Summary
대응하는 전구체의 사용에 기초하여 알킬화 구아니딘의 합성을위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
구아니딘 그룹은 의약 화학에서 가장 중요한 pharmacophoric 그룹 중 하나입니다. 구아니딘기를 운반 유일한 아미노산은 아르기닌이다. 이 문서에서, 펩티드 리간드의 구아니딘 기의 개질을위한 쉬운 방법은 RGD 인테그린 - 결합 리간드의 예와 함께 제공된다. 또한, 최근 이러한 리간드의 구아니딘 기의 고유 변경합니다 (αv 및 α5 아형 사이 예) 서브 타입의 선택적인 조절을 가능하게하는 것이 입증되었다. 또한, 구아니딘기를 통해 작용하는 이전의 미지의 전략 증명하고, 합성 방법은 본 문서에 검토된다. 여기에 기술 된 변형 (N의 ω) 및 알킬화 아세틸 구아니딘기를 말단에 포함한다. 합성, 맞춤형 전구체 분자는 다음 미리 전송하는 직교 탈 아민과의 반응을 실시하는, 합성개질 구아니딘 그룹. 알킬화 구아니딘의 합성에 대해, 전구체는 N에 기초하여, N '- 디 - BOC-1 H 피라 졸 -1- 카르 복스 아미 딘은 실화 화합물, 선택 N -Boc- S의 대응 실화 유도체되는 전구체를 합성하기 위해 사용된다 - 단일 및 두 단계 반응에서 얻을 수 methylisothiourea.
Introduction
자연 리간드에서 가장 풍부한 pharmacophoric 그룹 중 여러 상호 작용 1, 2에 참여하고있다 구아니딘 그룹이다. 예를 들어, 수소 결합 상호 작용의 가능성이 4 배의 수소 공여체로서 작용하며 염다리 또는 양이온 - π 상호 작용과 같은 정전 상호 작용에 관여한다. 의약 화학에서, 이러한 그룹들은 구아니딘 모방 체 (5, 6)로 자주 있지만, 약물과 약물 후보 (4)에서 발견된다. 구아니딘 유사체의 개발을위한 이유는 유비쿼터스, 양전하 구아니딘 그룹의 제거뿐만 아니라 리간드의 친 유성의 조정이다. 펩티드 리간드에서 유일한 구아니딘 기 함유 아미노산 따라서 종종 펩티드 리간드의 생리 활성 영역에서 발견되는 아르기닌이다.
매우 홍보아르기닌 - 함유 리간드 패밀리 ominent 예는 RGD 결합 인테그린의 아과이다. 일반적으로, 인테그린은 모든 고등 생물에서 중요한 기능을 구비하고, 세포 부착 수용체의 클래스입니다. 이들 기능 중 일부는 세포 부착, 이동, 및 세포 생존을 포함한다. 따라서, 그들은 또한 암 및 섬유증 등의 병적 징후에 참여하고 있습니다. 인테그린은 24 개 현재 알려진 인테그린 아형 형성 α- 및 β 서브 유닛으로 구성된 이종이 량체 경막 단백질; 이들 8은 리간드 7의 트라이 펩타이드 서열의 Arg-의 Gly-의 Asp (RGD =)를 인식한다. 결합 영역은 세포 외 부분, 소위 인테그린 헤드 그룹 (8)이 두 아형 사이의 계면에 위치한다. RGD는 두 개의 일반적인 상호 작용에 의해 인식된다 : 베타 소단위에 있으며, 리간드에 카르 복실 산을 결합하는 금속 이온 의존성 접착 사이트 (MIDAS) 영역 (차 측을)의 ASP 단계; 및 알파 서브 유닛에있는 리간드의 구아니딘 기. 인테그린 하위 유형의 대부분은 난잡한하고 자연 세포 외 기질 (ECM) 9 리간드의 적어도 일부를 공유 할 수 있습니다. 따라서, 인공 인테그린 리간드의 개발에 주요 초점은 높은 결합 친 화성, 하위 유형의 선택 외에입니다. 구아니딘 그룹 : 최근에, 우리는 하위 유형 선택적 리간드의 생성을위한 핵심 요소를 공개 할 수 있었다. 별개의 변형을 통해, 그리고 αv- biselective 대한 리간드가 α5 아형을 함유하는 인테그린 후 다른-α 서브 유닛 (10)을 구별 할 수있는 구아니딘 기, 간단한 수정에 의해 선택적 화합물로 전환 될 수있다.
αv의 주머니, 구아니딘 기는 Asp218 11, 12 두자리 염다리를 통해 측면에서 상호 작용한다. 이 상호 작용 C도 (α5에서 Asp227로 여기) α5β1에서 관찰 될 수 있지만, 또한 끝에서 Gln의 잔기 (Gln221)와 구아니딘 기의 상호 작용이 관찰되었다 (13). 상기 구아니딘 N의 ω의 메틸화와 구아니딘 기의 N의 δ의 메틸화로 측에 상호 작용을 차단 한 경우에, 다른 경우 : 따라서, 우리는 두 개의 대향 방법 구아니딘기를 변형 최종에 상호 작용을 차단. 놀랍게도,이 작은 수정은 리간드의 완벽한 선택 이동되었다. 알킬화뿐만 아니라, 새로운 기능화 방법은이 책에서 소개되었다. pentapeptidic 리간드의 유형에 대한 고전적인 작용 방법은, 결합에 관여하지 않는 아미노산의 측쇄 결합을 통해 (예, (C)의 K (RGDfK)) 14, 15. 이리,바인딩 중요 - - 아실 또는 알킬 링커 우리 관능 구아니딘을 수정하여도 좋다 보여준다. 결합을 위해 필수적인 양의 전하가 유지되며, 모델은 결합 주머니 장쇄 포인트, 따라서 상기 링커의 부착을위한 이상적 가능성을 제공하고 (단위 라벨링 제안 예를 들면, 형광 표지 또는 분자에 대한 킬레이트 영상).
이 작품에서 우리는 아르기닌 함유 리간드의 구아니딘 그룹의 수정을위한 예비 단계에 집중한다. 이것은 더 이상 링커 단위로 N ω -methylated 종의 합성뿐만 아니라, 구아니딘을 포함한다. 다른 변형 아실 및 알킬 그룹을 포함한다.
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Protocol
주 : 모든 시약 및 용매는 상업적 공급자로부터 수득하고, 추가 정제없이 사용 하였다.
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 화학 합성 (예를 들어, 흄 후드, 보호 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)를 수행 할 때 모든 적절한 안전 장비를 사용하십시오.
Guanidinylation 전구체의 합성 (1)
- 알킬화 종
- 메틸화 종
- 건조 10ml에 (PPH 3, 3.8 밀리몰, 1.2 eq.)를 N, N '1.0 g 녹이고 디-BOC-1에서 H 피라 졸 -1- 카르 복스 아미 딘 (3.2 밀리몰, 1 당량.) 및 트리 페닐 포스 핀 1.0 g 실온 (RT)에서의 고무 격막을 사용하여 불활성 분위기에서 50 mL의 둥근 바닥 플라스크에 테트라 히드로 푸란 (THF). 주사기 (4.8 밀리몰, 1.5 당량.) 및 L을 사용하여 건조 메탄올 194 μL를 추가그 외 RT에서 교반 하였다.
- 별도로, 작은 유리 병에서 건조 THF 2 mL 중 디 이소 프로필 아조 디카 르 복실 레이트의 747 μL (DIAD, 3.8 밀리몰, 1.2 eq.)를 갖는 용액을 제조 하였다. 교반하면서, 주사기 (15 분)을 사용하여 N, N '디-BOC-1 H 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘, PPH (3) 및 메탄올의 용액에 THF를 적가 DIAD의 용액을 추가한다. 실온에서 2 시간 동안 솔루션 저어 보자.
- 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거하고, 디클로로 메탄 중 1 ㎖ (DCM)의 조 생성물을 용해. 펜탄 용액 중 10 % 에틸 아세테이트, 실리카 100 g을 (EtOAc)에 함께 플래시 칼럼 (2.5 cm × 20 cm)을로드. 칼럼에 용해 된 조질 생성물을로드 압력 (1.5 바)하에 용매를 추가한다.
- (용매 시스템 : 등용 매, 10 %의 펜탄 중 EtOAc)이 분획을 모아, 박층 크로마토 그래피 (TLC)에 의해 목적 화합물 스폿을 식별하고, (R의 F = 0.4을 EtOAc / 펜탄 1 : 9, 자외선)을 수집한다. 원하는 결합분획을 황색 점성 오일 (2.6 밀리몰, 81 % 수율)의 표제 화합물 0.85 g을 수득 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 증발. 추가 사용에 대한 RT에서 수득 된 화합물을 저장합니다.
- 헥실 수정 종
- N 1.0 g을 녹이고, N '디-BOC-1 H 피라 졸 -1- 카르 복스 아미 딘 (3.2 밀리몰, 1.0 eq.)를, DDE -6- aminohexanol (3.8 밀리몰, 1.2 eq.)를 0.9 g, 1.0 g 불활성 분위기 하에서 50 mL의 둥근 바닥 플라스크에 건조 THF 10 mL 중 PPH 3 (3.8 밀리몰, 1.2 eq.)를 RT에서의 고무 격막을 사용.
- 별도로, 작은 유리 병에서 747 μL의 DIAD (3.8 밀리몰, 1.2 eq.)를 무수 THF 2 ㎖로 갖는 용액을 제조 하였다. 교반하면서 N의 용액에 THF를 적가 DIAD의 용액을 첨가, 주사기를 이용하여 N '디-BOC-1 H 피라 졸 -1- 카르 복스 아미 딘, PPH 3, DDE -6- aminohexanol (이상 15 분) . 실온에서 2 시간 동안 솔루션 저어 보자.
- 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거하고 DCM 1 mL 중 조 생성물 감는. 펜탄 / EtOAc로의 용액에 실리카 100 g의 플래시 컬럼 (2.5 cm × 20 cm)을로드 (2 : 1). 칼럼에 용해 된 조질 생성물을 적용하고 압력 (1.5 바)하에 용매를 추가한다.
- 분획을 수집 (용매 시스템 : 등용 매 2 : 1 펜탄 / EtOAc)에, TLC로 원하는 분획을 확인하고,이를 수집 (R의 F = 0.66, 2 : 1 펜탄 / EtOAc로, UV). 원하는 분획을 결합시켜 황색의 점성 오일 (2.8 밀리몰, 수율 88 %)의 표제 화합물 1.6 g을 수득 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 증발시켰다. 추가 사용에 대한 RT에서 수득 된 화합물을 저장합니다.
- 메틸화 종
- 실화 된 종 (2 반응 단계)
- S의 -methylisothiuronium의 헤미 설페이트 1.4 g (10 밀리몰, 1.0 eq.)를 디 (제 3 부틸) 디 카보네이트 2.2 g 디졸브 (10 밀리몰, 1.0 당량.)를 격렬히 교반에DCM의 이상성 용액을 벨소리 / 앉았다. AQ. NaHCO3을하고 RT에서 24 시간 동안 저어 보자.
- 분별 깔때기에 층을 분리하고, DCM으로 수 성상을 세 번 추출 하였다. 유기 상을 합하고, 나 2 SO 4로 건조하고, 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거 하였다. 헥산 1 mL 중 조 생성물 감는.
- 1 헥산 / EtOAc로 4의 용액에 실리카 100 g의 플래시 컬럼 (2.5 cm × 20 cm)을로드. 컬럼에 용해 된 조질 생성물을로드. 압력 용매에 추가합니다. (R의 F = 0.30) 254 ㎚), 그 수집 : 4 : 1 등용 매 헥산 / EtOAc로 (UV 검출 TLC (용매 계를 사용하여 원하는 분획을 확인한다.
- 원하는 분획을 결합시켜 황색의 점성 오일 (5.8 밀리몰, 58 % 수율)의 표제 화합물 1.1 g을 수득 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 증발시켰다. (제 3 부 톡시 카르 보닐) - - 시약, N을 저장 S -Me상기 용도에서 RT thylisothiourea.
- N 250 mg의 디졸브 - 불활성 분위기에서 50 mL의 둥근 바닥 플라스크에 S의 -methylisothiourea (1.3 밀리몰, 1.0 eq.)를 건조 N, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF) 10 ㎖의시 - (제 3 부 톡시 카르 보닐) RT. 주사기를 사용하여 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIPEA) 440 μL (2.6 밀리몰, 2 당량). 추가. 교반하면서, 행 2 O (5.2 밀리몰, 4.0 eq.)를 245 μL를 추가 주사기를 사용하여 적가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하자.
- 주사기를 사용하여 상기 혼합물에 과잉의 메탄올 (2 ㎖)를 첨가하고 RT에서 15 분 동안 교반하자. 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거 하였다. DCM 1 mL 중 조 생성물을 위로 가져 가라.
- 1 헥산 / EtOAc로 3 : 3의 용액에 실리카 60 g의 속성 컬럼 (2.5 cm × 20 cm)을로드 한. 칼럼에 용해 된 조질 생성물을 적용한다. 추가 용매 (3 : 1 헥산 / EtOAc)에 압력 (1.5 바). (1 헥산 / EtOAc로, UV : 220 내지 3), 및 COL TLC로 목적하는 분획물을 파악이들 (R의 F = 0.62) lect.
- 원하는 분획을 결합하고 (0.9 밀리몰, 수율 70 %)을 백색 고체로서 표제 화합물 210 mg을 얻었다 회전식 증발기를 사용하여 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 추가 사용에 대한 RT의 화합물을 저장합니다.
사이 클릭 펩티드 전구체의 합성 (2)
- 로드 및 TCP 수지 상한
- 프릿 인 플라스틱 20 ml 주사기로 -2- chlortriyl 클로라이드 (CTC) 수지 (0.9 밀리몰 / g) 및 FMOC-의 Gly-OH (1.2 eq.)를 320 mg의 1.00 g을 추가한다. 건조 DCM 5ml에 313 μL DIPEA (2 당량.)의 용액을 제조하고, 주사기에 추가. 이 회전 장치를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 회전하자.
- (캡핑 용액 V / V) 1 메탄올 / DIPEA : 한편, (5)의 2 mL의 용액을 제조 하였다. 주사기에 캡핑 솔루션을 추가하고 또 다른 15 분 동안 회전 할 수 있습니다. DCM (5 배) 및 DMF (3x)로 수지를 세척 하였다.
- 및 Fmoc 탈 수지에
- 5 분 후, 10 분 동안 DMF 중 20 % 피 페리 딘으로 수지 - 결합 FMOC-의 Gly 처리하며. DMF (3x)로 수지를 세척 하였다.
- 온 수지 FMOC-Orn이며 (DDE)의 결합 -OH
- FMOC-L-Orn이며 (DDE) -OH의 934 mg을 추가 (2 eq.)를, 684 mg의 1- [비스 (디메틸 아미노) 메틸렌] -1 H -1,2,3- 트리아 졸로 [4,5-b] 피리 디늄 -3- OXID 헥사 플루오로 포스페이트 (HATU) (2 당량.), 1- 히드 록시 -7- azabenzotriazole (HOAT) 245 mg의 (2 eq.)를 작은 유리 바이알에 DMF 5 ㎖에 용해. DIPEA의 814 μL를 추가합니다.
- 1, FMOC-탈 세정하고, 수지의 Gly 결합이 용액을 첨가하고 1 시간 동안 회전하자. DMF (3x)로 수지를 세척 하였다.
- 및 Fmoc 탈 수지에
- 5 분 후, 10 분 동안 -Gly DMF 중 20 % 피 페리 딘과의 수지 - 결합 FMOC-Orn이며 (DDE)을 처리하고,. DMF (3x)로 수지를 세척 하였다.
- FMOC - 브로-OH의 커플 링에서 수지
- (2 당량). FMOC-브로-OH 610 ㎎을 추가 6HATU 84 ㎎을 (2 eq.)를, (245) 작은 유리 병에 ㎎의 HOAT (2 eq.)를 DMF 및 5 ㎖에 용해. DIPEA의 814 μL를 추가합니다.
- 이 용액을 추가, FMOC-탈 세척하고, 수지 - 결합 Orn이며 (DDE) -Gly하고 1 시간 동안 회전하자.
- 및 Fmoc 탈 수지에
- 5 분 후, 10 분 동안 -Gly DMF 중 20 % 피 페리 딘과의 수지 - 결합 FMOC-브로-Orn이며 (DDE)을 처리하고,. DMF (3x)로 수지를 세척 하였다.
- 온 수지 N- 메틸화
- DCM (3 배)와 수지 씻으십시오. DCM으로 2 니트 로벤 (O -NBS-CL, 4 당량.)의 887 mg을 용해시키고, 2,4,6- 콜리 딘 1.2 mL를 부가 (10 당량.).
- 수지 - 결합 된 펩타이드의 용액을 첨가하고 실온에서 20 분 동안 배양하자.
- 을 CH2Cl2 (3X)와 THF (5 배)로 수지를 세척 하였다. PPH (3) 1.18 g (5 eq.)를 THF 및 메탄올 365 μL와 용액을 준비한다. 받는이 솔루션을 추가주사기.
- THF 2 ml에 DIAD 883 μL로 용액을 제조하고, 주사기에 추가. 이 15 분 동안 품어 보자. THF (5 배)와 DMF (5 배)로 수지를 세척 하였다.
- O -NS의 탈
- 머 캅토 에탄올 570 μL (10.0 eq.)를 DMF 및 2 ㎖로 diazabicycloundecen 672 μL (DBU)와 용액을 준비한다. 주사기에이 솔루션을 추가하고 5 분 동안 품어 보자.
- 탈 보호 단계를 반복하고 DMF (5 배)로 수지를 세척 하였다.
- - 프의 Fmoc- D-OH의 커플 링에서 수지
- FMOC-D-Phe가-OH의 697 mg을 추가 (2 eq.)를, HATU 684 ㎎을 (2 eq.)를, 작은 유리 바이알에 HOAT (2 eq.)를 245 mg의 DMF 5 ㎖에 용해 . DIPEA의 814 μL를 추가합니다.
- 1, FMOC-탈 세척하고, 수지 - 결합 펩티드 용액을 첨가하고이를 1 시간 동안 회전하자.
- 및 Fmoc 탈 수지에
- 수지 (B)를 취급운드, DMF 중 20 % 피 페리 딘으로 10 분 후 5 분 동안 함께 펩티드. DMF (3x)로 수지를 세척 하였다.
- FMOC-의 Asp (m 니어) -OH 수지의 온 커플
- 5 ㎖에서 그것을. (2 당량)의 Fmoc-의 Asp (m 니어) -OH의 741 mg을 추가 HATU 684 mg의 (2 eq.)를, 작은 유리 바이알에 HOAT 245 mg의 (2 eq.)를 용해 DMF 중. DIPEA의 814 μL를 추가합니다.
- 1, FMOC-탈 세척하고, 수지 - 결합 펩티드 용액을 첨가하고이를 1 시간 동안 회전하자.
- 수지로부터 펩티드의 절단 선
- DCM에서 헥사 플루오로 이소프로판올 (HFIP)의 용액 10 ㎖를 준비하여이어서 DCM (3X)를, 수지를 세척하고 (1 : 4, V / V).
- 수지에 솔루션을 추가하고 15 분 동안 회전 할 수 있습니다. 둥근 바닥 플라스크 내의 용액을 수집한다. 분열을 반복하고, 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시켰다.
- 선형 펩티드의 고리 화
- 디된 NaHCO3 (5.0 eq.)를 DMF 및 50 ㎖의 다이 페닐 포스 포릴 아 지드 582 μL (DPPA) (3.0 eq.)를 384 mg의 ssolve 조 생성물에 추가. 이 밤새 교반하자이거나 선형 펩티드 ESI-MS (10 시간) 17이 관찰되지 않을 때까지.
- 감압 로터리 증발기를 사용하여 작은 부피로 용매를 감소시킨다. 염화나트륨 (염수)의 포화 수용액을 준비한다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 원심 분리 관에 염화나트륨의 포화 수용액 40 mL를 상기 환화 펩티드 적가.
- 현탁액 (5000 XG, 5 분) 원심 분리기 및 HPLC 등급의 물 (2X)로 침전물을 세척 하였다. 제품을 동결 건조.
솔루션 3. Guanidinylation 탈 보호
- 재단사 만든 전구체와 Guanidinylation
- DMF의 작은 부피 (예를 들면, 25 mg)을 직교하게 탈 환상 펩티드 소량의 수용액 (예를 들면, 2m엘). 2 EQ를 추가합니다. guanidinylation 전구체 및 2 EQ의. 용액에 DIPEA으로는 RT에서 2 시간 동안 교반하자.
- HPLC-MS와 반응의 진행을 모니터링합니다. 반응이 완료된 후, 아세토 니트릴 용매, 다시 녹이는 guanidinylated 환상 펩티드를 제거하고 반 - HPLC 정제 (16)를 수행한다.
- 산 불안정 측쇄 보호기를 제거하여
- 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 물, 및 트리 이소 프로필 실란 (TIPS)를 함유하는 용액 2 mL를 준비한다 (95 / 2.5 / 2.5, V / V / V). 작은 유리 병에 정제 된 생성물이 용액을 첨가하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서 교반하자. ESI-MS (17)과의 완전한 탈 보호를 관찰한다.
- 소량의 용매를 감압하에 증발시켰다. 빙냉 에테르를 준비하고, 50 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖를 추가한다. 추가하여 파스퇴르 피펫을 사용하여 빙냉 에테르의 탈 펩티드를 침전적가. 펠렛을 얻기 위해 현탁액 (5000 XG, 5 분) 원심 분리기.
- (5000 XG, 5 분, 2 배)를 빙냉 에테르로 침전물을 세척하고 원심 분리기. HPLC 등급 물 2 ㎖로 생성물을 용해시키고, 반 - 16 HPLC로 정제.
4. 분석 데이터 및 정제를위한 매개 변수
- 분석 HPLC-ESI-MS
- C18 컬럼 (12 나노 기공 크기, 3 ㎛의 입자 직경 125 mm mm 2.1 ×) 또는 C8 칼럼 (20 나노 미터의 공극 크기 5 ㎛의 입자를 사용 LCQ 질량 분광기 분석 HPLC-ESI-MS를 수행 크기, 용리액으로서 H 2 O (0.1 % V / V 포름산) / 아세토 니트릴 (0.1 % V / V 포름산) 250 mm × 2.1 mm).
- 세미 예비 HPLC
- ODS-A 칼럼 (20 × 250mm, 5 μm의) 8 ㎖ / 분의 유속, 및 선형 그라디언트 취용 HPLC 기기를 사용하여 반 - 예비 HPLC를 수행H 2 (TFA 0.1 % V V /) O (0.1 % TFA V V /) 및 아세토 니트릴.
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Representative Results
사이 클릭 펩티드 전구체의 선형 펩티드 합성 환화 및 직교 DDE 탈 보호 하였다. 침전 후, 화합물의 순도는 HPLC-MS (도 1)로 분석 하였다. 반응의 진행을 모니터하기 위해, HPLC 분석은 2 시간의 반응 시간 (도 2) 한 후에 수행되었다.
구아니딘 그룹에 큰 잔류를 들어, 2 시간의 반응 시간은 종종 충분하지 않습니다. 이 경우, 반응을 계속하고, LC-MS로 모니터. 반응 최종 탈 보호 한 후, 화합물 (저 mg의 범위에서 통상적 수율) 반 - HPLC 기기를 사용하여 정제 하였다. 최종 화합물은 순도 (도 3 참조)를 평가하기 위해 HPLC-MS로 분석 하였다.
소량의 미세 원심 분리 튜브로 칭량하고, 희석 DMSO 함께 ELISA와 같은 고상 결합 분석법에서 화합물의 생물학적 평가를위한 줄기 용액을 얻었다. 그 결과를도 4에 도시된다. 표준 분자 Cilengitide (변성 구아니딘 기)를 기준으로 포함된다. 모든 화합물에 대한 α5β1 인테그린 αvβ3 아형 선택성 및 높은 대 상대적인 높은 친 화성을 갖는다.
도 1 : HPLC-MS 스펙트럼 : 직교하게 DDE 탈 보호 유도체 (C)의 (구배 H 2 O 및 ACN과 이상성 용매 시스템에서 10-90 % 아세토 니트릴 (ACN)) (OrnGD (m 니어) F (ME N) V () 계산 된 질량 : 602.34 g / mol)의 선형 펩티드를 고리 화 반응 후 얻어진 후속 DDE 탈 보호하고, 침전.ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : HPLC-MS 스펙트럼 (구배 : H 2 O 및 ACN과 이상성 용매 시스템에서 10-90 % ACN)를 직교 탈 환상 펩티드 guanidinylation 반응 및 메틸화 guanidinylation위한 전구체 후, 반응 혼합물. 생성물 피크 (R의 t = 7.50 분, 계산 된 질량 = 858.49 g / mol)의 외에 guanidinylation 전구체 (R의 t = 6.38 분) 및베이스 DIPEA (R의 t = 0.90 분)의 초과를 관찰 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 탈 보호 후 조 화합물 (2) (R의 t = 3.69 분, 계산 된 질량 = 603.32 g / 몰) : HPLC-MS 스펙트럼 (H 2 O 및 ACN과 이상성 용매 시스템에서 10-90 % ACN 구배) 반 - 정제 전의 산 불안정 측쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 솔루션 및 생물학적 평가 구아니딘의 기능화. 화합물 도 1은, 변형되지 않은 구아니딘기로, Cilengitide이다. 이 논문에서 해결 된 변형 (아세틸 아미노 헥산, 여기서 3) 관능 (2) 메틸화, 아세틸 화 및 (4) 유도체. 티그 결합력 격리 단백질 18을 사용하여 고상 결합 분석법으로 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
guanidinylation 용 전구체 ((N 나) V) C (OrnD (m 니어) Gf를), 고상 펩티드 합성 (SPPS) 표준 FMOC 프로토콜에 의해 합성되는 직교 탈 환상 펩티드 유도체이다. Ornithin 펩티드 골격의 고리 화 한 후 DMF 히드라진으로 탈 보호 될 수있는 직교 보호 된 유도체 (FMOC-Orn이며 (DDE) -OH)를 사용 하였다. 펩티드 전구체 화합물의 석출에 의해 그 이후의 동결 건조에 의해 정제한다.
guanidinylation위한 알킬화 전구체, 미츠 노부 조건하에 알킬화 반응을 통해 N '디-BOC-1 H 피라 졸 -1- 카르 복스 아미 딘 (PPH 3 시판 물질 N부터 한 단계 반응에서 좋은 수율로 얻을 수있다 , DIAD, THF) 19 (10). 이 반응으로, 전구체의 거대한 다양한 전열이다상응하는 알콜로부터 ssible. 알킬화 전구체를 가진 guanidinylation 반응은 깨끗한 반응에 정의 된 제품을 얻을 수 있습니다. 반응물의 완전한 전환이 2 시간 후에 관찰되지 않으면 반응이 계속되어야한다. 프로토콜에 주어진 조건에서 사소한 부산물이 형성; 그러나, 불순물의 양이 많을수록, 모두 배제 할 수 특히 다르게 큰 부분을 운반 기판을 보호.
구아니딘 - 작용 펩티드 (긴 링커)를 사용하는 경우, 링커의 말단에 아민 보호기 DDE 제거하고, 상응하는 산 아미드 결합에 의해 결합 될 수있다. DDE의 탈 보호는 DMF 중의 2 % 히드라진의 용액을 수행하고 더 사용하기 전에 (즉, 반 - HPLC)로 정제되어야 직교 탈 펩티드를 얻을 수있다. 이 경우, 간단한 아세틸 화 반응은 동일계에서 수행 하였다.
만약아세틸 구아니딘을 사용하여, 다른 전구체 전략이 적용되어야한다. S의 -methylisothiourea부터 두 단계의 반응 순서는 20 요구된다. 먼저, S의 -methylisothiourea의 모노 BOC 보호 (여기서, 아세트산)의 선택의 산으로 21 아세틸 전에 수행되어야한다. guanidinylation 반응은 최종 화합물이 산 불안정 측쇄 보호기의 탈 보호 후 최종 수득되는 매우 깨끗하고 빠른 반응이다.
이미 서론에서 언급 한 바와 같이,이 방법은 펩타이드 구아니딘 그룹의 수정 및 기능화 수 있습니다. 우리는이 경우에 허용 인테그린 리간드에 리간드의 서브 타입 선택의 튜닝이 기술을 보여 주었다. 수정되지 않은 인테그린 길항제 Cilengitide는 αvβ3 / α5β1 아형에 대한 biselective입니다. 단말의 N의 ω의 메틸화 스루구아니딘 기, αvβ3 선택적 리간드가 수득된다. 이 블록 고유 따라서이 인테그린에 대한 리간드를 불 활성화, α5β1에서 관찰되는 중요한 말에 상호 작용. αvβ3 하위 유형의 결합 부위의 주된 상호 작용은 최종에 상호 작용이 상호 작용 (10)에 의해 방해되지 않는 것입니다.
( "기능화") 이상 링커 단위로 리간드를 수정하여, 두 가지 목표는 한 번에 도달 할 수 있습니다 선택성이 생성되는 중, 다른 측면에서, 링커 점을 α5β1 하위 유형과의 상호 작용에 끝 - 더를 깨고 통해 많은 엔티티 (예, 킬레이트 제 또는 영상 기술을위한 형광 염료) 10의 접합을 허용 포켓 바인딩.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
TGK는 재정 지원을위한 TECHNISCHE Universität 뮌헨의 과학 및 공학 (IGGSE) 국제 대학원을 인정합니다. HK는 그들의 지원을위한 통합 단백질 과학 뮌헨 센터 (CIPSM)을 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98% | Sigma Aldrich | 434167 ALDRICH | |
| Triphenylphosphine, 99% | Sigma Aldrich | T84409 SIGMA-ALDRICH | |
| Tetrahydrofuran, >99.5% | Carl Roth | 4745 | |
| Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% | Carl Roth | 5182 | |
| Methanol anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 322415 SIGMA-ALDRICH | |
| Diisopropyl azodicarboxylate, 98% | Sigma Aldrich | 225541 ALDRICH | |
| Dichlormethan, for synthesis, 99.5% | Carl Roth | 8424 | |
| Silica gel for flash chromtaography | Sigma Aldrich | 60738 SIGMA-ALDRICH | |
| n-Pentane, 99% | Carl Roth | 8720 | |
| n-Hexane, 99% | Carl Roth | CP47 | |
| Ethylacetate, 99.5% | Carl Roth | 7338 | |
| Aminohexanol, 95% | Sigma Aldrich | A56353 ALDRICH | |
| S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% | Sigma Aldrich | M84445 ALDRICH | |
| Di-tert-butyl dicarbonate, 99% | Sigma Aldrich | 205249 ALDRICH | |
| N,N-Dimethylformamid, 99.8% | Carl Roth | A529 | |
| N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% | Carl Roth | 2474 | |
| Acetic anhydrid, 99% | Carl Roth | 4483 | |
| Chlortrityl resin | Carbolution | CC11006 | |
| Fmoc-Gly-OH, 98% | Carbolution | CC05014 | |
| Piperidin, 99% | Sigma Aldrich | 104094 SIGMA-ALDRICH | |
| Fmoc-Orn(Dde)-OH | Iris-Biotech | FAA1502 | |
| HATU, 99% | Carbolution | CC01011 | |
| HOAt, 99% | Carbolution | CC01004 | |
| Fmoc-Val-OH | Carbolution | CC05028 | |
| 2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% | Sigma Aldrich | N11507 ALDRICH | |
| 2,4,6-Collidine, 99% | Sigma Aldrich | 27690 SIGMA-ALDRICH | |
| Mercaptoethanol, 99% | Sigma Aldrich | M6250 ALDRICH | |
| Diazabicycloundecen, 98% | Sigma Aldrich | 139009 ALDRICH | |
| Fmoc-D-Phe-OH, 98% | Sigma Aldrich | 47378 ALDRICH | |
| Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% | Carbolution | CC05008 | |
| Hexafluoroisopropanol | Carbolution | CC03056 | |
| Diphenylphosphoryl azide, 97% | Sigma Aldrich | 178756 ALDRICH | |
| TFA, 99.9% | Carl Roth | P088 | |
| Triisopropylsilan, 98% | Sigma Aldrich | 233781 ALDRICH | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Carl Roth | HN44 |
References
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