligand wordt verkregen. Dit blokkeert een belangrijke end-wisselwerkingen die uniek is waargenomen in α5β1, waardoor de ligand voor dit integrine inactiveren. De belangrijkste interactie met de bindingsplaats van de avß3 subtype is een end-on interactie die niet wordt verstoord door deze interactie 10.

Door het modificeren van het ligand met langere verbindingseenheden ( "functionalisering"), kan twee doelen worden bereikt in een keer: selectiviteit ontstaat een fout eind-tegen interactie met de α5β1 subtype en, anderzijds, de koppelaar punten uit de bindingsplaats, waardoor conjugatie aan grote entiteiten (bijvoorbeeld chelatoren of fluorescerende kleurstoffen voor beeldvormingstechnieken) 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

TGK erkent de International Graduate School for Science and Engineering (IGGSE) van de Technische Universität München voor hun financiële steun. HK erkent het Center for Integrated Protein Science München (CIPSM) voor hun steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Tags

Biochemistry guanidine arginine peptide modificatie guanidinylation alkylering Mitsunobu
Wijziging en functionalisering van de Guanidine Group door Tailor-made Voorlopers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler,… More

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter