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Biochemistry

Modifikation und Funktionalisierung der Guanidingruppe von Maßgeschneidert Precursors

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

Ein Protokoll für die Synthese von alkylmodifizierte Guanidine, basierend auf der Verwendung der entsprechenden Vorstufen dargestellt.

Abstract

Die Guanidingruppe ist eine der wichtigsten pharmakophorer Gruppen in der medizinischen Chemie. Die einzige Aminosäure, die eine Guanidingruppe tragende ist Arginin. In diesem Artikel ist eine einfache Methode zur Modifikation der Guanidingruppe in peptidische Liganden zur Verfügung gestellt, mit einem Beispiel für RGD-bindende Integrin-Liganden. Es wurde vor kurzem gezeigt , dass die unterschiedliche Modifikation der Guanidingruppe in diesen Liganden für die selektive Modulation des Subtyps ermöglicht (beispielsweise zwischen den Subtypen & agr; v und α5). Darüber hinaus wurde eine bisher unbekannte Strategie für die Funktionalisierung über die Guanidingruppe demonstriert und der Syntheseansatz wird in diesem Dokument überprüft. Die Modifikationen betreffen hier beschriebenen endständig (N ω) alkyliert und Guanidin - Gruppen acetyliert. Für die Synthese, maßgeschneiderte Vorläufermoleküle synthetisieren, die dann zu einer Reaktion mit einem orthogonal ungeschützten Amin unterzogen werden, um die pre zu übertragen-modifizierte Guanidingruppe. Für die Synthese von alkylierten Guanidinen, basierten auf Vorläufer N, N '-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin wird verwendet acylierten Verbindungen zu synthetisieren, die Vorläufer der Wahl ein entsprechend acylierten Derivates von N - Boc - S ist - methylisothioharnstoff, die in ein- und zweistufigen Reaktionen erhalten werden können.

Introduction

Zu den am häufigsten vorkommenden pharmakophorer Gruppen in natürlichen Liganden ist die Guanidingruppe, die in mehreren Interaktionen beteiligt ist 1, 2. Beispielsweise dient er als ein potenzieller vierfachen Wasserstoff-Donator in Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen und wird in der elektrostatischen Wechselwirkungen, wie Salzbrücken oder Kationen-π-Wechselwirkungen beteiligt. In der medizinischen Chemie ist diese Gruppe oft mit Drogen und Medikamenten - Kandidaten 4, gefunden , obwohl sehr oft als Guanidin - Mimetika 5, 6. Der Grund für die Entwicklung von Guanidin-Mimetika ist die Entfernung von der allgegenwärtigen, positiv geladenen Guanidingruppe, sowie die Einstellung der Lipophilie des Liganden. In peptidische Liganden, ist der einzige Guanidingruppe haltige Aminosäure Arginin, die in der bioaktive Region peptidische Liganden gefunden wird daher häufig.

Ein sehr prominent Beispiel für eine argininhaltigen Ligandenfamilie ist die Unterfamilie der RGD-bindend Integrinen. Im Allgemeinen sind die Integrine eine Klasse von Zelladhäsionsrezeptoren, die in allen höheren Organismen über wichtige Funktionen übernehmen. Einige dieser Funktionen beinhalten die Zelladhäsion, Migration und das Überleben der Zelle. So werden sie auch in pathologischen Indikationen, wie Krebs und Fibrose beteiligt. Integrine sind heterodimere Transmembran-Proteine, die aus einer α- und einer β-Untereinheit, die 24 derzeit bekannten Integrin-Subtypen bilden; 8 von ihnen die Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp (RGD =) in ihren Liganden 7 erkennen. Die Bindungsregion an der Grenzfläche zwischen diesen beiden Subtypen in dem extrazellulären Teil befindet, die sogenannte Integrin - Kopfgruppe 8. die metallionenabhängige Adhäsionsseite (MIDAS) Region, die in der Beta-Untereinheit befindet und bindet die Carbonsäure in den Liganden (Seiten cha: RGD wird durch zwei gemeinsame Wechselwirkungen anerkanntin der Asp); und die Guanidingruppe in den Liganden, die in der alpha-Untereinheit befindet. Die meisten der Integrin - Untertypen sind promiskuitiv und zumindest einen Teil ihrer natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) -Liganden 9 teilen. So ist für die Entwicklung von künstlichen Integrin-Liganden, der Schwerpunkt ist neben einer hohen Bindungsaffinität, die Selektivität Subtyp. Vor kurzem konnten wir ein Schlüsselelement für die Erzeugung von Subtyp selektiven Liganden enthüllen: die Guanidingruppe. Durch unterschiedliche Modifikationen können biselective Liganden für die αv- und α5-enthaltende Integrin - Subtypen in selektive Verbindungen , die durch einfache Modifikationen an der Guanidingruppe gedreht werden, der dann die verschiedene α-Untereinheiten 10 unterscheiden kann.

In der Tasche der & alpha; v interagiert die Guanidingruppe side-on über einen zweizähnigen Salzbrücke mit Asp218 11, 12. Diese Wechselwirkung cein auch in α5β1 beobachtet werden (hier mit Asp227 in α5), sondern zusätzlich ein End-Wechselwirkung der Guanidingruppe mit einem Gln - Rest (Gln221) wird 13 beobachtet. Somit modifizierten wir die Guanidingruppe in zwei entgegengesetzter Weise: in einem Fall durch die Seite-an blockierenden Zusammenwirken mit der Methylierung des N δ der Guanidingruppe, und im anderen Fall mit der Methylierung des Guanidin - N ω, Blockierung der End-on - Interaktion. Überraschenderweise führte diese kleine Änderung zu einer vollständigen Selektivität Verschiebung der Liganden. Neben der Alkylierung wurde eine neue Methode Funktionalisierung in dieser Publikation vorgestellt. Die klassische Funktionalisierung Verfahren für diese Art von pentapeptidic Ligand ist durch die Seitenketten - Konjugation einer Aminosäure nicht in 14 - Bindung (zB K in c (RGDfK)) beteiligt sind , 15. Hier,wir zeigen, dass die Funktionalisierung durch Modifizierung des Guanidin auch möglich ist - mit einem Acyl- oder alkylierte Linker - die für die Bindung von entscheidender Bedeutung ist. Die positive Ladung , die essentiell für die Bindung ist , beibehalten wird , und Modelle legen nahe , dass die langkettigen Punkte aus der Bindungstasche und somit eine ideale Möglichkeit für die Befestigung von weiteren Linkern Bereitstellung und Markierungseinheiten (zB einer Fluoreszenzmarkierung oder ein Chelator für molekulare imaging).

In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf den Herstellungsschritten für die Modifikation der Guanidingruppe in Arginin-enthaltenden Liganden. Dies beinhaltet die Synthese von N ω -methylated Spezies sowie Guanidine mit längeren Linker - Einheiten. Die verschiedenen Modifikationen umfassen Acyl- und Alkylgruppen.

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Protocol

Hinweis: Alle Reagenzien und Lösungsmittel wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet.

Achtung: Bitte lesen Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Schutzausrüstungen , wenn chemische Synthesen durchführen (zB Dunstabzugshaube, Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

1. Synthese des Precursors Guanidinylierung

  1. alkylierte Spezies
    1. methylierten Spezies
      1. Man löst 1,0 g N, N '-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1 eq.) Und 1,0 g Triphenylphosphin (PPh 3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 10 ml trockenen Tetrahydrofuran (THF) in einer 50-ml-Rundkolben in einer inerten Atmosphäre ein Gummiseptum bei Raumtemperatur (RT) gemessen. Hinzufügen 194 & mgr; l trockenem Methanol unter Verwendung einer Spritze (4,8 mmol, 1,5 eq.) Und Let es bei RT rühren.
      2. Getrennt davon wurde eine Lösung mit 747 & mgr; l von Diisopropylazodicarboxylat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml trockenem THF in einem kleinen Glasfläschchen vorzubereiten. Unter Rühren wurde die Lösung von DIAD in THF tropfenweise zu der Lösung von N, N '-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin, PPh 3 und Methanol , um eine Spritze (über 15 min) verwendet. Lassen Sie die Lösung unter Rühren für 2 h bei RT.
      3. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt in 1 ml Dichlormethan (DCM) aufzulösen. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Silica in 10% Ethylacetat (EtOAc) in einer Pentanlösung. Legen des gelösten Rohproduktes an der Säule und fügen Sie das Lösungsmittel unter Druck (1,5 bar).
      4. Sammeln der Fraktionen (Lösungsmittelsystem: isokratisch 10% EtOAc in Pentan), um die gewünschte Verbindung identifizieren Fleck durch Dünnschichtchromatographie (TLC), und es sammeln (R f = 0,4, EtOAc / Pentan 1: 9, UV). Kombinieren, um das gewünschteFraktionen und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft am Rotationsverdampfer 0,85 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (2,6 mmol, 81% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung ergab bei RT für die weitere Verwendung.
    2. Hexylamin modifizierte Spezies
      1. Man löst 1,0 g N, N '-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1,0 Äq.), 0,9 g von Dde-6-Aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.) Und 1,0 g von PPh 3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) in 10 ml trockenen THF in einer 50-ml - Rundkolben in Inertatmosphäre ein Gummiseptum bei RT verwendet wird .
      2. Getrennt davon wurde eine Lösung mit 747 & mgr; l von DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml trockenem THF in einem kleinen Glasfläschchen vorzubereiten. Unter Rühren wird die Lösung von DIAD in THF tropfenweise zu der Lösung von N, N '-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin, PPh 3 und Dde-6-Aminohexanol einer Spritze (über 15 min) unter Verwendung von . Lassen Sie die Lösung unter Rühren für 2 h bei RT.
      3. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer und nehmen die nach oben Rohprodukt in 1 ml DCM. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Siliciumdioxid in einer Lösung von Pentan / EtOAc (2: 1). Übernehmen des gelösten Rohproduktes an der Säule und fügen Lösungsmittel unter Druck (1,5 bar).
      4. Sammeln der Fraktionen (Lösungsmittelsystem: isokratische 2: 1 Pentan / EtOAc), um die gewünschten Fraktionen identifizieren mit TLC, und sammeln sie (R f = 0,66, 2: 1 Pentan / EtOAc, UV). Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 1,6 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (2,8 mmol, 88% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung ergab bei RT für die weitere Verwendung.
  2. Acylierte Spezies (2 Reaktionsschritte)
    1. Man löst 1,4 g S -methylisothiuronium Hemisulfat (10 mmol, 1,0 eq.) Und 2,2 g Di (tert - butyl) dicarbonat (10 mmol, 1,0 eq.) In einem kräftig rührenzweiphasige Lösung von DCM / sat läuten. aq. NaHCO 3 und lassen Sie es für 24 h bei RT rühren.
    2. Man trennt die Schichten im Scheidetrichter und extrahiert die wässrige Phase dreimal mit DCM. Vereinige die organischen Phasen, trockne sie mit Na 2 SO 4 und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Nehmen Sie das Rohprodukt bis in 1 ml Hexan.
    3. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Siliciumdioxid in einer Lösung von 4: 1 Hexan / EtOAc. Legen des gelösten Rohproduktes an der Säule. In Lösungsmitteln unter Druck. Identifizieren der gewünschten Fraktionen mit DC (Lösungsmittelsystem: 4: 1 isokratischen Hexan / EtOAc (UV - Detektion: 254 nm), und sammeln sie (R f = 0,30).
    4. Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 1,1 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (5,8 mmol, 58% Ausbeute) zu erhalten. Speichert das Reagenz, N - (tert - Butoxycarbonyl) - S -Methylisothiourea bei RT für die weitere Verwendung.
    5. Man löst 250 mg N - (tert - Butoxycarbonyl) - S - methylisothioharnstoff (1,3 mmol, 1,0 eq.) In 10 ml trockenen N, N - Dimethylformamid (DMF) in einer 50-ml - Rundkolben in einer inerten Atmosphäre bei RT. Hinzufügen 440 & mgr; l N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA) (2,6 mmol, 2 Äqu.) Unter Verwendung einer Spritze. Unter Rühren wurde 245 & mgr; l von Ac 2 O (5,2 mmol, 4,0 Äq.) Tropfenweise mit einer Spritze und läßt sie für 1 h bei RT rühren.
    6. Hinzufügen eines Überschusses an Methanol (2 ml) zu der Mischung unter Verwendung einer Spritze und ließ es für 15 min bei RT rühren. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Nehmen Sie das Rohprodukt bis in 1 ml DCM.
    7. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 60 g Siliciumdioxid in einer Lösung von 3: 1 Hexan / EtOAc 3: 1. Wenden Sie das gelöste Rohprodukt auf die Säule. Hinzufügen Lösungsmittel (3: 1 Hexan / EtOAc) und Druck (1,5 bar). Identifizieren der gewünschten Fraktionen mit DC (3: 1 Hexan / EtOAc, UV: 220 nm), und colLect sie (R f = 0,62).
    8. Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 210 mg der Titelverbindung als weißer Feststoff (0,9 mmol, 70% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung bei RT für die weitere Verwendung.

2. Synthese von zyklischen Peptids Precursors

  1. Laden und TCP - Harz Capping
    1. 1.00 g 2-chlortriyl Chlorid (CTC) Harz (0,9 mmol / g) und 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 Äq.) In eine 20 ml-Kunststoffspritze mit einer Fritte. Es wird eine Lösung von 313 & mgr; l DIPEA (2 Äqu.) In 5 ml trockenem DCM und füge sie die Spritze. Lassen Sie es für 1 h bei RT drehen, um eine Dreheinheit.
    2. Indessen bereitet eine 2-ml-Lösung von 5: 1 Methanol / DIPEA (v / v; Capping-Lösung). Fügen Sie die Capping-Lösung mit der Spritze und lassen Sie es für weitere 15 min drehen. Waschen des Harzes mit DCM (5 ×) und DMF (3x).
  2. On-Harz Fmoc - Entschützung
    1. Behandle den harzgebundene Fmoc-Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x).
  3. On-Harz Kopplung von Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Hinzufügen 934 mg Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 eq.), 684 mg 1- [Bis (dimethylamino) methylen] -1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] Pyridinium-3-oxid-hexafluorphosphat (HATU) (2 Äq.) und 245 mg 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 Äq.) in ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF. In 814 ul DIPEA.
    2. Fügen Sie diese Lösung auf den Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundenen Gly und lassen Sie es für 1 h drehen. Waschen des Harzes mit DMF (3x).
  4. On-Harz Fmoc - Entschützung
    1. Behandle den harzgebundene Fmoc-Orn (Dde) -Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x).
  5. On-Harz Kopplung von Fmoc-Val-OH
    1. Hinzufügen 610 mg Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF. In 814 ul DIPEA.
    2. Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen, und harzgebundene Orn (Dde) -Gly und ließ sie für 1 h rotieren.
  6. On-Harz Fmoc - Entschützung
    1. Behandle den harzgebundene Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x).
  7. On-Harz N- Methylierungs
    1. Waschen des Harzes mit DCM (3x). Man löst 887 mg 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (o -NBS-Cl, 4 eq.) In DCM und fügen Sie 1,2 ml 2,4,6-Collidin (10 eq.).
    2. Fügen Sie die Lösung für das harzgebundene Peptid und lassen Sie es 20 Minuten lang bei RT inkubiert.
    3. Das Harz wird mit CH 2 Cl 2 (3x) und mit THF (5 ×). Es wird eine Lösung mit 1,18 g PPh 3 (5 Äq.) Und 365 & mgr; l Methanol in THF. Diese Lösung wird auf dieSpritze.
    4. Es wird eine Lösung mit 883 & mgr; l von DIAD in 2 ml THF und fügen sie die Spritze. Lassen Sie es für 15 min inkubiert. Das Harz wird mit THF (5x) und mit DMF (5 x).
  8. o -ns Entschützung
    1. Es wird eine Lösung mit 570 & mgr; l Mercaptoethanol (10,0 Äq.) Und 672 & mgr; l Diazabicycloundecen (DBU) in 2 ml DMF. Fügen Sie diese Lösung in die Spritze und lassen Sie es für 5 min inkubiert.
    2. Wiederholen Sie die Entschützungsschritt und dann Waschen des Harzes mit DMF (5 x).
  9. On-Harz Kopplung von Fmoc - D-Phe-OH
    1. Hinzufügen 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF . In 814 ul DIPEA.
    2. Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundene Peptid und ließ sie für 1 h rotieren.
  10. On-Harz Fmoc - Entschützung
    1. Behandle das Harz-bound Peptid mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x).
  11. On-Harz Kopplung von Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH
    1. Hinzufügen von 741 mg Fmoc - Asp (Ot Bu) -OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 mL DMF. In 814 ul DIPEA.
    2. Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundene Peptid und ließ sie für 1 h rotieren.
  12. Die Abspaltung des linearen Peptids von dem Harz
    1. Waschen des Harzes mit DCM (3x) und anschließend Herstellung von 10 ml einer Lösung von Hexafluorisopropanol (HFIP) in DCM (1: 4; v / v).
    2. Fügen Sie die Lösung zu dem Harz und lassen Sie es für 15 min drehen. Sammeln Sie die Lösung in einem Rundkolben. Wiederholen der Spalt- und verdampfe das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer.
  13. Cyclisierung des linearen Peptids
    1. dissolve 384 mg NaHCO 3 (5,0 Äq.) und 582 & mgr; l von Diphenylphosphorylazid (DPPA) (3,0 eq.) in 50 ml DMF und fügen Sie das Rohprodukt. Ließ es über Nacht rühren oder bis sich kein lineares Peptid mit ESI-MS (10 h) 17 beobachtet.
    2. Unter vermindertem Druck, reduzieren das Lösungsmittel zu einem kleinen Volumen mit einem Rotationsverdampfer. Bereiten eine gesättigte wässrige Lösung von NaCl (Salzlösung). Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette, fügen Sie das cyclisierte Peptid tropfenweise zu 40 ml einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen.
    3. Zentrifugierte die Suspension (5.000 xg, 5 min) und wäscht den Niederschlag mit HPLC-Wasser (2x). Lyophilisieren das Produkt.

3. Guanidinylierung und Entschützung in Lösung

  1. Guanidinylierung mit den maßgeschneiderten Vorläufern
    1. Man löst eine kleine Menge (beispielsweise 25 mg) des orthogonal entschützt zyklischen Peptid in einem kleinen Volumen DMF (zB 2 mL). In 2 eq. des Guanidinylierung Vorläufers und 2 eq. DIPEA zu der Lösung und lassen Sie es für 2 h bei RT rühren.
    2. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion mit HPLC-MS. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen das Lösungsmittel, wieder aufzulösen das guanidinylated zyklische Peptid in Acetonitril und semipräparative HPLC - Reinigung 16 durchzuführen.
  2. Die Entfernung der säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen
    1. Bereiten 2 ml einer Lösung, die Trifluoressigsäure (TFA), Wasser und Triisopropylsilan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Fügen Sie diese Lösung für das gereinigte Produkt in einem kleinen Glasfläschchen und lassen Sie es für mindestens 1 h bei RT rühren. Beachten Sie die vollständige Entfernung der Schutzgruppe mit ESI-MS 17.
    2. Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen. Bereiten eiskaltem Ether und gibt 10 ml in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Auszufällen, das entschützte Peptid in eiskaltem Ether mit einer Pasteurpipette durch Zugabe vontropft. Zentrifugierte die Suspension (5.000 xg, 5 min) um ein Pellet zu erhalten.
    3. Wäscht den Niederschlag mit eiskaltem Ether und zentrifugiert es (5000 xg, 5 min, 2 x). Man löst das Produkt in 2 ml HPLC-Wasser reinigen und es mit semipräparative HPLC 16.

4. Analytische Daten und Parameter für die Reinigung

  1. Analytische HPLC-ESI-MS
    1. Führen analytischen HPLC-ESI-MS mit einem LCQ-Massenspektrometers unter Verwendung einer C18-Säule (12 nm Porengröße, 3 & mgr; m Teilchengrße, 125 mm × 2,1 mm), oder eine C8-Säule (20 nm Porengröße, 5 um Partikel Größe, 250 mm × 2,1 mm), mit H 2 O (0,1% v / v Ameisensäure) / Acetonitril (0,1% v / v Ameisensäure) als Eluenten.
  2. Semi-präparative HPLC
    1. Führen semipräparative HPLC ein präparativen HPLC-Instrument mit einer ODS-A-Säule (20 x 250 mm, 5 & mgr; m), eine Fließgeschwindigkeit von 8 ml / min, und den linearen VerläufenH 2 O (0,1% v / v TFA) und Acetonitril (0,1% v / v TFA).

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Representative Results

Der cyclische Peptidvorläufer wurde als ein lineares Peptid synthetisiert, cyclisiert und orthogonal Dde-Schutzgruppe entfernt. Nach der Fällung wurde die Reinheit der Verbindung mit HPLC-MS (Figur 1) analysiert. Um den Fortschritt der Reaktion zu überwachen, wurde eine HPLC - Analyse durchgeführt , nachdem die 2-h Reaktionszeit (Abbildung 2).

Für größere Rückstände auf der Guanidingruppe, ist die Reaktionszeit von 2 h oft nicht ausreichend. In diesem Fall wurde die Reaktion fortgesetzt und mit LC-MS überwacht. Verwendung semipräparative HPLC-Ausrüstung (Ausbeuten typischerweise im Nieder mg-Bereich) nach der Reaktion und abschließende Abspaltung der Schutzgruppe wurden die Verbindungen gereinigt. Die Endverbindungen wurden mit HPLC-MS analysiert , um die Reinheit zu bewerten (siehe Abbildung 3).

Eine kleine Menge wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen gewogen und verdünnt mit DMSO eine Stammlösung für die biologische Bewertung der Verbindung in einem ELISA-like, Festphasen-Bindungstest zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Standardmolekül Cilengitide (unmodifiziert Guanidingruppe) wird als Referenz enthalten. Alle Verbindungen besitzen eine relativ hohe Affinität für das Integrin-Subtyps avb3 und eine hohe Selektivität gegenüber α5β1.

Abbildung 1
Abbildung 1: HPLC-MS - Spektrum (Gradient: 10-90% Acetonitril (ACN) in einem zweiphasigen Lösungsmittelsystem , mit H 2 O und ACN) des orthogonal Dde-Derivat entschützt c (OrnGD (Ot Bu) f (N Me) V ) (berechnete Masse: 602,34 g / mol), wie sie erhielten Dde-Schutzgruppenabspaltung nach der Cyclisierung des linearen Peptids, nachfolgende und Präzipitation.ank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: HPLC-MS - Spektrum (Gradient: 10-90% ACN in einem zweiphasigen Lösungsmittelsystem , mit H 2 O und ACN) der Reaktionsmischung nach der Reaktion des Guanidinylierung orthogonal entschützt zyklischen Peptid und der methylierten Vorläufer für Guanidinylierung. Neben dem Produktpeak (R t = 7,50 min, berechnete Masse = 858,49 g / mol), werden nur der Überschuss an Guanidinylierung Vorläufer (R t = 6,38 min) und die Basis DIPEA (R t = 0,90 min) beobachtet werden kann. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: HPLC-MS - Spektrum (Gradient: 10-90% ACN in einem zweiphasigen Lösungsmittelsystem , mit H 2 O und ACN) des rohe Verbindung 2 (R t = 3,69 min, berechnete Masse = 603,32 g / mol) nach der Entfernung der Schutzgruppen der säurelabilen Seitenketten vor der semipräparative Reinigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Funktionalisierung von Guanidinen in Lösung und biologische Bewertung. Verbindung 1, mit einer unveränderten Guanidingruppe ist Cilengitide. Die Modifikationen in diesem Manuskript adressiert sind die methylierten (2), funktionalisiert (hier acetyl amino Hexan; 3) Derivate und acetyliert (4). Ter - Bindungsaffinität wurde in einem Festphasen - Bindungstest unter Verwendung von isolierten Proteinen 18 bestimmt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Der Vorläufer für Guanidinylierung ist ein orthogonal entschützt zyklische Peptid - Derivat, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), die durch ein Standard - Fmoc - Protokoll von Festphasen - Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert wird. Ornithin wurde als orthogonal geschützten Derivat (Fmoc-Orn (Dde) -OH) verwendet, die mit Hydrazin in DMF nach der Cyclisierung des Peptidgerüstes entschützt werden können. Der Peptid-Vorläufer wird durch die Fällung der Verbindung und durch die anschließende Gefriertrocknung gereinigt.

Alkylierte Vorläufer für die Guanidinylierung können -Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin durch eine Alkylierung 'aus der im Handel erhältlichen Substanz N, N in guten Ausbeuten in einer einstufigen Reaktion erhalten werden Reaktion unter Mitsunobu - Bedingungen (PPh 3 Ausgang , DIAD, THF) 19, 10. Mit dieser Reaktion ist eine sehr große Vielzahl von Vorläufern Zubessible aus den entsprechenden Alkoholen. Die Guanidinylierung Reaktion mit den alkylierten Vorstufen ergibt das definierte Produkt in einer sauberen Reaktion. Wenn eine vollständige Umsetzung des Reaktanden nicht nach 2 Stunden beobachtet wird, sollte die Reaktion fortgesetzt werden. Unter den Bedingungen in dem Protokoll gegeben, nur geringe Nebenprodukte gebildet; jedoch höhere Mengen an Verunreinigungen können nicht für alle ausgeschlossen werden, insbesondere unterschiedlich geschützte Substrate größere Einheiten tragen.

Bei Verwendung von Guanidin-funktionalisierte Peptide (längere Linker), auf dem terminalen Amin des Linkers die Dde-Schutzgruppe wird entfernt und kann durch Amidkupplung mit einer entsprechenden Säure konjugiert werden. Die Entfernung der Schutzgruppe von Dde wird in einer Lösung von 2% Hydrazin in DMF und ergibt die orthogonal entschützt Peptid durchgeführt, die (beispielsweise semipräparative HPLC) gereinigt werden sollte , vor der weiteren Verwendung. In diesem Fall wurde eine einfache Acetylierungsreaktion in situ durchgeführt.

Obmit acetylierten Guanidine, sollte eine andere Vorläuferstrategie angewendet werden. Ausgehend von S - Methylisothiourea, eine zweistufiger Reaktionsfolge 20 erforderlich. Zunächst muss ein Mono Boc Schutz von S - Methylisothiourea 21 vor der Acetylierung mit einer Säure der Wahl (hier Essigsäure) durchgeführt werden. Die Guanidinylierung Reaktion ist eine sehr saubere und schnelle Reaktion, die endgültige Verbindung wird nach der letzten Entschützung von säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen erhalten.

Wie bereits in der Einleitung erwähnt, ermöglicht dieses Verfahren zur Modifizierung und Funktionalisierung von jeder Peptid- Guanidingruppe. Wir haben gezeigt, diese Technik auf Integrin-Liganden, die in diesem Fall tuning des Subtyps Selektivität der Liganden ermöglichen. Das unmodifizierte Integrin-Antagonist ist Cilengitide biselective für die avb3 / α5β1-Subtypen. Durch die Methylierung des terminalen N ω vondie Guanidin-Gruppe, eine avb3 selektiven Liganden ergab. Dies blockiert eine wichtige End-on-Interaktion, die einzigartig in α5β1 beobachtet wird, so dass die Liganden für dieses Integrin inaktivierende. Der Haupt Wechselwirkung mit der Bindungsstelle des avb3 Subtyp ist ein End-Interaktion , die nicht durch diese Wechselwirkung 10 gestört wird.

Durch Modifizieren des Liganden mit längeren Linker-Einheiten ( „Funktionalisierung“), zwei Ziele können in einem Durchgang zu erreichen: Selektivität durch Brechen der End-on-Interaktion mit dem α5β1 Subtyp erzeugt wird, und, auf der anderen Seite, der Linker zeigt aus dem Bindungstasche, so dass für die Konjugation an großen Einheiten (zB Chelatoren oder Fluoreszenzfarbstoffe zur bildgebenden Verfahren) 10.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

TGK erkennt die International Graduate School for Science and Engineering (IGGSE) der Technischen Universität München für ihre finanzielle Unterstützung. HK erkennt das Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) für ihre Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

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References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

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Biochemistry Ausgabe 122 Guanidin Arginin Peptid Modifikation Guanidinylierung Alkylierung Mitsunobu
Modifikation und Funktionalisierung der Guanidingruppe von Maßgeschneidert Precursors
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Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

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