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Biochemistry

Modification et fonctionnalisation du groupe Guanidine par Précurseurs sur mesure

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole pour la synthèse de guanidines modification alkyle basés sur l'utilisation des précurseurs correspondants est présentée.

Abstract

Le groupe guanidino est l'un des plus importants groupes pharmacophores en chimie médicinale. Le seul acide aminé portant un groupe guanidine est l'arginine. Dans cet article, une méthode simple pour la modification du groupe de guanidine en ligands peptidiques est prévu, avec un exemple de ligands d'intégrine RGD liant. Il a été récemment démontré que la modification distincte du groupe guanidine dans ces ligands permet la modulation sélective du sous - type (par exemple, entre les sous - types aV et α5). De plus, une stratégie auparavant inconnue pour la fonctionnalisation par le groupe guanidino a été démontrée, et l'approche synthétique est examinée dans le présent document. Les modifications décrites ici impliquent terminale (N ω) des groupes guanidine alkylés et acétylés. Pour la synthèse, des molécules de précurseur sur mesure sont synthétisés, qui sont ensuite soumis à une réaction avec une amine déprotégée orthogonalement pour transférer le préguanidinique -Modified. Pour la synthèse de guanidines alkylées, les précurseurs à base de N, -di-Boc-1 H-pyrazole-1-carboxamidine N 'sont utilisés pour synthétiser des composés acylés, le précurseur de choix étant un dérivé acylé de façon correspondante de N - Boc - S - méthylisothiourée, qui peut être obtenu dans les réactions à une et à deux étapes.

Introduction

Parmi les groupements pharmacophores les plus abondants dans les ligands naturels est le groupe de guanidine, qui est impliquée dans de multiples interactions 1, 2. Par exemple, il sert de quatre fois le potentiel donneur d'hydrogène dans des interactions de liaison hydrogène et est impliqué dans des interactions électrostatiques, tels que les ponts salins ou des interactions π-cation. Dans la chimie médicinale, ce groupe est souvent trouvé dans les médicaments et les médicaments candidats 4, bien que très souvent mimétiques guanidines 5, 6. La raison du développement de mimétiques de guanidine est la suppression de l'omniprésent, un groupe guanidine chargé positivement, ainsi que l'ajustement de la lipophilie du ligand. Dans les ligands peptidiques, le seul groupe contenant de l'acide aminé est l'arginine guanidine, qui est donc souvent trouvé dans la région bioactive de ligands peptidiques.

Une très prominent exemple pour une famille de ligands contenant de l'arginine est la sous-famille des intégrines RGD liant. En général, les intégrines sont une classe de récepteurs d'adhésion cellulaire, qui prennent en charge des fonctions importantes dans tous les organismes supérieurs. Certaines de ces fonctions impliquent l'adhésion cellulaire, la migration et la survie des cellules. Ainsi, ils sont également impliqués dans des indications pathologiques, comme le cancer et la fibrose. Les intégrines sont des protéines transmembranaires hétérodimériques consistant en un α- et une sous-unité β qui forment les sous-types 24 d'intégrine connus; 8 d'entre eux reconnaissent la séquence tripeptidique Arg-Gly-Asp (RGD =) dans leurs ligands 7. La région de liaison est située à l'interface entre ces deux sous - types dans la partie extracellulaire, que l'on appelle groupe de tête de l' intégrine 8. RGD est reconnu par deux interactions communes: le site d'adhésion dépendant de l'ion métallique (MIDAS) région, qui est située dans la sous-unité bêta et qui se lie à l'acide carboxylique dans les ligands (côté chaen Asp); et le groupe guanidine des ligands, qui se trouve dans la sous-unité alpha. La plupart des sous - types d' intégrine sont promiscuité et partagent au moins une partie de leur matrice extracellulaire naturelle (ECM) des ligands 9. Ainsi, pour le développement de ligands artificiels intégrines, le principal objectif est, outre une affinité de liaison élevée, la sélectivité du sous-type. Récemment, nous avons pu dévoiler un élément clé pour la génération de ligands sous-type sélectif: le groupe guanidique. Grâce à des modifications distinctes, des ligands pour le biselective αv- et α5 intégrine contenant des sous - types peuvent être transformés en composés sélectifs par de simples modifications sur le groupe de guanidine, qui peut alors distinguer les différentes sous - unités α-10.

Dans la poche de aV, le groupe guanidine interagit côté via un pont de sel bidentate avec Asp218 11, 12. Cette interaction cun lieu d' observer également dans α5β1 (ici, avec Asp227 en α5), mais en outre, une extrémité sur l' interaction du groupe guanidine par un résidu Gln (Gln221) est observée là 13. Ainsi, nous avons modifié le groupe guanidine de deux manières opposées: dans un cas, en bloquant la partie en interaction avec la méthylation de la N δ du groupe de guanidine, et dans l'autre cas, avec la méthylation du N guanidine ω, bloquant l'interaction en bout. Étonnamment, cette petite modification a conduit à un changement de sélectivité complète dans les ligands. En plus de l'alkylation, une nouvelle méthode de fonctionnalisation a été introduit dans cette publication. Le procédé de fonctionnalisation classique pour ce type de ligand pentapeptidic est par la conjugaison de la chaîne latérale d'un acide aminé non impliqué dans la liaison (par exemple, K c (RGDfK)) 14, 15. Ici,nous montrons que fonctionnalisation est également possible en modifiant la guanidique - ce qui est crucial pour la liaison - avec un acyl ou agent de liaison alkylée. La charge positive qui est essentielle pour la liaison est maintenue, et les modèles suggèrent que les longs points de chaîne hors de la poche de liaison, fournissant ainsi une possibilité idéale pour la fixation d'autres groupes de liaison et des unités étiquetage (par exemple, un marqueur fluorescent ou un agent chélatant pour moléculaire imagerie).

Dans ce travail, nous nous concentrons sur les étapes de préparation pour la modification du groupe guanidique ligands contenant de l'arginine. Cela implique la synthèse de N d'espèces -methylated, ainsi que guanidines avec des unités de liaison plus. Les différentes modifications comprennent des groupes acyle et alkyle.

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Protocol

Remarque: Tous les réactifs et les solvants ont été obtenus auprès de fournisseurs commerciaux et ont été utilisés sans autre purification.

Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de sécurité des matières pertinentes (FS) avant utilisation. S'il vous plaît utiliser tous les équipements de sécurité appropriés lors de l' exécution des synthèses chimiques (par exemple, hotte, lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons pleine longueur et des chaussures fermées).

1. Synthèse des Précurseurs Guanidinylation

  1. espèces alkylés
    1. espèces méthylés
      1. Dissoudre 1,0 g de N, N '-di-Boc-1 H-pyrazole-1-carboxamidine (3,2 mmol, 1 éq.) Et 1,0 g de triphénylphosphine (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 éq.) Dans 10 mL de sec le tétrahydrofuranne (THF) dans un ballon à fond rond de 50 ml dans une atmosphère inerte à l'aide d'un septum en caoutchouc à température ambiante (RT). Ajouter 194 ul de methanol sec à l'aide d'une seringue (4,8 mmol, 1,5 éq.) Et let ce sous agitation à TA.
      2. Séparément, on prépare une solution avec 747 uL d'azodicarboxylate de diisopropyle (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 éq.) Dans 2 mL de THF sec dans un petit flacon en verre. Tout en agitant, ajouter la solution de DIAD dans du THF goutte à goutte à la solution de N, N '-di-Boc-1 H-pyrazole-1-carboxamidine, PPh 3, et de methanol en utilisant une seringue (sur 15 min). Laissez le malaxage solution pendant 2 h à TA.
      3. Eliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif et on dissout le produit brut dans 1 ml de dichlorométhane (DCM). Charger une colonne (2,5 cm x 20 cm) avec 100 g de silice dans 10% d'acétate d'éthyle (EtOAc) dans une solution de pentane. Charger le produit brut dissous dans la colonne et ajouter le solvant sous pression (1,5 bar).
      4. Recueillir les fractions (système solvant: isocratique 10% de EtOAc dans le pentane), d' identifier le point de composé désiré par Chromatographie en couche mince (TLC), et de recueillir le (R f = 0,4, EtOAc / pentane 1: 9, UV). Combiner le choixfractions et on évapore le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir 0,85 g du composé du titre sous la forme d'une huile jaune visqueuse (2,6 mmol, 81% de rendement). Stocker le composé donné à la température ambiante pour une utilisation ultérieure.
    2. Espèce modifiée hexylamine-
      1. Dissoudre 1,0 g de N, N '-di-boc-1 H-pyrazole-1-carboxamidine (3,2 mmol, 1,0 éq.), 0,9 g de Dde-6-aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 éq.), Et 1,0 g de PPh3 (3,8 mmol, 1,2 éq.) dans 10 ml de THF anhydre dans un ballon à fond rond de 50 ml sous atmosphère inerte en utilisant un septum en caoutchouc à température ambiante.
      2. Séparément, on prépare une solution avec 747 ul de DIAD (3,8 mmol, 1,2 éq.) Dans 2 mL de THF sec dans un petit flacon en verre. Tout en agitant, ajouter la solution de DIAD dans du THF goutte à goutte à la solution de N, N '-di-Boc-1 H-pyrazole-1-carboxamidine, PPh 3, et Dde-6-aminohexanol en utilisant une seringue (plus de 15 min) . Laissez le malaxage solution pendant 2 h à TA.
      3. Eliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif et prendre la place du produit brut dans 1 ml de DCM. Charger une colonne (2,5 cm x 20 cm) avec 100 g de silice dans une solution de pentane / EtOAc (2: 1). Appliquer le produit brut a été dissous dans la colonne et ajouter le solvant sous pression (1,5 bar).
      4. Recueillir les fractions (système solvant: isocratique 2: 1 pentane / AcOEt), identifier les fractions désirées avec TLC, et les récupérer (R f = 0,66, 2: 1 pentane / AcOEt, UV). Combiner les fractions souhaitées et évaporer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir 1,6 g du composé du titre sous la forme d'une huile jaune visqueuse (2,8 mmol, rendement 88%). Stocker le composé donné à la température ambiante pour une utilisation ultérieure.
  2. Espèces acylées (2 étapes de réaction)
    1. Dissoudre 1,4 g de S -methylisothiuronium hémisulfate (10 mmol, 1,0 éq.) Et 2,2 g de di (tert - butyl) dicarbonate (10 mmol, 1,0 éq.) Dans une agitation vigoureuseanneau solution biphasique de DCM / sat. aq. NaHCO 3 et laisser agiter pendant 24 h à TA.
    2. Séparer les couches dans une ampoule à décanter et on extrait la phase aqueuse trois fois avec du DCM. Combiner les phases organiques, les sécher avec Na 2 SO 4, et éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. Prenez la place du produit brut dans 1 ml d'hexane.
    3. Charger une colonne (2,5 cm x 20 cm) avec 100 g de silice dans une solution de 4: 1 hexane / EtOAc. Charger le produit brut dissous dans la colonne. Ajouter solvant sous pression. Identifier les fractions désirées avec CCM (système de solvants: 4: 1 isocratique hexane / EtOAc (détection UV: 254 nm), et de les rassembler (R f = 0,30).
    4. Combiner les fractions souhaitées et évaporer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir 1,1 g du composé du titre sous forme d'une huile jaune visqueuse (5,8 mmol, 58% de rendement). Stocker le réactif, le N - (tert - butoxycarbonyl) - S -Methylisothiourea, à la température ambiante pour une utilisation ultérieure.
    5. Dissoudre 250 mg de N - (tert - butoxycarbonyl) - S -methylisothiourea (1,3 mmol, 1,0 éq.) Dans 10 ml de N, N - diméthylformamide (DMF) dans un ballon à fond rond de 50 ml dans une atmosphère inerte à RT. Ajouter 440 ul de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA) (2,6 mmol, 2 éq.) À l'aide d'une seringue. Tout en agitant, ajouter 245 ul de Ac 2 O (5,2 mmol, 4,0 éq.) Goutte à goutte avec une seringue et laisser agiter pendant 1 h à température ambiante.
    6. Ajouter un excès de methanol (2 mL) au mélange à l'aide d'une seringue et laisser agiter pendant 15 minutes à température ambiante. Eliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. Prenez la place du produit brut dans 1 ml de DCM.
    7. Charger une colonne (2,5 cm x 20 cm) avec 60 g de silice dans une solution de 3: 1 hexane / EtOAc 3: 1. Appliquer le produit brut dissous dans la colonne. Ajouter solvant (3: 1 hexane / EtOAc) et de pression (1,5 bar). Identifier les fractions désirées par CCM (3: 1 hexane / EtOAc, UV: 220 nm), et colLect les (R f = 0,62).
    8. Combiner les fractions souhaitées et évaporer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir 210 mg du composé du titre sous forme d'un solide blanc (0,9 mmol, 70% de rendement). Stocker le composé à la température ambiante pour une utilisation ultérieure.

2. Synthèse du peptide cyclique Précurseurs

  1. Chargement et capsulage résine TCP
    1. Ajouter 1,00 g de chlorure de 2-chlortriyl résine (CTC) (0,9 mmol / g) et 320 mg de Fmoc-Gly-OH (1,2 éq.) Dans une seringue de 20 ml en matière plastique avec une fritte. Préparer une solution de 313 ul de DIPEA (2 éq.) Dans 5 ml de DCM sec et l'ajouter à la seringue. Laissez tourner pendant 1 h à la température ambiante en utilisant un appareil rotatif.
    2. Pendant ce temps, préparer une solution de 5 2 ml: 1 méthanol / DIPEA (v / v; solution de bouchage). Ajouter la solution à la seringue capsulage et laissez-le tourner pendant 15 min. Laver la résine avec du DCM (5x) et de DMF (3 x).
  2. En résine déprotection Fmoc
    1. Traiter la Fmoc-Gly avec 20% de pipéridine dans du DMF liée à une résine pendant 10 minutes, puis pendant 5 min. Laver la résine avec du DMF (3x).
  3. On-résine couplage de Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Ajouter 934 mg de Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 éq.), 684 mg de 1- [bis (diméthylamino) méthylène] -1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide (HATU) (2 éq.) et 245 mg de 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) (2 éq.) à un petit flacon de verre et le dissoudre dans 5 ml de DMF. Ajouter 814 ul de DIPEA.
    2. Ajouter cette solution à la Fmoc-déprotégé, lavé et lié à la résine Gly et laissez-le tourner pendant 1 h. Laver la résine avec du DMF (3x).
  4. En résine déprotection Fmoc
    1. Traiter la Fmoc-Orn (Dde) -Gly avec 20% de pipéridine dans du DMF liée à une résine pendant 10 minutes, puis pendant 5 min. Laver la résine avec du DMF (3x).
  5. Couplage en résine de Fmoc-Val-OH
    1. Ajouter 610 mg de Fmoc-Val-OH (2 éq.), 684 mg de HATU (2 éq.) Et 245 mg de HOAt (2 éq.) Dans un petit flacon de verre et le dissoudre dans 5 ml de DMF. Ajouter 814 ul de DIPEA.
    2. Ajouter cette solution à la Fmoc-déprotégée, lavé et Orn (Dde) liée à une résine -Gly et le laisser tourner pendant 1 h.
  6. En résine déprotection Fmoc
    1. Traiter la Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly avec 20% de pipéridine dans du DMF liée à une résine pendant 10 minutes, puis pendant 5 min. Laver la résine avec du DMF (3x).
  7. On-résine N- Méthylation
    1. Laver la résine avec du DCM (3x). Dissoudre 887 mg de 2-nitrobenzenesulfonylchloride (o -NBS-Cl, 4 éq.) Dans du DCM et ajoute 1,2 ml de 2,4,6-collidine (10 éq.).
    2. Ajouter la solution au peptide lié à la résine et laisser incuber pendant 20 min à température ambiante.
    3. Laver la résine avec du CH 2 Cl 2 (3 fois) et avec du THF (5x). Préparer une solution de 1,18 g de PPh3 (5 éq.) Et 365 ul de methanol dans du THF. Ajouter cette solution à laseringue.
    4. Préparer une solution avec 883 pi de DIAD dans 2 ml de THF et l'ajouter à la seringue. Laisser incuber pendant 15 min. Laver la résine avec du THF (5x) et avec du DMF (5x).
  8. o déprotection -ns
    1. Préparer une solution de 570 ul de mercaptoéthanol (10,0 éq.) Et 672 ul de diazabicycloundecen (DBU) dans 2 ml de DMF. Ajouter cette solution à la seringue et laisser incuber pendant 5 min.
    2. Répétez l'étape de déprotection, puis laver la résine avec du DMF (5x).
  9. Couplage en résine de Fmoc - D-Phe-OH
    1. Ajouter 697 mg de Fmoc-D-Phe-OH (2 éq.), 684 mg de HATU (2 éq.) Et 245 mg de HOAt (2 éq.) Dans un petit flacon de verre et le dissoudre dans 5 ml de DMF . Ajouter 814 ul de DIPEA.
    2. Ajouter cette solution au peptide Fmoc-déprotégée, lavé et lié à la résine et le laisser tourner pendant 1 h.
  10. En résine déprotection Fmoc
    1. Traiter la résine-bound peptide avec 20% de pipéridine dans du DMF pendant 10 min, puis pendant 5 min. Laver la résine avec du DMF (3x).
  11. Couplage en résine de Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH
    1. Ajouter 741 mg de Fmoc - Asp (Ot Bu) -OH (2 éq.), 684 mg de HATU (2 éq.) Et 245 mg de HOAt (2 éq.) Dans un petit flacon de verre et le dissoudre dans 5 ml de DMF. Ajouter 814 ul de DIPEA.
    2. Ajouter cette solution au peptide Fmoc-déprotégée, lavé et lié à la résine et le laisser tourner pendant 1 h.
  12. Le clivage du peptide linéaire de la résine
    1. Laver la résine avec du DCM (3x) et ensuite préparer 10 ml d'une solution d'hexafluoroisopropanol (HFIP) dans du DCM (1: 4, v / v).
    2. Ajouter la solution à la résine et le laisser tourner pendant 15 min. Recueillir la solution dans un ballon à fond rond. Répéter le clivage et évaporer le solvant en utilisant un évaporateur rotatif.
  13. La cyclisation du peptide linéaire
    1. dissolve 384 mg de NaHCO 3 (5,0 éq.) et 582 ul d'azide de diphénylphosphoryle (DPPA) (3,0 éq.) dans 50 mL de DMF et l' ajouter au produit brut. Qu'il agitation pendant une nuit ou jusqu'à ce qu'aucun peptide linéaire est observée avec ESI-MS (10 h) 17.
    2. Sous pression réduite, de réduire le solvant à un petit volume à l'aide d'un évaporateur rotatif. Préparer une solution aqueuse saturée de NaCl (saumure). En utilisant une pipette Pasteur, ajouter goutte à goutte le peptide cyclisé à 40 ml de solution aqueuse saturée de NaCl dans un tube de centrifugeuse.
    3. Centrifuger la suspension (5000 xg, 5 min) et on lave le précipité avec de l'eau de qualité HPLC (2x). Lyophiliser le produit.

3. Guanidinylation et Déprotection dans la solution

  1. Guanidinylation avec les précurseurs de mesure
    1. Dissoudre une petite quantité (par exemple, 25 mg) du peptide cyclique orthogonalement déprotégé dans un petit volume de DMF (par exemple 2 mL). Ajouter 2 éq. du précurseur de guanidinylation et 2 éq. de DIPEA à la solution et laisser sous agitation pendant 2 h à TA.
    2. Surveiller les progrès de la réaction par HPLC-MS. Après achèvement de la réaction, éliminer le solvant, re-dissoudre le peptide cyclique guanidinylated dans de l' acétonitrile, et d' effectuer une purification par HPLC semi - préparative 16.
  2. L' élimination des groupes protecteurs de chaîne latérale labile acide
    1. Préparer 2 ml d'une solution contenant de l'acide trifluoroacétique (TFA), d'eau et de triisopropylsilane (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Ajouter cette solution au produit purifié dans un petit flacon en verre et laisser agiter à la température ambiante pendant au moins 1 h. Observez la déprotection avec ESI-MS 17.
    2. On évapore le solvant sous pression réduite à un faible volume. Préparer l'éther refroidi à la glace et ajouter 10 ml dans un tube à centrifugation de 50 ml. Précipiter le peptide déprotégé dans de l'éther refroidi à la glace en utilisant une pipette Pasteur en l'ajoutantgoutte à goutte. Centrifuger la suspension (5000 xg, 5 min) pour obtenir un culot.
    3. Laver le précipité avec de l'éther glacé et centrifugation, (5000 xg, 5 min, 2 x). Dissoudre le produit dans 2 ml d'eau de qualité HPLC et purifier par HPLC semi - préparative 16.

4. Les données d'analyse et les paramètres de purification

  1. Analyse HPLC-ESI-MS
    1. Effectuer HPLC-ESI-MS analytique avec un spectromètre de masse LCQ en utilisant une colonne C18 (12-nm taille des pores, la taille des particules de 3 um, 125 mm x 2,1 mm) ou une colonne C8 (20 nm de taille de pores, de particules de 5 um taille 250 mm x 2,1 mm), avec H 2 O (0,1% v / v d' acide formique) / acétonitrile (0,1% v / v d' acide formique) comme éluants.
  2. HPLC semi-préparative
    1. Effectuer une HPLC semi-preparative en utilisant un instrument de HPLC preparative avec une colonne ODS-A (20 x 250 mm, 5 um), un débit de 8 ml / min, et des gradients linéairesde H 2 O (0,1% v / v de TFA) et de l' acétonitrile (0,1% v / v de TFA).

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Representative Results

Le précurseur de peptide cyclique a été synthétisé comme un peptide linéaire, cyclisé, et orthogonalement Dde-déprotégé. Après la précipitation, on a analysé la pureté du composé par HPLC-MS (Figure 1). Pour surveiller la progression de la réaction, une analyse par HPLC a été réalisée après que le temps de réaction de 2 h (figure 2).

Pour les résidus plus importants sur le groupe guanidino, le temps de réaction de 2 h est souvent pas suffisant. Dans ce cas, la réaction a été poursuivie et contrôlée avec LC-MS. Après la réaction et la déprotection finale, les composés ont été purifiés en utilisant l'équipement de HPLC semi-préparative (rendement typiquement dans la plage de basse mg). Les composés finaux ont été analysés par HPLC-MS pour évaluer la pureté (voir figure 3).

Une petite quantité a été pesé dans un tube de microcentrifugation et on dilue avec du DMSO pour obtenir une solution de la tige pour l'évaluation biologique du composé dans un test de type ELISA, la liaison en phase solide. Les résultats sont représentés sur la figure 4. La molécule de référence Cilengitide (groupe guanidine non modifié) est inclus comme référence. Tous les composés possèdent une forte affinité relative pour le sous-type de l'intégrine avß3 et une sélectivité élevée contre α5β1.

Figure 1
Figure 1: spectre HPLC-MS (gradient: 10-90% d' acétonitrile (ACN) dans un système solvant biphasique , avec H 2 O et ACN) du dérivé orthogonalement Dde-déprotégé c (OrnGD (Ot Bu) f (N Me) V ) (masse calculée: 602,34 g / mol), tel qu'il est obtenu après la cyclisation du peptide linéaire, Dde-déprotection subséquente, et la précipitation.ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Spectre HPLC-MS (gradient: 10-90% d' ACN dans un système solvant biphasique , avec H 2 O et ACN) du mélange de réaction après la réaction de guanidinylation du peptide cyclique orthogonalement déprotégé et le précurseur méthylé pour guanidinylation. Outre le pic de produit (R t = 7,50 min, masse calculée = 858,49 g / mol), seul l'excès de précurseur de guanidinylation (R t = 6,38 min) et de la DIPEA de base (R t = 0,90 min) peut être observée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: HPLC-MS spectre (gradient: 10-90% d' ACN dans un système solvant biphasique , avec H 2 O et ACN) du composé brut 2 (R t = 3,69 min, masse calculée = 603,32 g / mol) , après la déprotection des chaînes latérales labiles en milieu acide avant la purification semi-préparative. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Fonctionnalisation de guanidines en solution et à l' évaluation biologique. Composé 1, avec un groupe guanidino non modifiée, est cilengitide. Les modifications traitées dans ce manuscrit sont la méthylés (2), fonctionnalisée (ici, acétyle amino hexane, 3), et des dérivés acétylés (4). Til affinité de liaison a été déterminée dans un essai de liaison en phase solide en utilisant des protéines isolées 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le précurseur de guanidinylation est un dérivé de peptide cyclique orthogonalement déprotégé, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), qui est synthétisé par un protocole Fmoc standard de synthèse peptidique en phase solide (SPPS). L'ornithine est utilisé en tant que dérivé protégé orthogonalement, (-OH Fmoc-Orn (Dde)), qui peut être déprotégé avec de l'hydrazine dans du DMF après la cyclisation du squelette peptidique. Le précurseur de peptide est purifié par précipitation du composé et de la lyophilisation subséquente.

Alkylés précurseurs pour la guanidinylation peuvent être obtenus avec de bons rendements dans une réaction en une seule étape à partir de la substance disponible dans le commerce N, N '-di-Boc-1 H-pyrazole-1-carboxamidine par une réaction d'alkylation dans des conditions de Mitsunobu (PPh3 , DIAD, THF) 19, 10. Avec cette réaction, une grande variété de précurseurs est Accessibles à partir des alcools correspondants. La réaction de guanidinylation avec les précurseurs alkylés donne le produit défini dans une réaction de nettoyage. Si la conversion complète du réactif n'est pas observée après 2 h, la réaction doit être poursuivie. Dans les conditions indiquées dans le protocole, que des produits secondaires mineurs formés; cependant, des quantités plus élevées d'impuretés ne peuvent pas être exclues pour tous, en particulier protégés différemment, des substrats porteurs de groupements plus importants.

Si l'on utilise des peptides fonctionnalisés guanidine-(lieurs plus longs), le groupe protecteur sur l'amine Dde terminale du segment de liaison est enlevé et peut être conjugué par couplage d'amide à un acide correspondant. La déprotection du Dde est effectuée dans une solution de 2% d' hydrazine dans du DMF et on obtient le peptide déprotégé orthogonalement, qui doit être purifié (par exemple, HPLC semi - préparative) avant une nouvelle utilisation. Dans ce cas, une simple réaction d'acétylation a été réalisée in situ.

Sien utilisant guanidines acétylés, une stratégie de précurseur différent doit être appliqué. A partir de S -methylisothiourea, une séquence de réaction en deux étapes est nécessaire 20. D' abord, un mono protection Boc de S -methylisothiourea doit être effectuée 21 avant acétylation avec un acide de choix (ici, acide acétique). La réaction de guanidinylation est une réaction très rapide et propre, le composé final est obtenu après la déprotection finale de la chaîne latérale de l'acide labile groupes protecteurs.

Comme nous l'avons indiqué dans l'introduction, cette méthode permet la modification et fonctionnalisation de tout groupe guanidique peptidique. Nous avons démontré cette technique sur des ligands de l'intégrine, qui permettent, dans ce cas, le réglage de la sélectivité du sous-type des ligands. L'antagoniste de l'intégrine non modifiée Cilengitide est biselective pour les sous-types avß3 / α5β1. Grâce à la méthylation de la borne N ω dele groupe de guanidine, un ligand de avß3 sélectif est donné. Cela bloque une importante interaction final sur qui est observée uniquement dans α5β1, inactivant ainsi le ligand pour cette intégrine. La principale interaction avec le site de liaison du sous - type de avß3 est une fin de l'interaction qui ne soit pas perturbé par cette interaction 10.

En modifiant le ligand avec des unités de liaison plus longues ( « fonctionnalisation »), deux objectifs peuvent être atteints en une seule fois: la sélectivité est générée par rupture de la fin de l'interaction avec le sous-type α5β1 et, de l'autre côté, les points de liaison de la poche de liaison, permettant la conjugaison à de grandes entités (par exemple, des chélateurs ou des colorants fluorescents pour des techniques d'imagerie 10).

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

TGK reconnaît la Graduate School international pour la science et du génie (IGGSE) de la Technische Universität München pour leur soutien financier. HK reconnaît le Centre pour la science des protéines intégrées Munich (CIPSM) pour leur soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

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References

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Biochemistry numéro 122 la guanidine l'arginine un peptide la modification la guanidinylation l'alkylation de Mitsunobu
Modification et fonctionnalisation du groupe Guanidine par Précurseurs sur mesure
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Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

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