Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modifikasjon og funksjon av Guanidine Grupper etter Skreddersydde Prekursorer

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for syntese av alkyl-guanidiner modifisert basert på bruk av de tilsvarende forløpere er presentert.

Abstract

Guanidingruppen er en av de viktigste pharmacophoric grupper i medisinsk kjemi. Den eneste aminosyre som bærer en guanidingruppen er arginin. I denne artikkelen, er en enkel fremgangsmåte for modifikasjon av guanidingruppen i peptidiske ligander forutsatt, med et eksempel på RGD-bindende integrin-ligander. Det ble nylig vist at den distinkte modifikasjon av guanidingruppen i disse ligandene gjør det mulig for den selektive modulering av undertype (f.eks, mellom subtyper-inte og α5). Videre ble en tidligere ukjent strategi for funksjon via guanidingruppen demonstrert, og syntetisk tilnærming er anmeldt i dette dokumentet. De modifikasjoner som er beskrevet her involverer terminalt (N ω) alkylerte og acetylerte guanidin-grupper. For syntesen, blir skreddersydd forløpermolekyler syntetisert, som deretter underkastes en reaksjon med et ortogonalt avbeskyttet amin for å overføre den forhånds-modifisert guanidingruppen. For syntese av alkylerte guanidiner, forløpere basert på N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboksamidin som brukes til å syntetisere acylerte forbindelser, forløperen for valg å være et tilsvarende acylert derivat av N-Boc- S - metylisotiourea, som kan fås i en- og to-trinns reaksjoner.

Introduction

Blant de mest tallrike pharmacophoric grupper i naturlige ligander er guanidingruppen, som er involvert i flere interaksjoner 1, 2. For eksempel, fungerer den som en potensiell firedobbelt hydrogendonor i hydrogenbindingsvekselvirkninger og er involvert i elektrostatiske interaksjoner, for eksempel saltbroer eller kation-π interaksjoner. I medisinsk kjemi, er denne gruppen ofte finnes i medikamenter og medikamentkandidater 4, selv om svært ofte som guanidin-mimetika 5, 6. Grunnen for utviklingen av guanidin-mimetika er fjerning av de allestedsnærværende, positivt ladet gruppe guanidin, såvel som justering av lipofilisiteten av liganden. I peptidiske ligander, er den eneste guanidin gruppeholdige aminosyren arginin, som derfor ofte finnes i den bioaktive region av peptidiske ligander.

En svært prominent eksempel for en arginin-inneholdende ligand familien er underfamilien av RGD-bindende integriner. Generelt, integriner er en klasse av celleadhesjonsreseptorer, som overtar viktige funksjoner i alle høyere organismer. Noen av disse funksjonene involverer celle-adhesjon, migrasjon, og celleoverlevelse. Således blir de også er involvert i patologiske indikasjoner, slik som kreft og fibrose. Integriner er heterodimere transmembrane proteiner som består av en α- og en β-subenhet som danner 24 tiden kjente integrin-undertyper; 8 av dem gjenkjenner tripeptidsekvensen Arg-Gly-Asp (RGD =) i deres ligander 7. Den bindende region er lokalisert ved grenseflaten mellom disse to undertyper i den ekstracellulære delen, den såkalte integrin hodegruppe 8. RGD er anerkjent av to vanlige interaksjoner: metall-ion-avhengig adhesjon stedet (MIDAS) region, som er lokalisert i beta-underenheten, og som binder karboksylsyre i ligandene (side chai i Asp); og guanidingruppen i ligandene, som er plassert i alfa-underenhet. De fleste av integrinundertypene er promiskuøse og deler i det minste en del av deres naturlige ekstracellulære matriks (ECM) ligander 9. Således, for utvikling av kunstig inte ligander, er det stor fokus, i tillegg til en høy bindingsaffinitet, subtype selektivitet. Nylig var vi i stand til å avsløre et nøkkelelement for frembringelse av undertype-selektive ligander: guanidingruppen. Gjennom forskjellige modifikasjoner, biselective ligander for αv- og α5-inneholdende integrin-subtyper kan gjøres om til selektive forbindelser ved enkle modifikasjoner på guanidingruppen, som deretter kan diskriminere de forskjellige α-subenheter 10.

I lommen på inte, samvirker guanidingruppen side-on via en bidentat saltbro med Asp218 11, 12. Denne interaksjonen cen også observeres i α5β1 (her, med Asp227 i α5), men i tillegg, er en ende-mot vekselvirkning for guanidin-gruppen med et Gin residie (Gln221) observerte der 13. Således modifiserte vi guanidingruppen i to motsatte måter: i ett tilfelle, ved blokkering av side på interaksjon med metylering av N δ for guanidin-gruppen, og i det andre tilfellet, med metylering av guanidin N ω, blokkerer utgangen på vekselvirkning. Overraskende nok liten modifikasjon førte til en fullstendig selektivitet skift i ligandene. I tillegg til den alkylering, ble en ny funksjonalise metode innføres i denne publikasjonen. Den klassiske metode for funksjonalisering av denne type pentapeptidic ligand er gjennom sidekjeden konjugering av en aminosyre som ikke er involvert i binding (f.eks, K i c (RGDfK)) 14, 15. Her,Vi viser at funksjonalisering er også mulig ved å endre guanidin - noe som er avgjørende for binding - med en acyl eller alkylert linker. Den positive ladning som er nødvendig for binding blir beholdt, og modeller antyder at de langkjedede poeng av bindingslommen, og dermed gi en ideell mulighet for feste av ytterligere linkere og merking av enhetene (for eksempel en fluorescerende markør eller en chelator for molekylær imaging).

I dette arbeidet har vi konsentrere seg om den preparative fremgangsmåten for modifisering av guanidingruppen i arginin-inneholdende ligander. Dette innebærer syntese av N-metylert ω arter, såvel som guanidiner med lengre linker enheter. De forskjellige modifikasjoner som omfatter acyl- og alkylgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle reagenser og løsningsmidler ble oppnådd fra kommersielle leverandører og ble brukt uten ytterligere rensing.

Forsiktig: Sjå alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Vennligst bruk alle nødvendige sikkerhetsutstyr når du utfører kjemiske synteser (f.eks avtrekksskap, vernebriller, hansker, lab frakk, full-lengde bukser og lukket-toe sko).

1. Syntese av Guanidinylation Precursors

  1. alkylerte arter
    1. denaturert arter
      1. Oppløs 1,0 g N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboksamidin (3,2 mmol, 1 ekv.) Og 1,0 g trifenylfosfin (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 ekv.) I 10 ml tørt tetrahydrofuran (THF) i en 50 ml rundbunnet flaske i en inert atmosfære ved hjelp av en gummiskillevegg ved romtemperatur (RT). Legg 194 ul tørr metanol ved anvendelse av en sprøyte (4,8 mmol, 1,5 ekv.) Og let det omrør ved RT.
      2. Separat ble en oppløsning med 747 ul av diisopropylazodikarboksylat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 ekv.) I 2 ml tørr THF i en liten glassflaske. Under omrøring, tilsett løsning av DIAD i THF dråpevis til oppløsningen av N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboksamidin, PPh3, og metanol ved anvendelse av en sprøyte (over 15 min). La løsningen røre i 2 timer ved RT.
      3. Fjern løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper og oppløse råproduktet i 1 mL diklormetan (DCM). Laster en flash-kolonne (2,5 cm x 20 cm) med 100 g silika i 10% etylacetat (EtOAc) i en pentanløsning. Installering av oppløste urene produkt på kolonnen og tilsett midlet under trykk (1,5 bar).
      4. Samle fraksjoner (løsningsmiddelsystem: isokratisk 10% EtOAc i pentan), identifiserer den ønskede forbindelse flekk ved tynnsjiktskromatografi (TLC), og samle det (Rf = 0,4, EtOAc / pentan 1: 9, UV). Kombiner den ønskedefraksjoner og fordamp løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper under dannelse av 0,85 g av tittelforbindelsen som en gul, viskøs olje (2,6 mmol, 81% utbytte). Oppbevar ga forbindelse ved RT i ytterligere bruk.
    2. Heksylamin-modifiserte arter
      1. Oppløs 1,0 g N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboksamidin (3,2 mmol, 1,0 ekv.), 0,9 g av Dde-6-aminoheksanol (3,8 mmol, 1,2 ekv.), Og 1,0 g av PPh3 (3,8 mmol, 1,2 ekv.) i 10 ml tørr THF i en 50 ml rundbunnet kolbe i inert atmosfære ved hjelp av en gummimembran ved RT.
      2. Separat ble en oppløsning med 747 ul av DIAD (3,8 mmol, 1,2 ekv.) I 2 ml tørr THF i en liten glassflaske. Under omrøring, tilsett løsning av DIAD i THF dråpevis til oppløsningen av N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboksamidin, PPh3, og Dde-6-aminoheksanol ved anvendelse av en sprøyte (over 15 min) . La løsningen røre i 2 timer ved RT.
      3. Fjern løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper og tar råproduktet opp i 1 ml DCM. Laster en flash-kolonne (2,5 cm x 20 cm) med 100 g silisiumdioksyd i en oppløsning av pentan / EtOAc (2: 1). Påfør oppløses råproduktet på kolonnen og tilsett midlet under trykk (1,5 bar).
      4. Samle fraksjoner (løsningsmiddelsystem: isokratisk 2: 1 pentan / EtOAc), identifisere de ønskede fraksjoner med TLC, og samle dem (Rf = 0,66, 2: 1 pentan / EtOAc, UV). Kombiner de ønskede fraksjoner og fordamp løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper for å oppnå 1,6 g av tittelforbindelsen som en gul, viskøs olje (2,8 mmol, 88% utbytte). Oppbevar ga forbindelse ved RT i ytterligere bruk.
  2. Acylerte arter (2 reaksjonstrinn)
    1. Oppløs 1,4 g S -methylisothiuronium hemisulfat (10 mmol, 1,0 ekv.) Og 2,2 g di (tert-butyl) dikarbonat (10 mmol, 1,0 ekv.) I en kraftig omrørtring bifasisk oppløsning av DCM / sat. aq. NaHCO3 og la det røre i 24 timer ved romtemperatur.
    2. Separer lagene i en skilletrakt og ekstraher den vandige fase tre ganger med DCM. Kombiner de organiske faser, tørk dem med Na 2SO 4, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper. Ta det urene produkt opp i 1 ml heksan.
    3. Laster en flash-kolonne (2,5 cm x 20 cm) med 100 g silisiumdioksyd i en løsning av 4: 1 heksan / EtOAc. Installering av oppløste urene produkt på kolonnen. Legg midlet under trykk. Identifisere de ønskede fraksjoner med TLC (løsningsmiddelsystem: 4: 1 isokratisk heksan / EtOAc (deteksjon, UV: 254 nm), og samle dem (Rf = 0,30).
    4. Kombiner de ønskede fraksjoner og fordamp løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper for å gi 1,1 g av tittelforbindelsen som en gul, viskøs olje (5,8 mmol, 58% utbytte). Oppbevar reagens, N - (tert-butoksykarbonyl) - S -Methylisothiourea ved RT i ytterligere bruk.
    5. Oppløs 250 mg N - (tert-butoksykarbonyl) - S -methylisothiourea (1,3 mmol, 1,0 ekv.) I 10 ml tørr N, N-dimetylformamid (DMF) i en 50 ml rundbunnet flaske i en inert atmosfære ved RT. Legg 440 ul N, N-diisopropyletylamin (DIPEA) (2,6 mmol, 2 ekv.) Ved hjelp av en sprøyte. Under omrøring, tilsett 245 ul av AC2O (5,2 mmol, 4,0 ekv.) Dråpevis med en sprøyte og lar det omrøres i 1 time ved romtemperatur.
    6. Legge til et overskudd av metanol (2 ml) til blandingen ved hjelp av en sprøyte og lar det omrøres i 15 min ved RT. Fjern løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper. Ta det urene produkt opp i 1 ml DCM.
    7. Laster en flash-kolonne (2,5 cm x 20 cm) med 60 g silisiumdioksyd i en oppløsning av 3: 1 heksan / EtOAc 3: 1. Påfør oppløses råproduktet til kolonnen. Legg løsningsmiddel (3: 1 heksan / EtOAc) og trykk (1,5 bar). Identifisere de ønskede fraksjoner med TLC (3: 1 heksan / EtOAc, UV: 220 nm), og collect dem (Rf = 0,62).
    8. Kombiner de ønskede fraksjoner og fordamp løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper under dannelse av 210 mg av tittelforbindelsen som et hvitt, fast stoff (0,9 mmol, 70% utbytte). Oppbevar forbindelsen ved RT i ytterligere bruk.

2. Syntese av syklisk peptid Precursors

  1. Lasting og capping TCP harpiks
    1. Legg 1,00 g 2-chlortriyl klorid (CTC) harpiks (0,9 mmol / g) og 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 ekv.) I en plast 20-ml sprøyte med en fritte. Fremstill en løsning av 313 ul av DIPEA (2 ekv.) I 5 ml tørr DCM og legge den til sprøyten. La den rotere i 1 time ved romtemperatur ved hjelp av en roterende enhet.
    2. I mellomtiden fremstille en 2-ml løsning av 5: 1 metanol / DIPEA (v / v; capping løsning). Tilsett capping løsning til sprøyten og la den rotere i ytterligere 15 min. Vask harpiksen med DCM (5 x) og DMF (3 x).
  2. On-resin Fmoc-avbeskyttelse
    1. Behandle den harpiks-bundne Fmoc-Gly med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og deretter i 5 min. Vask harpiksen med DMF (3 x).
  3. On-harpiks kobling av Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Legg 934 mg Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 ekv.), 684 mg 1- [bis (dimetylamino) metylen] -1-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium-3-oxid heksafluorfosfat (HATU) (2 ekv.), og 245 mg av 1-hydroksy-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 ekv.) til en liten glassampulle og oppløse den i 5 ml DMF. Legg 814 mL av DIPEA.
    2. Til denne løsning tilsettes den Fmoc-avbeskyttet, vasket, og harpiks-bundet Gly og la den rotere i 1 time. Vask harpiksen med DMF (3 x).
  4. On-resin Fmoc-avbeskyttelse
    1. Behandle den harpiks-bundne Fmoc-Orn (Dde) -Gly med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og deretter i 5 min. Vask harpiksen med DMF (3 x).
  5. On-harpiks kobling av Fmoc-Val-OH
    1. Legg 610 mg Fmoc-Val-OH (2 ekv.), 684 mg av HATU (2 ekv.), Og 245 mg av HOAt (2 ekv.) Til en liten glassflaske og oppløse den i 5 ml DMF. Legg 814 mL av DIPEA.
    2. Til denne løsning tilsettes den Fmoc-avbeskyttet, vasket, og harpiks-bundet Orn (Dde) -Gly og la den rotere i 1 time.
  6. On-resin Fmoc-avbeskyttelse
    1. Behandle den harpiks-bundne Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og deretter i 5 min. Vask harpiksen med DMF (3 x).
  7. On-harpiks N- metylering
    1. Vask harpiksen med DCM (3x). Oppløs 887 mg 2-nitrobenzenesulfonylchloride (o -NBS-Cl, 4 ekv.) I DCM og tilsett 1,2 ml 2,4,6-kollidin (10 ekv.).
    2. Tilsett oppløsningen til det resinbundne peptid og la det inkuberes i 20 minutter ved RT.
    3. Vask harpiksen med CH 2Cl 2 (3x) og med THF (5 x). Fremstill en løsning med 1,18 g av PPh3 (5 ekv.) Og 365 ul methanol i THF. Legg denne løsningen tilsprøyte.
    4. Fremstill en løsning med 883 ul av DIAD i 2 ml THF og tilsett den til sprøyten. La det inkuberes i 15 min. Vask harpiksen med THF (5 x) og med DMF (5 x).
  8. o -Ns avbeskyttelse
    1. Fremstill en løsning med 570 pl merkaptoetanol (10,0 ekv.) Og 672 ul av diazabicycloundecen (DBU) i 2 ml DMF. Til denne løsning tilsettes til sprøyten og la den inkuberes i 5 min.
    2. Gjenta avbeskyttelsestrinn, og deretter vaske harpiksen med DMF (5 x).
  9. On-harpiks kobling av Fmoc-D-Phe-OH
    1. Legg 697 mg av Fmoc-D-Phe-OH (2 ekv.), 684 mg HATU (2 ekv.), Og 245 mg av HOAt (2 ekv.) Til en liten glassflaske og oppløse den i 5 ml DMF . Legg 814 mL av DIPEA.
    2. Til denne løsning tilsettes den Fmoc-avbeskyttet, vasket, og resinbundet peptid og la den rotere i 1 time.
  10. On-resin Fmoc-avbeskyttelse
    1. Behandle harpiksen-bound peptid med 20% piperidin i DMF i 10 minutter og deretter i 5 min. Vask harpiksen med DMF (3 x).
  11. On-harpiks kobling av Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH
    1. Legg 741 mg Fmoc- Asp (Ot Bu) -OH (2 ekv.), 684 mg HATU (2 ekv.), Og 245 mg av HOAt (2 ekv.) Til en liten glassflaske og oppløse den i 5 mL DMF. Legg 814 mL av DIPEA.
    2. Til denne løsning tilsettes den Fmoc-avbeskyttet, vasket, og resinbundet peptid og la den rotere i 1 time.
  12. Spaltning av det lineære peptid fra harpiksen
    1. Vask harpiksen med DCM (3x), og deretter fremstilles 10 ml av en løsning av heksafluorisopropanol (HFIP) i DCM (1: 4, v / v).
    2. Tilsett oppløsningen til harpiksen og la den rotere i 15 minutter. Samle løsningen i en rundbunnet kolbe. Gjenta cleavage og fordamp løsningsmidlet under anvendelse av en rotasjonsfordamper.
  13. Ringslutning av det lineære peptid
    1. dissolve 384 mg av NaHCO3 (5,0 ekv.) og 582 ul av difenylfosforylazid (DPPA) (3,0 ekv.) i 50 ml DMF og legge den til det urene produkt. La det omrørt over natten, eller inntil det ikke lineært peptid er observert med ESI-MS (10 h) 17.
    2. Under redusert trykk, reduser løsningsmidlet til et lite volum ved bruk av en rotasjonsfordamper. Fremstill en mettet, vandig løsning av NaCl (saltlake). Ved hjelp av en Pasteur-pipette, legger det cykliserte peptid dråpevis til 40 ml av en mettet vandig oppløsning av NaCl i et sentrifugerør.
    3. Sentrifuger suspensjonen (5000 x g, 5 min) og vask bunnfallet med HPLC-kvalitet vann (2x). Lyofiliser produktet.

3. Guanidinylation og Deproteksjon i Solution

  1. Guanidinylation med skreddersydde forløpere
    1. Oppløse en liten mengde (for eksempel 25 mg) av den ortogonalt avbeskyttes sykliske peptid i et lite volum DMF (for eksempel 2 mL). Tilsett 2 ekvivalenter. av den guanidinylation forløper og 2 ekv. DIPEA til løsningen og la den omrøres i 2 timer ved romtemperatur.
    2. Overvåke utviklingen av reaksjonen med HPLC-MS. Etter at reaksjonen er fullført, fjernes løsningsmidlet gjenoppløses den guanidinylated sykliske peptid i acetonitril, og utføre semipreparativ HPLC-rensing 16.
  2. Fjerning av syrelabile sidekjedebeskyttende grupper
    1. Forbered 2 ml av en oppløsning inneholdende trifluoreddiksyre (TFA), vann, og triisopropylsilan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Til denne løsning tilsettes det rensede produkt i en liten glassampulle og la den omrøres ved romtemperatur i minst 1 time. Observere fullstendig avspaltning med ESI-MS 17.
    2. Fordamp løsningsmidlet under redusert trykk til et lite volum. Forbered iskald ether og tilsett 10 ml i et 50 ml sentrifugerør. Bunnfall den avbeskyttede peptid i iskald eter ved anvendelse av en Pasteur-pipette ved å legge detdråpevis. Sentrifuger suspensjonen (5000 x g, 5 min) for å oppnå en pellet.
    3. Vask bunnfallet med iskald eter og sentrifuge det (5000 x g, 5 minutter, 2 x). Oppløs produktet i 2 ml av HPLC-grad vann og rense det med semipreparativ HPLC 16.

4. Analytiske data og parametre for rensing

  1. Analytisk HPLC-ESI-MS
    1. Utføre analytisk HPLC-ESI-MS med en LCQ massespektrometer ved å bruke en C18 kolonne (12-nm porestørrelse, 3-um partikkelstørrelse, 125 mm x 2,1 mm) eller en C8-kolonne (20-nm porestørrelse, 5-um partikkel størrelse, 250 mm x 2,1 mm), med H2O (0,1% v / v maursyre) / acetonitril (0,1% v / v maursyre) som elueringsmidler.
  2. Semipreparativ HPLC
    1. Utføre semi-preparativ HPLC ved anvendelse av en preparativ HPLC-instrument med en ODS-A kolonne (20 x 250 mm, 5 um), en strømningshastighet på 8 ml / min, og lineære gradienterav H2O (0,1% volum / volum TFA) og acetonitril (0,1% volum / volum TFA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det sykliske peptid-forløperen ble syntetisert som et lineært peptid, ringsluttes, og ortogonalt Dde-avbeskyttet. Etter utfelling ble renheten av forbindelsen analysert med HPLC-MS (figur 1). For å overvåke utviklingen av reaksjonen ble det utført en HPLC-analyse etter at 2-timers reaksjonstid (figur 2).

For større rester på guanidingruppen, er reaksjonstiden fra 2 timer ofte ikke nok. I dette tilfellet ble reaksjonen fortsatt og overvåket med LC-MS. Etter at reaksjonen og endelig avbeskyttelse, ble forbindelsene renset ved hjelp av semipreparativ HPLC-utstyr (utbytter vanligvis i lav-mg-området). De endelige forbindelser ble analysert med HPLC-MS for å evaluere renheten (se figur 3).

En liten mengde ble veid inn i et mikrosentrifugerør og fortynnet med DMSO for å oppnå en stilk løsning for den biologiske evaluering av forbindelsen i en ELISA-aktig, fast-fase-bindingsanalyse. Resultatene er angitt i figur 4. Standarden molekylet Cilengitide (umodifisert guanidingruppen) er inkludert som en referanse. Alle forbindelser har en relativt høy affinitet for integrin avp3-subtypen og høy selektivitet mot α5β1.

Figur 1
Figur 1: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% acetonitril (ACN) i et tofase-oppløsningsmiddelsystem med H2O og ACN) av den ortogonalt Dde-avbeskyttet derivat c (OrnGD (Ot Bu) f (N-Me) V ) (beregnet masse: 602,34 g / mol), som ble oppnådd etter ringslutningen av det lineære peptid, påfølgende Dde-avbeskyttelse, og nedbør.ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% ACN i et tofase-oppløsningsmiddelsystem med H2O og ACN) av reaksjonsblandingen etter guanidinylation reaksjonen av ortogonalt avbeskyttes sykliske peptid og det metylerte forløper for guanidinylation. Foruten den Produkttoppen (Rt = 7,50 min, beregnet masse = 858,49 g / mol), er det bare det overskytende av guanidinylation forløper (Rt = 6,38 min), og bunn DIPEA (Rt = 0,90 min) overholdes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% ACN i et tofase-oppløsningsmiddelsystem med H2O og ACN) av den rå forbindelse 2 (Rt = 3,69 min, beregnet masse = 603,32 g / mol) etter avbeskyttelse av de syrelabile sidekjedene i forkant av semipreparativ rensing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Funksjonalisering av guanidiner i oppløsning og biologisk evaluering. forbindelse 1, med en uendret guanidingruppen, er Cilengitide. De modifikasjoner som er omtalt i dette manuskriptet er den metylert (2), funksjonalisert (her, acetyl amino heksan, 3), og acetylerte (4) derivater. Than bindingsaffinitet ble bestemt i en fast-fase-bindingsanalyse ved anvendelse av isolerte proteiner 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forløperen for guanidinylation er et ortogonalt avbeskyttes sykliske peptid-derivat, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N-Me) V)), som blir syntetisert ved en standard Fmoc-protokollen for fast-fase peptidsyntese (SPPS). Ornithin ble anvendt som ortogonalt beskyttede derivat, (Fmoc-Orn (Dde) -OH), som kan bli avspaltet med hydrazin i DMF etter ringslutningen av peptidet stillaset. Peptidet forløper renses ved hjelp av utfelling av forbindelsen og ved den etterfølgende frysetørking.

Alkylerte forløpere ved guanidinylation kan oppnås i gode utbytter i en én-trinns reaksjon utgående fra kommersielt tilgjengelige stoffer N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboksamidin gjennom en alkyleringsreaksjon under Mitsunobu-betingelser (PPh3 , DIAD, THF) 19, 10. Med denne reaksjonen, et stort utvalg av forløpere er tilbessible fra de tilsvarende alkoholer. Den guanidinylation reaksjon med de alkylerte forløpere gir den definerte produkt i en ren reaksjon. Dersom fullstendig omdannelse av reaktant ikke er observert etter 2 timer, bør reaksjonen fortsettes. Under de forhold som er gitt i protokollen, bare mindre biprodukter dannes; imidlertid kan høyere mengder forurensninger ikke utelukkes for det hele tatt, spesielt på en annen måte er beskyttet, substrater med større grupper.

Ved anvendelse av guanidin-funksjonaliserte peptider (lengre kopiere), DDE-beskyttende gruppe på det terminale amin av linkeren er fjernet, og kan konjugeres via amid- kobling til en tilsvarende syre. Avbeskyttelsen av Dde blir utført i en oppløsning av 2% hydrazin i DMF og gir det ortogonalt avbeskyttede peptid, som skal renses (f.eks semipreparativ HPLC) før videre bruk. I dette tilfelle ble en enkel Acetyleringsreaksjonen utføres in situ.

Hvisved hjelp av acetylerte guanidiner, bør en annen forløper strategi anvendes. Å gå ut fra S -methylisothiourea, er en to-trinns reaksjonssekvens som kreves 20. For det første må et mono- Boc-beskyttelse av S -methylisothiourea utføres 21 før acetylering med en syre med valg (her, eddiksyre). Den guanidinylation reaksjon er en meget ren og rask reaksjon, den endelige forbindelse blir oppnådd etter den endelige avbeskyttelse av syrelabile sidekjedebeskyttende grupper.

Som allerede nevnt i innledningen, gir denne metode for modifikasjon og funksjonalisering av en hvilken som helst peptid-guanidingruppen. Vi demonstrerte denne teknikk på integrin-ligander, som tillater, i dette tilfellet, avstemning av subtype selektivitet av ligandene. Den umodifiserte integrin antagonist Cilengitide er biselective for avp3 / α5β1 subtyper. Gjennom metylering av terminalen N ω avguanidingruppen, en avp3-selektiv ligand er gitt. Dette blokkerer en viktig slutt-på interaksjons som er unikt observert i α5β1, således inaktivere liganden for dette integrin. Hoved interaksjon med bindingssetet for den avp3-subtypen er en ende-mot interaksjon som ikke er forstyrret av denne interaksjonen 10.

Ved å modifisere liganden med lengre linker-enheter ( "funksjonalisering"), kan to mål nås på én gang: selektivitet blir generert ved å bryte ende-mot interaksjon med den α5β1 subtype og, på den andre siden, vil binder punktene ut av bindingslommen, slik at for konjugering til større enheter (f.eks chelatorer eller fluorescerende fargestoffer for avbildningsteknikker) 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

TGK erkjenner International Graduate School for Science and Engineering (IGGSE) av Technische Universität München for sin økonomiske støtte. HK erkjenner Senter for integrert Protein Science München (CIPSM) for deres støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Tags

Biochemistry utgave 122 guanidin arginin peptid modifikasjon guanidinylation alkylering Mitsunobu
Modifikasjon og funksjon av Guanidine Grupper etter Skreddersydde Prekursorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler,… More

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter