Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

संशोधन और Guanidine समूह के functionalization दर्जी निर्मित शगुन द्वारा

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

एल्काइल संशोधित इसी पूर्ववर्ती के उपयोग पर आधारित guanidines के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है।

Abstract

guanidine समूह औषधीय रसायन विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण pharmacophoric समूहों में से एक है। केवल अमीनो एक guanidine समूह को ले जाने एसिड arginine है। इस लेख में, peptidic लाइगैंडों में guanidine समूह के संशोधन के लिए एक आसान विधि RGD बाध्यकारी इंटीग्रिन लाइगैंडों के एक उदाहरण के साथ प्रदान की जाती है,। यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि इन लाइगैंडों में guanidine समूह के विशिष्ट संशोधन (उपप्रकार αv और α5 के बीच, जैसे) उप-प्रकार के चुनिंदा मॉडुलन के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, guanidine समूह के माध्यम से functionalization के लिए एक पूर्व अज्ञात रणनीति का प्रदर्शन किया गया था, और सिंथेटिक दृष्टिकोण इस दस्तावेज़ में समीक्षा की जाती है। संशोधनों यहाँ वर्णित टर्मिनली (एन ω) अल्किलेटेड और acetylated guanidine समूहों शामिल है। संश्लेषण के लिए, दर्जी निर्मित अग्रदूत अणुओं संश्लेषित कर रहे हैं, तो पूर्व स्थानान्तरित करने के orthogonally deprotected अमाइन के साथ एक प्रतिक्रिया के लिए किया जाता है जो-modified guanidine समूह। अल्किलेटेड guanidines के संश्लेषण के लिए, पूर्ववर्ती एन के आधार पर, एन 'डि-Boc -1 एच -pyrazole-1-carboxamidine acylated यौगिकों, चुनाव एन -Boc- एस के एक तदनुसार acylated व्युत्पन्न होने का अग्रदूत के संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है - methylisothiourea है, जो एक और दो कदम प्रतिक्रियाओं में प्राप्त किया जा सकता।

Introduction

प्राकृतिक लाइगैंडों में सबसे प्रचुर मात्रा pharmacophoric समूहों में guanidine समूह, जो कई बातचीत 1, 2 में शामिल है। उदाहरण के लिए, यह हाइड्रोजन बांड बातचीत में एक संभावित चार गुना हाइड्रोजन दाता के रूप में कार्य करता है और इस तरह के नमक पुल या कटियन-π बातचीत के रूप में इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत, में शामिल है। औषधीय रसायन विज्ञान में इस समूह अक्सर दवाओं और दवा उम्मीदवारों 4 में, guanidine mimetics 5, 6 के रूप में पाया जाता है, हालांकि बहुत बार। guanidine mimetics के विकास के लिए कारण सर्वव्यापक, धनात्मक आवेश वाले guanidine समूह को हटाने के साथ-साथ ligand के lipophilicity के समायोजन है। peptidic लाइगैंडों में, केवल guanidine समूह युक्त एमिनो एसिड arginine है, जो इसलिए अक्सर peptidic लाइगैंडों के जैवसक्रिय क्षेत्र में पाया जाता है।

एक बहुत ही जनसंपर्कएक arginine युक्त ligand परिवार के लिए ominent उदाहरण RGD बाध्यकारी इंटेग्रिन की उपप्रजाति है। सामान्य तौर पर, इंटेग्रिन कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स है, जो सभी उच्च जीवों में महत्वपूर्ण कार्य अपने हाथ में लेने का एक वर्ग है। इन कार्यों में से कुछ कोशिका आसंजन, प्रवास, और सेल अस्तित्व शामिल है। इस प्रकार, वे भी इस तरह के कैंसर और फाइब्रोसिस जैसे रोग संकेत, में शामिल हैं। इंटेग्रिन ट्रांसमेम्ब्रेन heterodimeric एक α- और एक β-सबयूनिट कि फार्म 24 वर्तमान में जाना जाता इंटीग्रिन उपप्रकार से मिलकर प्रोटीन होते हैं; उनमें से 8 उनके लाइगैंडों 7 में त्रिपेपटाइड अनुक्रम Arg-Gly-Asp (= RGD) को पहचानते हैं। बाध्यकारी क्षेत्र बाह्य हिस्सा है, तथाकथित इंटीग्रिन सिर समूह 8 में इन दो उप-प्रकारों के बीच इंटरफेस में स्थित है। RGD दो आम बातचीत द्वारा मान्यता प्राप्त है: धातु आयन पर निर्भर आसंजन साइट (MIDAS) क्षेत्र है, जो बीटा सबयूनिट में स्थित है और जो लाइगैंडों में कार्बोक्जिलिक एसिड बांधता (पक्ष चाAsp की में); और लाइगैंडों में guanidine समूह है, जो अल्फा सबयूनिट में स्थित है। इंटीग्रिन उपप्रकार के अधिकांश अनेक हैं और उनके प्राकृतिक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ligands 9 के कम से कम एक हिस्सा हैं। इस प्रकार, कृत्रिम इंटीग्रिन लाइगैंडों के विकास के लिए, प्रमुख ध्यान, एक उच्च बंधन आत्मीयता, उप-प्रकार चयनात्मकता के अलावा है। guanidine समूह: हाल ही में, हम उप-प्रकार चयनात्मक लाइगैंडों के उत्पादन के लिए एक प्रमुख तत्व का अनावरण करने में सक्षम थे। विशिष्ट संशोधनों के माध्यम से, αv- और के लिए biselective लाइगैंडों α5 युक्त इंटीग्रिन उपप्रकार चयनात्मक यौगिकों में सरल संशोधनों द्वारा guanidine समूह है, जो तब विभिन्न α सब यूनिटों 10 भेदभाव कर सकते हैं पर दिया जा सकता है।

Αv की जेब में, guanidine समूह Asp218 11, 12 के साथ एक bidentate नमक पुल के माध्यम से पक्ष पर सूचना का आदान प्रदान। इस बातचीत गएक भी α5β1 में मनाया जा (यहाँ, α5 में Asp227 साथ), लेकिन इसके साथ ही, एक अंत पर एक Gln अवशेषों (Gln221) के साथ guanidine समूह की बातचीत 13 मनाया जाता है। इस प्रकार, हम दो विपरीत तरीकों से guanidine समूह संशोधित: एक मामले में, guanidine समूह के एन δ के मिथाइलेशन के साथ कंधे-ऑन बातचीत को अवरुद्ध करके, और अन्य मामले में, guanidine एन ω के मिथाइलेशन के साथ, अंत पर बातचीत अवरुद्ध। हैरानी की बात है, इस छोटे से संशोधन लाइगैंडों में एक पूरा चयनात्मकता पारी का नेतृत्व किया। alkylation के अलावा, एक नया functionalization विधि इस प्रकाशन में पेश किया गया था। Pentapeptidic ligand के इस प्रकार के लिए शास्त्रीय functionalization विधि बंधन में शामिल नहीं एक एमिनो एसिड के पक्ष-श्रृंखला विकार के माध्यम से है (जैसे, सी में कश्मीर (RGDfK)) 14, 15। यहाँ,हम बताते हैं कि functionalization भी guanidine संशोधित करके संभव है - जो बंधन के लिए महत्वपूर्ण है - एक एसाइल या अल्किलेटेड लिंकर साथ। सकारात्मक चार्ज कि बाध्यकारी के लिए आवश्यक है बनाए रखा है, और मॉडल है कि बाध्यकारी जेब से बाहर लंबी श्रृंखला अंक, इस प्रकार आगे linkers की कुर्की के लिए एक आदर्श संभावना प्रदान करने और लेबलिंग इकाइयों (सुझाव है जैसे, एक फ्लोरोसेंट लेबल या आणविक के लिए एक chelator इमेजिंग)।

इस काम में, हम arginine युक्त लाइगैंडों में guanidine समूह के संशोधन के लिए प्रारंभिक चरणों पर ध्यान केंद्रित। यह लंबे समय तक लिंकर इकाइयों के साथ एन ω -methylated प्रजातियों के संश्लेषण, साथ ही guanidines शामिल है। विभिन्न संशोधनों एसाइल और एल्काइल समूहों शामिल।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: सभी अभिकर्मकों और सॉल्वैंट्स वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया गया है और आगे शुद्धि के बिना इस्तेमाल किया गया।

सावधानी: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। जब रासायनिक संश्लेषण (जैसे, धूआं हुड, सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, और बंद पैर की अंगुली जूते) प्रदर्शन कर सभी उचित सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।

1. Guanidinylation शगुन के संश्लेषण

  1. अल्किलेटेड प्रजातियों
    1. मिथाइल प्रजातियों
      1. एन, एन 'की 1.0 ग्राम भंग डि-Boc -1 एच सूखा के 10 एमएल में -pyrazole-1-carboxamidine (3.2 mmol, 1 eq।) और triphenylphosphine की 1.0 ग्राम (पीपीएच 3, 3.8 mmol, 1.2 eq।) tetrahydrofuran (THF) एक अक्रिय वातावरण कमरे के तापमान (आर टी) पर एक रबर पट का उपयोग करने में एक 50 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में। शुष्क मेथनॉल 194 μL एक सिरिंज (4.8 mmol, 1.5 eq।) और एल का उपयोग कर जोड़ेंएट यह आरटी पर हलचल।
      2. अलग से, एक छोटे कांच की शीशी में शुष्क THF की 2 एमएल में diisopropyl azodicarboxylate के 747 μL (DIAD, 3.8 mmol, 1.2 eq।) के साथ एक समाधान तैयार करते हैं। सरगर्मी है, जबकि एक सिरिंज (15 से अधिक मिनट) का उपयोग करते हुए एन, एन 'डि-Boc -1 एच -pyrazole-1-carboxamidine, पीपीएच 3, और मेथनॉल के समाधान के लिए THF dropwise में DIAD का समाधान जोड़ें। आरटी पर 2 घंटे के लिए समाधान हलचल करते हैं।
      3. कम दबाव में विलायक एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर निकालें और dichloromethane के 1 एमएल (डीसीएम) में कच्चे तेल उत्पाद भंग। एक पैंटेन समाधान में 10% एथिल एसीटेट में सिलिका के 100 ग्राम (EtOAc) के साथ एक फ्लैश स्तंभ (2.5 सेमी x 20 सेमी) लोड करें। स्तंभ पर भंग कच्चे उत्पाद लोड और दबाव (1.5 बार) के अंतर्गत विलायक जोड़ें।
      4. अंशों इकट्ठा (विलायक प्रणाली: isocratic 10% पैंटेन में EtOAc), पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा वांछित यौगिक स्थान की पहचान, और इसे इकट्ठा (आर च = 0.4, EtOAc / पैंटेन 1: 9, यूवी)। कम्बाइन वांछितभिन्न और एक पीले रंग की, चिपचिपा तेल (2.6 mmol, 81% उपज) के रूप में शीर्षक परिसर के 0.85 छ प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक लुप्त हो। आगे उपयोग के लिए आर टी पर झुकेंगे यौगिक संग्रहित करें।
    2. Hexylamine संशोधित प्रजातियों
      1. एन के 1.0 ग्राम भंग, एन 'डि-बीओसी -1 एच -pyrazole-1-carboxamidine (3.2 mmol, 1.0 eq।), डीडीई-6-aminohexanol (3.8 mmol, 1.2 eq।) के 0.9 ग्राम, और 1.0 जी पीपीएच 3 (3.8 mmol, 1.2 eq।) अक्रिय वातावरण में एक 50 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में सूखी THF की 10 एमएल में की आरटी पर एक रबर पट का उपयोग कर।
      2. अलग से, एक छोटे कांच की शीशी में शुष्क THF की 2 एमएल में DIAD के 747 μL (3.8 mmol, 1.2 eq।) के साथ एक समाधान तैयार करते हैं। सरगर्मी है, एन के समाधान के लिए THF dropwise में DIAD का समाधान जोड़ने के लिए, एन 'डि-Boc -1 एच -pyrazole-1-carboxamidine, पीपीएच 3, और डीडीई-6-aminohexanol एक सिरिंज का उपयोग कर (15 से अधिक मिनट) । आरटी पर 2 घंटे के लिए समाधान हलचल करते हैं।
      3. कम दबाव में विलायक एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर निकालें और डीसीएम की 1 एमएल में कच्चे उत्पाद को लेने के। पैंटेन / EtOAc का एक समाधान में सिलिका के 100 ग्राम के साथ एक फ्लैश स्तंभ (2.5 सेमी x 20 सेमी) लोड (2: 1)। स्तंभ पर भंग कच्चे उत्पाद लागू करें और दबाव (1.5 बार) के अंतर्गत विलायक जोड़ें।
      4. अंशों इकट्ठा (विलायक प्रणाली: isocratic 2: 1 पैंटेन / EtOAc), टीएलसी के साथ वांछित अंशों की पहचान है, और उन्हें इकट्ठा (आर च = 0.66, 2: 1 पैंटेन / EtOAc, यूवी)। वांछित अंशों कम्बाइन और एक पीले रंग की, चिपचिपा तेल (2.8 mmol, 88% उपज) के रूप में शीर्षक परिसर के 1.6 ग्राम प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक लुप्त हो। आगे उपयोग के लिए आर टी पर झुकेंगे यौगिक संग्रहित करें।
  2. Acylated प्रजातियों (2 प्रतिक्रिया कदम)
    1. एस -methylisothiuronium hemisulfate की 1.4 ग्राम (10 mmol, 1.0 eq।) और डी (tert -butyl) dicarbonate की 2.2 ग्राम भंग (10 mmol, 1.0 eq।) में एक सख्ती हलचलडीसीएम की biphasic समाधान रिंग / बैठ गया। aq। 3 NaHCO और यह आरटी पर 24 घंटे के लिए हलचल करते हैं।
    2. एक जुदा कीप में परतों को अलग करें और जलीय चरण डीसीएम के साथ तीन बार निकालें। जैविक चरणों गठबंधन, उन्हें ना 2 एसओ 4 के साथ सूखी, और एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक हटा दें। हेक्सेन के 1 एमएल में कच्चे उत्पाद ले लो।
    3. 1 हेक्सेन / EtOAc: 4 का एक समाधान में सिलिका के 100 ग्राम के साथ एक फ्लैश स्तंभ (2.5 सेमी x 20 सेमी) लोड करें। स्तंभ पर भंग कच्चे उत्पाद लोड करें। दबाव में विलायक जोड़ें। टीएलसी (विलायक प्रणाली के साथ वांछित अंशों की पहचान: 4: 1 isocratic हेक्सेन / EtOAc (पता लगाने यूवी: 254 एनएम), और उन्हें इकट्ठा (आर च = 0.30)।
    4. वांछित अंशों कम्बाइन और एक पीले रंग की, चिपचिपा तेल (5.8 mmol, 58% उपज) के रूप में शीर्षक परिसर के 1.1 जी प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक लुप्त हो। स्टोर अभिकर्मक, एन - (tert -butoxycarbonyl) - एस -methylisothiourea, आरटी पर आगे उपयोग के लिए।
    5. एन के 250 मिलीग्राम भंग - (tert -butoxycarbonyl) - एस -methylisothiourea (1.3 mmol, 1.0 eq।) सूखी एन, एन -dimethylformamide (DMF) के 10 एमएल में एक 50 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में एक अक्रिय वातावरण में पर आर टी। एन, एन diisopropylethylamine (DIPEA) के 440 μL (2.6 mmol, 2 eq।) एक सिरिंज का उपयोग कर जोड़ें। सरगर्मी है, एसी 2 हे (5.2 mmol, 4.0 eq।) के 245 μL जोड़ने एक सिरिंज का उपयोग कर dropwise और यह आरटी पर 1 घंटे के लिए हलचल करते हैं।
    6. मेथनॉल की एक अतिरिक्त (2 एमएल) एक सिरिंज का उपयोग कर मिश्रण में जोड़े और यह आरटी पर 15 मिनट के लिए हलचल करते हैं। कम दबाव में विलायक एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर निकालें। डीसीएम के 1 एमएल में कच्चे उत्पाद ले लो।
    7. 1 हेक्सेन / EtOAc 3: 3 का एक समाधान में सिलिका के 60 ग्राम के साथ एक फ्लैश स्तंभ (2.5 सेमी x 20 सेमी) लोड 1। स्तंभ के लिए भंग कच्चे उत्पाद को लागू करें। जोड़े विलायक (3: 1 हेक्सेन / EtOAc) और दबाव (1.5 बार)। (: 1 हेक्सेन / EtOAc, यूवी: 220 एनएम 3), और col टीएलसी के साथ वांछित अंशों को पहचानेंउन्हें (आर च = 0.62) lect।
    8. वांछित अंशों कम्बाइन और एक सफेद ठोस (0.9 mmol, 70% उपज) के रूप में शीर्षक परिसर के 210 मिलीग्राम प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक लुप्त हो। आगे उपयोग के लिए आर टी पर यौगिक संग्रहित करें।

2. चक्रीय पेप्टाइड शगुन के संश्लेषण

  1. लोड हो रहा है और टीसीपी राल कैपिंग
    1. 2-chlortriyl क्लोराइड (सीटीसी) राल (0.9 mmol / छ) और Fmoc-Gly-ओह (1.2 eq।) की 320 मिलीग्राम की 1.00 ग्राम एक मिलाना के साथ एक प्लास्टिक 20 एमएल सिरिंज में जोड़ें। सूखी डीसीएम 5 एमएल में DIPEA के 313 μL (2 eq।) के घोल तैयार करें और सिरिंज में जोड़ें। यह आरटी पर 1 घंटे एक रोटरी इकाई का उपयोग कर के लिए बारी बारी से करते हैं।
    2. (; कैपिंग समाधान v / v) 1 मेथनॉल / DIPEA: इस बीच, 5 की एक 2 एमएल समाधान तैयार करते हैं। सिरिंज कैपिंग का समाधान जोड़ें और यह एक और 15 मिनट के लिए बारी बारी से करते हैं। डीसीएम (5x) और DMF (3x) के साथ राल धो लें।
  2. ऑन-राल Fmoc deprotection
    1. 5 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine साथ राल बाध्य Fmoc-Gly इलाज और उसके बाद। DMF (3x) के साथ राल धो लें।
  3. ऑन-राल Fmoc-ओर्न (DDE) के युग्मन -OH
    1. Fmoc-एल-ओर्न (DDE) -OH की 934 मिलीग्राम जोड़े (2 eq।), 1- की 684 मिलीग्राम [बिस (dimethylamino) methylene] -1 एच -1,2,3-triazolo [4,5-ख] pyridinium 3-oxid Hexafluorophosphate (HATU) (2 eq।), और एक छोटे कांच की शीशी के लिए 1-हाइड्रोक्सी-7-azabenzotriazole (HOAt) की 245 मिलीग्राम (2 eq।) और DMF के 5 एमएल में यह भंग। DIPEA के 814 μL जोड़ें।
    2. , Fmoc-deprotected धोया, और राल बाध्य Gly के लिए इस समाधान जोड़ें और यह 1 घंटे के लिए बारी बारी से करते हैं। DMF (3x) के साथ राल धो लें।
  4. ऑन-राल Fmoc deprotection
    1. 5 मिनट के लिए राल बाध्य Fmoc-ओर्न (DDE) -Gly 10 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine के साथ उपचार करें और उसके बाद। DMF (3x) के साथ राल धो लें।
  5. ऑन-राल Fmoc-Val-ओह के युग्मन
    1. Fmoc-Val-ओह की 610 मिलीग्राम जोड़े (2 eq।), 6HATU के 84 मिलीग्राम (2 eq।), और 245 एक छोटे कांच की शीशी को HOAt की मिलीग्राम (2 eq।) और DMF के 5 एमएल में यह भंग। DIPEA के 814 μL जोड़ें।
    2. के लिए इस समाधान जोड़ें, Fmoc-deprotected धोया, और राल बाध्य ओर्न (DDE) -Gly और यह 1 घंटे के लिए बारी बारी से करते हैं।
  6. ऑन-राल Fmoc deprotection
    1. 5 मिनट के लिए राल बाध्य Fmoc-Val-ओर्न (DDE) -Gly 10 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine के साथ उपचार करें और उसके बाद। DMF (3x) के साथ राल धो लें।
  7. ऑन-राल N- मेथिलिकरण
    1. डीसीएम (3x) के साथ राल धो लें। डीसीएम में 2-nitrobenzenesulfonylchloride (ओ -NBS-क्लोरीन, 4 eq।) की 887 मिलीग्राम भंग और 2,4,6-collidine के 1.2 एमएल जोड़ने (10 eq।)।
    2. राल बाध्य पेप्टाइड का हल जोड़ें और यह आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. सीएच 2 क्लोरीन 2 (3x) के साथ और THF (5x) के साथ राल धो लें। पीपीएच 3 की 1.18 ग्राम (5 eq।) और THF में मेथनॉल के 365 μL के साथ एक समाधान तैयार करें। के लिए इस समाधान जोड़ेंसिरिंज।
    4. THF की 2 एमएल में DIAD के 883 μL साथ एक समाधान तैयार और सिरिंज में जोड़ें। यह 15 मिनट के लिए सेते हैं। THF (5x) के साथ और DMF (5x) के साथ राल धो लें।
  8. ओ -Ns deprotection
    1. mercaptoethanol के 570 μL (10.0 eq।) और DMF के 2 एमएल में (DBU) diazabicycloundecen के 672 μL के साथ एक समाधान तैयार करें। सिरिंज के लिए इस समाधान जोड़ें और यह 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. deprotection चरण दोहराएँ और फिर DMF (5x) के साथ राल धो।
  9. ऑन-राल Fmoc- डी-पीएचई-OH के युग्मन
    1. Fmoc-D-पीएचई-OH की 697 मिलीग्राम जोड़े (2 eq।), HATU की 684 मिलीग्राम (2 eq।), और एक छोटे कांच की शीशी को HOAt (2 eq।) के 245 मिलीग्राम और DMF के 5 एमएल में यह भंग । DIPEA के 814 μL जोड़ें।
    2. , Fmoc-deprotected धोया, और राल बाध्य पेप्टाइड के लिए इस समाधान जोड़ें और यह 1 घंटे के लिए बारी बारी से करते हैं।
  10. ऑन-राल Fmoc deprotection
    1. इलाज राल-बीound 10 मिनट के लिए और फिर 5 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine साथ पेप्टाइड। DMF (3x) के साथ राल धो लें।
  11. ऑन-राल Fmoc-Asp (OT बू) -OH के युग्मन
    1. 5 एमएल में Fmoc- Asp (OT बू) -OH की 741 मिलीग्राम जोड़े (2 eq।), (2 eq।), HATU की 684 मिलीग्राम और एक छोटे कांच की शीशी के लिए (2 eq।) HOAt की 245 मिलीग्राम और भंग यह DMF के। DIPEA के 814 μL जोड़ें।
    2. , Fmoc-deprotected धोया, और राल बाध्य पेप्टाइड के लिए इस समाधान जोड़ें और यह 1 घंटे के लिए बारी बारी से करते हैं।
  12. राल से रेखीय पेप्टाइड के विखंडन
    1. डीसीएम के साथ राल धो (3x) और बाद में डीसीएम में hexafluoroisopropanol (HFIP) के घोल के 10 एमएल तैयार (1: 4; v / v)।
    2. राल का हल जोड़ें और इसे 15 मिनट के लिए बारी बारी से करते हैं। एक गोल पेंदी वाले फ्लास्क में समाधान इकट्ठा। दरार दोहराएँ और एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर विलायक लुप्त हो।
  13. रैखिक पेप्टाइड की चक्रगति
    1. डि3 NaHCO (5.0 eq।) और DMF के 50 एमएल में diphenylphosphoryl azide के 582 μL (DPPA) (3.0 eq।) की 384 मिलीग्राम ssolve और कच्चे उत्पाद में जोड़ें। यह रात भर हलचल करते हैं या नहीं रैखिक पेप्टाइड ईएसआई-एमएस (10 ज) 17 के साथ मनाया जाता है जब तक।
    2. कम दबाव के तहत, एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर एक छोटी मात्रा के लिए विलायक कम। NaCl (नमकीन) के एक संतृप्त जलीय घोल तैयार करें। एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में सोडियम क्लोराइड की संतृप्त जलीय घोल का 40 एमएल के लिए cyclized पेप्टाइड dropwise जोड़ें।
    3. निलंबन (5,000 XG, 5 मिनट) अपकेंद्रित्र और एचपीएलसी ग्रेड पानी (2x) के साथ तलछट धोएं। उत्पाद Lyophilize।

3. Guanidinylation और deprotection समाधान में

  1. दर्जी निर्मित पूर्ववर्ती साथ Guanidinylation
    1. DMF की एक छोटी मात्रा में (जैसे, 25 मिलीग्राम) orthogonally deprotected चक्रीय पेप्टाइड की एक छोटी राशि भंग (जैसे, 2 मीटरएल)। 2 eq जोड़ें। guanidinylation अग्रदूत और 2 eq की। समाधान के लिए DIPEA की और यह आरटी पर 2 घंटे के लिए हलचल करते हैं।
    2. एचपीएलसी-एमएस के साथ प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी। प्रतिक्रिया पूर्ण होने पर, विलायक, फिर से भंग guanidinylated चक्रीय acetonitrile में पेप्टाइड हटाने, और semipreparative एचपीएलसी शुद्धि 16 प्रदर्शन करते हैं।
  2. एसिड अस्थिर पक्ष श्रृंखला की रक्षा समूहों को हटाया
    1. एक समाधान युक्त trifluoroacetic एसिड (टीएफए), पानी, और triisopropylsilane (टिप्स) के 2 एमएल तैयार करें (95 / 2.5 / 2.5, v / v / v)। शुद्ध उत्पाद के लिए इस समाधान एक छोटे कांच की शीशी में जोड़ें और यह कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर हलचल करते हैं। ईएसआई-एमएस 17 के साथ पूरा deprotection का निरीक्षण करें।
    2. एक छोटी मात्रा करने के लिए कम दबाव में विलायक लुप्त हो। बहुत ठंडा ईथर तैयार करें और एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 एमएल जोड़ें। यह जोड़कर ठंडा आकाश में deprotected पेप्टाइड एक पाश्चर पिपेट का उपयोग तलछटdropwise। एक गोली प्राप्त करने के लिए निलंबन (5,000 XG, 5 मिनट) अपकेंद्रित्र।
    3. बहुत ठंडा ईथर के साथ तलछट धो लें और यह अपकेंद्रित्र (5,000 XG, 5 मिनट, 2x)। एचपीएलसी ग्रेड पानी की 2 एमएल में उत्पाद भंग और semipreparative एचपीएलसी 16 के साथ शुद्ध।

4. विश्लेषणात्मक डाटा और शोधन के लिए पैरामीटर

  1. विश्लेषणात्मक एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस
    1. एक C18 स्तंभ (12 एनएम छेद के आकार, 3-सुक्ष्ममापी कण आकार, 125 मिमी × 2.1 मिमी) या एक सी 8 स्तंभ (20 एनएम छेद के आकार, 5-सुक्ष्ममापी कण का उपयोग कर एक LCQ जन स्पेक्ट्रोमीटर के साथ विश्लेषणात्मक एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस प्रदर्शन आकार, 250 मिमी × 2.1 मिमी), एच 2 ओ (0.1% v / v फार्मिक एसिड) / acetonitrile (0.1% v / v फार्मिक एसिड) eluents के रूप में के साथ।
  2. अर्द्ध प्रारंभिक एचपीएलसी
    1. एक ODS-एक स्तंभ (20 x 250 मिमी, 5 सुक्ष्ममापी), 8 एमएल / मिनट की प्रवाह की दर, और रेखीय ग्रेडिएंट के साथ अर्द्ध प्रारंभिक एचपीएलसी एक प्रारंभिक एचपीएलसी साधन का उपयोग कर प्रदर्शन करनाएच 2 ओ (0.1% v / v टीएफए) और acetonitrile (0.1% v / v टीएफए) के।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चक्रीय पेप्टाइड अग्रदूत, एक रेखीय पेप्टाइड के रूप में संश्लेषित किया गया था cyclized, और orthogonally डीडीई-deprotected। वर्षा के बाद, यौगिक की शुद्धता एचपीएलसी-एमएस (चित्रा 1) के साथ विश्लेषण किया गया था। प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करने के लिए, एक एचपीएलसी विश्लेषण 2-ज प्रतिक्रिया समय (चित्रा 2) के बाद किया गया था।

guanidine समूह पर बड़ा अवशेषों के लिए, 2 घंटे की प्रतिक्रिया समय अक्सर पर्याप्त नहीं है। इस मामले में, प्रतिक्रिया जारी रखा और LC-एमएस के साथ नजर रखी गई थी। प्रतिक्रिया और अंतिम deprotection के बाद, यौगिकों (कम मिलीग्राम सीमा आम तौर पर पैदावार) semipreparative एचपीएलसी उपकरणों का उपयोग शुद्ध किया गया। अंतिम यौगिकों पवित्रता (चित्रा 3 देखें) का मूल्यांकन करने के एचपीएलसी-एमएस के साथ विश्लेषण किया गया।

एक छोटी राशि एक microcentrifuge ट्यूब में तौला और पतला था DMSO के साथ एलिसा की तरह, ठोस चरण बाध्यकारी परख में परिसर के जैविक मूल्यांकन के लिए एक स्टेम समाधान प्राप्त करने के लिए। परिणाम चित्र 4 में चित्रित कर रहे हैं। मानक अणु Cilengitide (असंशोधित guanidine समूह) एक संदर्भ के रूप में शामिल है। सभी यौगिकों इंटीग्रिन उप प्रकार αvβ3 और α5β1 के खिलाफ उच्च चयनात्मकता के लिए एक रिश्तेदार उच्च आकर्षण पास है।

आकृति 1
चित्र 1: एचपीएलसी-एमएस स्पेक्ट्रम: orthogonally डीडीई-deprotected व्युत्पन्न ग की (ढाल 10-90% एच 2 ओ और ACN के साथ एक Biphasic विलायक प्रणाली में acetonitrile (ACN)) (OrnGD (OT बू) F (n Me) वी ) (गणना की बड़े पैमाने पर: 602.34 जी / मोल), के रूप में रैखिक पेप्टाइड की चक्रगति के बाद प्राप्त, बाद में डीडीई-deprotection, और वर्षा।ank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: एचपीएलसी-एमएस स्पेक्ट्रम (ढाल: एच 2 ओ और ACN के साथ एक Biphasic विलायक प्रणाली में 10-90% ACN) orthogonally deprotected चक्रीय पेप्टाइड की guanidinylation प्रतिक्रिया और guanidinylation के लिए मिथाइल अग्रदूत के बाद प्रतिक्रिया मिश्रण की। उत्पाद शिखर (आर टी = 7.50 मिनट, गणना की बड़े पैमाने पर = 858.49 छ / mol) इसके अलावा, केवल guanidinylation अग्रदूत (आर टी = 6.38 मिनट) और आधार DIPEA (आर टी = 0.90 मिनट) से अधिक देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: deprotection के बाद कच्चे तेल की यौगिक 2 (आर टी = 3.69 मिनट, गणना की बड़े पैमाने पर = 603.32 जी / मोल) की: एचपीएलसी-एमएस स्पेक्ट्रम (एच 2 ओ और ACN के साथ एक Biphasic विलायक प्रणाली में 10-90% ACN ढाल) semipreparative शुद्धि से पहले एसिड अस्थिर पक्ष श्रृंखला की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: समाधान और जैविक मूल्यांकन में guanidines के functionalization। यौगिक 1, एक अनछुए guanidine समूह के साथ, Cilengitide है। संशोधनों इस पांडुलिपि में संबोधित कर रहे हैं methylated (2), क्रियाशील (यहाँ, अमीनो हेक्सेन एसिटाइल, 3), और acetylated (4) डेरिवेटिव। टीवह बंधन आकर्षण एक ठोस चरण बाध्यकारी परख अलग प्रोटीन 18 का प्रयोग करने में निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Guanidinylation के लिए अग्रदूत ((एन Me) वी) ग (OrnD (OT बू) गोल) है, जो ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (SPPS) का एक मानक Fmoc प्रोटोकॉल द्वारा संश्लेषित एक orthogonally deprotected चक्रीय पेप्टाइड व्युत्पन्न, है। Ornithin orthogonally संरक्षित व्युत्पन्न, (Fmoc-ओर्न (DDE) -OH) है, जो पेप्टाइड पाड़ की चक्रगति के बाद DMF में हाइड्राज़ीन साथ deprotected किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया गया था। पेप्टाइड अग्रदूत परिसर के वर्षा से और बाद में lyophilization द्वारा शुद्ध होता है।

Guanidinylation के लिए अल्किलेटेड पूर्ववर्ती व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पदार्थ एन से शुरू, एन 'डि-Boc -1 एच Mitsunobu शर्तों के तहत एक alkylation प्रतिक्रिया के माध्यम से -pyrazole-1-carboxamidine (पीपीएच 3 एक एक कदम प्रतिक्रिया में अच्छा पैदावार में प्राप्त किया जा सकता , DIAD, THF) 19, 10। इस प्रतिक्रिया के साथ, पूर्ववर्ती की एक विशाल विविधता acce हैइसी एल्कोहल से ssible। अल्किलेटेड पूर्ववर्ती साथ guanidinylation प्रतिक्रिया एक साफ प्रतिक्रिया में परिभाषित उत्पाद अर्जित करता है। अभिकारक की पूरी रूपांतरण 2 घंटे के बाद नहीं मनाया जाता है, तो प्रतिक्रिया जारी रखा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में दी गई शर्तों के तहत, केवल मामूली पक्ष उत्पादों का गठन किया, हालांकि, दोष का अधिक मात्रा में, सभी के लिए बाहर नहीं किया जा सकता है विशेष रूप से अलग ढंग से संरक्षित, बड़ा moieties ले जाने substrates।

guanidine-क्रियाशील पेप्टाइड (अब linkers) का उपयोग करते हैं, तो डीडीई लिंकर के टर्मिनल अमाइन पर समूह की रक्षा निकालकर उसकी जगह एक इसी एसिड को एमाइड युग्मन द्वारा संयुग्मित जा सकता है। डीडीई की deprotection DMF में 2% हाइड्राज़ीन का एक समाधान में प्रदर्शन किया और पैदावार orthogonally deprotected पेप्टाइड, जो आगे उपयोग करने से पहले (जैसे, semipreparative HPLC) शुद्ध किया जाना चाहिए है। इस मामले में, एक सरल एसिटिलीकरण प्रतिक्रिया सीटू प्रदर्शन किया था।

अगरacetylated guanidines का उपयोग कर, एक अलग अग्रदूत रणनीति लागू किया जाना चाहिए। एस -methylisothiourea से शुरू, एक दो कदम प्रतिक्रिया अनुक्रम 20 की आवश्यकता है। सबसे पहले, एस -methylisothiourea की एक मोनो Boc संरक्षण पसंद का एक एसिड (यहाँ, एसिटिक एसिड) के साथ एसिटिलीकरण से पहले 21 किया जाना चाहिए। guanidinylation प्रतिक्रिया, एक बहुत साफ है और तेजी से प्रतिक्रिया है अंतिम यौगिक एसिड अस्थिर पक्ष श्रृंखला की रक्षा समूहों के अंतिम deprotection के बाद प्राप्त होता है।

पहले से ही परिचय में कहा गया है, इस विधि संशोधन और किसी भी peptidic guanidine समूह के functionalization के लिए अनुमति देता है। हम लाइगैंडों के उप प्रकार चयनात्मकता की ट्यूनिंग इस मामले में इंटीग्रिन लाइगैंडों है, जो की अनुमति देने पर इस तकनीक का प्रदर्शन किया,,। असंशोधित इंटीग्रिन प्रतिपक्षी Cilengitide αvβ3 / α5β1 उपप्रकार के लिए biselective है। के टर्मिनल एन ω के मिथाइलेशन के माध्यम सेguanidine समूह, एक αvβ3 चयनात्मक ligand झुकेंगे है। यह ब्लॉक एक महत्वपूर्ण अंत पर बातचीत की अद्वितीय रूप α5β1 में मनाया जाता है, इस प्रकार यह इंटीग्रिन के लिए ligand निष्क्रिय। Αvβ3 उप प्रकार का बाध्यकारी साइट के साथ मुख्य बातचीत एक अंत पर बातचीत है कि इस बातचीत के 10 से परेशान नहीं कर रहा है।

ligand ( "functionalization") अब लिंकर इकाइयों के साथ संशोधित करके, दो गोल एक ही बार में पहुंचा जा सकता है: चयनात्मकता उत्पन्न होता है अंत पर बातचीत α5β1 उप-प्रकार के साथ दूसरे पक्ष पर, लिंकर अंकों में से तोड़ने और, के माध्यम से बाध्यकारी जेब, बड़े संस्थाओं (जैसे, chelators या इमेजिंग तकनीक के लिए फ्लोरोसेंट रंजक) 10 विकार के लिए अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

TGK उनके वित्तीय सहायता के लिए Technische Universität München की विज्ञान और इंजीनियरिंग (IGGSE) के लिए अंतर्राष्ट्रीय ग्रेजुएट स्कूल को स्वीकार करता है। एच उनके समर्थन के लिए एकीकृत प्रोटीन विज्ञान म्यूनिख के लिए केंद्र (CIPSM) मानता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Tags

जैव रसायन अंक 122 guanidine arginine पेप्टाइड संशोधन guanidinylation alkylation mitsunobu
संशोधन और Guanidine समूह के functionalization दर्जी निर्मित शगुन द्वारा
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler,… More

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter