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Biochemistry

Modificação e funcionalização do Grupo de guanidina por precursores sob medida

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo para a síntese de guanidinas modificada-alquilo baseados na utilização dos precursores correspondentes é apresentada.

Abstract

O grupo guanidina é um dos grupos farmacofóricos mais importantes em química medicinal. O único aminoácido que contém um grupo guanidina é arginina. Neste artigo, um método fácil para a modificação do grupo guanidina em ligandos peptidicos é fornecido, com um exemplo de ligandos de integrina de ligao a RGD. Foi recentemente demonstrado que a modificação distinto do grupo guanidina nesses ligandos permite a modulação selectiva do subtipo (por exemplo, entre os subtipos aV e α5). Além disso, uma estratégia anteriormente desconhecido para a funcionalização através do grupo guanidina foi demonstrada, e a abordagem sintética foi avaliada neste documento. As modificações aqui descritas envolvem terminalmente (N ω) grupos guanidina alquilados e acetilados. Para a síntese, moléculas precursoras feitas por medida são sintetizados, os quais são, em seguida, submetido a uma reacção com uma amina desprotegida de modo ortogonal para transferir o prégrupo guanidina -Modified. Para a síntese de guanidinas alquilados, precursores à base de N, N '-di-Boc-1 H-pirazole-1-carboxamidina são utilizados para sintetizar compostos acilados, o precursor de escolha sendo um derivado acilado correspondente de N-Boc-S - metilisotioureia, o qual pode ser obtido em reacções de um e de dois passos.

Introduction

Entre os grupos farmacofóricos mais abundantes em ligandos naturais é o grupo guanidina, o qual está envolvido em várias interacções 1, 2. Por exemplo, ele serve como um potencial dador de hidrogénio de quatro vezes em interacções de ligações de hidrogénio e está envolvido em interacções electrostáticas, tais como as pontes salinas ou interacções catiões π. Em química medicinal, este grupo é frequentemente encontrada em drogas e candidatos a fármacos 4, embora, muitas vezes, como mimicos de guanidina 5, 6. A razão para o desenvolvimento de mimicos de guanidina é a remoção do grupo guanidina ubíqua, carregado positivamente, assim como o ajuste da lipofilicidade do ligando. Em ligandos peptídicos, o único aminoácido contendo um grupo guanidina é arginina, que é, portanto, muitas vezes encontrado na região bioactiva de ligandos peptídicos.

Um muito prominent exemplo para uma família de ligandos contendo arginina é a subfamília das integrinas RGD de ligação. Em geral, as integrinas são uma classe de receptores de adesão celular, as quais assumem funções importantes em todos os organismos superiores. Algumas dessas funções envolvem a adesão celular, migração e sobrevivência das células. Assim, eles também estão envolvidos em indicações patológicos, tais como cancro e fibrose. As integrinas são proteínas transmembranares heterodiméricas que consistem de um α- e uma subunidade-β que formam 24 subtipos de integrina actualmente conhecidas; 8 deles reconhece a sequência tripeptídica Arg-Gli-Asp (RGD =) nos seus ligandos 7. A região de ligação localiza-se na interface entre estes dois subtipos na parte extracelular, o chamado grupo de cabeça 8 integrina. RGD é reconhecido por duas interacções comuns: o sítio de adesão de metal-dependente de iões região (MIDAS), que está localizado na subunidade beta e que se liga ao ácido carboxílico nos ligandos (cha lateraisna de Asp); e o grupo guanidina nos ligandos, que está localizado na subunidade alfa. A maioria dos subtipos de integrina são promíscuo e partilham pelo menos uma parte da sua matriz extracelular naturais (ECM) ligandos 9. Assim, para o desenvolvimento de ligandos de integrina artificiais, o foco principal é, além de uma elevada afinidade de ligação, a selectividade do subtipo. Recentemente, nós fomos capazes de revelar um elemento-chave para a geração de ligandos do subtipo selectivo: o grupo guanidina. Através de modificações distintos, os ligandos para o biselective αv- e α5 contendo subtipos de integrina pode ser transformado em compostos selectivos por modificações simples no grupo guanidina, o qual pode, em seguida, a discriminar diferentes α-subunidades 10.

No bolso de aV, o grupo guanidina interage lado-a através de uma ponte salina com o Asp218 bidentado 11, 12. Esta interacção cum também ser observada em α5β1 (aqui, com o Asp227 em α5), mas, adicionalmente, é observado um fim-de interacção do grupo guanidina com um resíduo Gln (Gln221) lá 13. Assim, modificou o grupo guanidina de duas formas opostas: num caso, através do bloqueio do lado-a interacção com a metilação do δ N do grupo guanidina, e, no outro caso, com a metilação do ω guanidina N, bloqueando a interacção fim-em. Surpreendentemente, esta pequena modificação levou a uma mudança completa selectividade nos ligandos. Para além da alquilação, um novo método de funcionalização foi introduzido nesta publicação. O método clássico de funcionalização para este tipo de ligando é pentapeptidic através da conjugação da cadeia lateral de um aminoácido que não estão envolvidos na ligação (por exemplo, K em C (RGDfK)) 14, 15. Aqui,mostramos que funcionalização também é possível pela modificação da guanidina - que é crucial para a ligação - com um grupo acilo ou um ligante alquilado. A carga positiva que é essencial para a ligação é retida, e modelos sugerem que as longas pontos de cadeia para fora da bolsa de ligação, proporcionando, assim, uma possibilidade ideal para a fixação de outros ligantes e rotulagem de unidades (por exemplo, um marcador fluorescente ou um quelante para molecular imagiologia).

Neste trabalho, nós concentrar-se nos passos preparativos para a modificação do grupo guanidina em ligandos contendo arginina. Isto envolve a síntese de N-metilada ω espécies, assim como guanidinas com unidades ligantes mais longas. As diferentes modificações compreendem grupos acilo e alquilo.

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Protocol

Nota: Todos os reagentes e solventes foram obtidos de fornecedores comerciais e foram utilizados sem purificação adicional.

Atenção: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Utilize todos os equipamentos de segurança adequada ao realizar sínteses químicas (por exemplo, da hotte, óculos de protecção, luvas, revestimento do laboratório, calças de comprimento total, e sapatos fechados).

1. Síntese de precursores Guanidinylation

  1. espécies alquilados
    1. espécies metiladas
      1. Dissolve-se 1,0 g de N, N '-di-Boc-1 H-pirazole-1-carboxamidina (3,2 mmol, 1 eq.) E 1,0 g de trifenilfosfina (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) Em 10 mL de seco tetra-hidrofurano (THF) num balão de fundo redondo de 50 mL sob uma atmosfera inerte usando um septo de borracha, à temperatura ambiente (RT). Adicionar 194 mL de metanol seco usando uma seringa (4,8 mmol, 1,5 eq.) E let-lo agitar temperatura ambiente.
      2. Separadamente, preparar uma solução com 747 mL de azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) Em 2 mL de THF seco num frasco pequeno de vidro. Enquanto se agita, adicionar a solução de DIAD em THF gota a gota à solução de N, W-di-Boc-1 H-pirazole-1-carboxamidina N ', PPh3, e metanol, utilizando uma seringa (ao longo de 15 min). Deixe a solução agitar durante 2 h à TA.
      3. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo e dissolve-se o produto em bruto em 1 mL de diclorometano (DCM). Carregar uma coluna de flash (2,5 cm x 20 cm) com 100 g de sílica em 10% de acetato de etilo (EtOAc) em uma solução de pentano. Carregar o produto bruto dissolvido na coluna e adicionar o solvente sob pressão (1,5 bar).
      4. Recolher as fracções (sistema solvente: isocrico 10% de EtOAc em pentano), identificar o ponto composto desejado por cromatografia em camada fina (TLC), e recolhê-la (R f = 0,4, EtOAc / pentano 1: 9, UV). Combine o desejadofracções e evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter 0,85 g do composto do título como um óleo amarelo, viscoso (rendimento de 2,6 mmol, 81%). Armazenar o composto originou à temperatura ambiente para utilização posterior.
    2. Espécies modificadas-hexilamina
      1. Dissolve-se 1,0 g de N, N '-di-Boc-1 H-pirazole-1-carboxamidina (3,2 mmol, 1,0 eq.), 0,9 g de Dde-6-amino-hexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.), E 1,0 g de PPh3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) em 10 mL de THF seco num frasco de fundo redondo de 50 ml, em atmosfera inerte usando um septo de borracha, à TA.
      2. Separadamente, preparar uma solução com 747 mL de DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) Em 2 mL de THF seco num frasco pequeno de vidro. Enquanto se agita, adicionar a solução de DIAD em THF gota a gota à solução de N, N '-di-Boc-1 H-pirazole-1-carboxamidina, PPh3, e Dde-6-amino-hexanol utilizando uma seringa (ao longo de 15 min) . Deixe a solução agitar durante 2 h à TA.
      3. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo e tomar o produto bruto acima em 1 mL de DCM. Carregar uma coluna de flash (2,5 cm x 20 cm) com 100 g de sílica em uma solução de pentano / EtOAc (2: 1). Aplicar o produto bruto dissolvido na coluna e adicionar solvente sob pressão (1,5 bar).
      4. Recolher as fracções (sistema solvente: isocrática 2: 1 pentano / EtOAc), identificar as fracções desejadas com TLC, e recolhê-las (Rf = 0,66, 2: 1 pentano / EtOAc, UV). Combinam-se as fracções desejadas e evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter 1,6 g do composto do título como um óleo amarelo, viscoso (rendimento de 2,8 mmol, 88%). Armazenar o composto originou à temperatura ambiente para utilização posterior.
  2. Espécies acilados (2 passos reaccionais)
    1. Dissolve-se 1,4 g de S hemissulfato -methylisothiuronium (10 mmol, 1,0 eq.) E 2,2 g de dicarbonato de di (terc-butil) dicarbonato (10 mmol, 1,0 eq.) Em uma vigorosamente agitaranel solução bifásica de DCM / sat. aq. De NaHCO 3 e deixá-lo agita-se durante 24 h à TA.
    2. Separaram-se as camadas numa ampola de decantação e extrai-se a fase aquosa três vezes com DCM. Combinam-se as fases orgânicas, secam-se com Na 2 SO 4, e remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. Tome-se o produto em bruto em 1 mL de hexano.
    3. Carregar uma coluna de flash (2,5 cm x 20 cm) com 100 g de sílica em uma solução de 4: 1 hexano / EtOAc. Carregar o produto bruto dissolvido na coluna. Adicionar o solvente sob pressão. Identificar as fracções desejadas com TLC (sistema solvente: 4: 1 isocrático hexano / EtOAc (detecção por UV: 254 nm), e recolher-los (Rf = 0,30).
    4. Combinam-se as fracções desejadas e evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter 1,1 g do composto do título como um óleo amarelo, viscoso (rendimento de 5,8 mmol, 58%). Armazenar o reagente, N - (terc-butoxicarbonil) - S -methylisothiourea, à temperatura ambiente para utilização posterior.
    5. Dissolve-se 250 mg de N - (terc-butoxicarbonil) - S-metilisotioureia (1,3 mmol, 1,0 eq.) Em 10 mL de N, N- dimetilformamida seca (DMF) num balão de fundo redondo de 50 mL sob uma atmosfera inerte, a RT. Adicionar 440 uL de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) (2,6 mmol, 2 eq.), Utilizando uma seringa. Enquanto se agita, adicionar 245 mL de Ac2O (5,2 mmol, 4,0 eq.) Gota a gota usando uma seringa e deixá-lo agitar durante 1 h à TA.
    6. Adicionar um excesso de metanol (2 mL) à mistura, utilizando uma seringa e deixá-lo agita-se durante 15 min à temperatura ambiente. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. Tome-se o produto em bruto em 1 ml de DCM.
    7. Carregar uma coluna de flash (2,5 cm x 20 cm) com 60 g de sílica em uma solução de 3: 1 hexano / EtOAc a 3: 1. Aplicar o produto em bruto dissolvido para a coluna. Adicionar solvente (3: 1 hexano / EtOAc) e pressão (1,5 bar). Identificar as fracções desejadas por TLC (3: 1 hexano / EtOAc, UV: 220 nm), e colLect los (Rf = 0,62).
    8. Combinam-se as fracções desejadas e evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter 210 mg do composto do título como um sólido branco (rendimento 0,9 mmol, 70%). Armazenar o composto à temperatura ambiente para utilização posterior.

2. Síntese de Peptídeos Cíclicos Precursores

  1. Carregamento e nivelamento resina TCP
    1. Adicionar 1,00 g de cloreto de (CTC) de resina 2-chlortriyl (0,9 mmol / g) e 320 mg de Fmoc-Gli-OH (1,2 eq.) Em uma seringa de plástico de 20 ml com uma frita. Prepara-se uma solução de 313 ul de DIPEA (2 eq.) Em 5 mL de DCM seco e adicioná-lo à seringa. Deixá-lo girar durante 1 hora a RT utilizando um aparelho rotativo.
    2. Enquanto isso, preparar uma solução de 2 ml de 5: 1 de metanol / DIPEA (v / v; solução capping). Adicionar a solução de capeamento para a seringa e deixá-lo girar durante mais 15 min. Lava-se a resina com DCM (5x) e DMF (3x).
  2. Por desprotecção de Fmoc-resina
    1. Tratar o ligado a resina Fmoc-Gly com 20% de piperidina em DMF durante 10 min e, em seguida, durante 5 min. Lava-se a resina com DMF (3x).
  3. Sobre resina de acoplamento de Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Adicionar 934 mg de Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 eq.), 684 mg de 1- [bis (dimetilamino) metileno] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] piridínio hexafluorofosfato de 3-óxido (HATU) (2 eq.), e 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt) (2 eq.) para um frasco pequeno de vidro e dissolvê-la em 5 mL de DMF. Adicionar 814 ul de DIPEA.
    2. Adicionar esta solução ao Gli Fmoc-desprotegida, lavado, e ligado a resina e deixá-lo girar durante 1 h. Lava-se a resina com DMF (3x).
  4. Por desprotecção de Fmoc-resina
    1. Tratar o ligado a resina de Fmoc-Orn (Dde) -Gly com 20% de piperidina em DMF durante 10 min e, em seguida, durante 5 min. Lava-se a resina com DMF (3x).
  5. Acoplamento em resina de Fmoc-Val-OH
    1. Adicionar 610 mg de Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), E 245 mg de HOAt (2 eq.) Para um frasco pequeno de vidro e dissolvê-la em 5 mL de DMF. Adicionar 814 ul de DIPEA.
    2. Adicionar esta solução à Fmoc-desprotegida, lavado, e Orn ligado a resina (Dde) -Gly e deixá-lo girar durante 1 h.
  6. Por desprotecção de Fmoc-resina
    1. Tratar o ligado a resina de Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly com 20% de piperidina em DMF durante 10 min e, em seguida, durante 5 min. Lava-se a resina com DMF (3x).
  7. Em-resina N- metilação
    1. Lava-se a resina com DCM (3x). Dissolve-se 887 mg de 2-nitrobenzenossulfonilo (o -NBS-Cl, 4 eq.) Em DCM e adicionar 1,2 mL de 2,4,6-colidina (10 eq.).
    2. Adicionar a solução do péptido ligado à resina e deixou-se incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
    3. Lava-se a resina com CH 2 Cl 2 (3x) e com THF (5x). Prepara-se uma solução com 1,18 g de PPh3 (5 eq.) E 365 uL de metanol em THF. Adicione esta solução para oseringa.
    4. Prepara-se uma solução com 883 mL de DIAD em 2 mL de THF e adicioná-lo à seringa. Deixe que incube durante 15 min. Lava-se a resina com THF (5x) e com DMF (5x).
  8. O -ns desprotecção
    1. Prepara-se uma solução com 570 mL de mercaptoetanol (10,0 eq.) E 672 uL de diazabicycloundecen (DBU) em 2 mL de DMF. Adicionar esta solução para a seringa e deixá-lo incubar durante 5 min.
    2. Repetir o passo de desprotecção e, em seguida, lava-se a resina com DMF (5x).
  9. Acoplamento em resina de Fmoc-d-Phe-OH
    1. Adicionar 697 mg de Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), E 245 mg de HOAt (2 eq.) Para um frasco pequeno de vidro e dissolvê-la em 5 mL de DMF . Adicionar 814 ul de DIPEA.
    2. Adicionar esta solução para o péptido Fmoc-desprotegida, lavado, e ligado a resina e deixá-lo girar durante 1 h.
  10. Por desprotecção de Fmoc-resina
    1. Tratar a resina-bound péptido com 20% de piperidina em DMF durante 10 min e, em seguida, durante 5 min. Lava-se a resina com DMF (3x).
  11. Acoplamento em resina de Fmoc-Asp (OtBu) -OH
    1. Adicionar 741 mg de Fmoc-Asp (OtBu) -OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), E 245 mg de HOAt (2 eq.) Para um frasco pequeno de vidro e dissolvê-la em 5 mL de DMF. Adicionar 814 ul de DIPEA.
    2. Adicionar esta solução para o péptido Fmoc-desprotegida, lavado, e ligado a resina e deixá-lo girar durante 1 h.
  12. A clivagem do péptido linear da resina
    1. Lava-se a resina com DCM (3x) e subsequentemente preparar 10 mL de uma solução de hexafluoroisopropanol (HFIP) em DCM (1: 4; v / v).
    2. Adicionar a solução para a resina e deixá-lo girar durante 15 min. Recolher a solução em um balão de fundo redondo. Repetir a clivagem e evapora-se o solvente usando um evaporador rotativo.
  13. A ciclização do peptídeo linear
    1. dissolve 384 mg de NaHCO3 (5,0 eq.) e 582 ul de azida de difenilfosforilo (DPPA) (3,0 eq.) em 50 mL de DMF e adicionar-se ao produto bruto. Deixe que agitar durante a noite ou até que nenhum péptido linear é observado com ESI-MS (10 h) 17.
    2. Sob pressão reduzida, reduzir o solvente para um pequeno volume usando um evaporador rotativo. Prepara-se uma solução aquosa saturada de NaCl (salmoura). Usando uma pipeta de Pasteur, adicionar gota a gota o péptido ciclizado para 40 mL de solução aquosa saturada de NaCl em um tubo de centrífuga.
    3. Centrifugar a suspensão (5000 xg, 5 min) e lavar o precipitado com água de grau HPLC (2x). Liofiliza o produto.

3. Guanidinylation e desprotecção em Solução

  1. Guanidinylation com os precursores sob medida
    1. Dissolve-se uma pequena quantidade (por exemplo, 25 mg) do péptido cíclico desprotegido ortogonalmente num pequeno volume de DMF (por exemplo, 2 mEU). Adicionar 2 eq. do precursor guanidinylation e 2 eq. de DIPEA para a solução e deixá-lo agita-se durante 2 h à TA.
    2. Monitorizar o progresso da reaco por HPLC-MS. Depois da reacção estar completa, remover o, re-dissolve-se o péptido cíclico guanidinylated solvente em acetonitrilo, e realizar a purificação por HPLC semi-preparativa de 16.
  2. A remoção dos grupos de protecção ácido lábil cadeia lateral
    1. Preparar 2 ml de uma solução contendo ácido trifluoroacético (TFA), água, e triisopropilsilano (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Adicionar esta solução para o produto purificado num pequeno frasco de vidro e deixou-agitar temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Observar a desprotecção completa com ESI-MS 17.
    2. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida para um pequeno volume. Prepare éter arrefecido com gelo e adicionar 10 ml num tubo de centrífuga de 50 mL. Precipitar o péptido desprotegido em éter arrefecido em gelo, utilizando uma pipeta Pasteur, adicionando-gota a gota. Centrifugar a suspensão (5000 xg, 5 min) para obter um pelete.
    3. Lavar o precipitado com éter arrefecido com gelo e centrifugar-lo (5000 xg, 5 min, 2x). Dissolve-se o produto em 2 mL de água de grau HPLC e purificá-lo por HPLC semi-preparativa de 16.

4. Dados e Parâmetros para purificação Analítica

  1. CLAP analítica-EM-IEP
    1. Executar analítica de HPLC-ESI-MS com um espectretro de massa LCQ utilizando uma coluna C18 (tamanho de 12 nm de poro, o tamanho de partículas 3 mícrons, 125 milímetros x 2,1 milímetros) ou uma coluna C8 (tamanho de poro de 20 nm, de partícula de 5 mícrons tamanho, 250 mm x 2,1 milímetros), com H2O (0,1% v / v ácido fórmico) / acetonitrilo (0,1% v / v ácido fórmico) como eluentes.
  2. HPLC semi-preparativa
    1. Realizar HPLC semi-preparativa usando um instrumento de HPLC preparativa com uma coluna ODS-A (20 x 250 mm, 5), uma taxa de fluxo de 8 mL / min, e os gradientes linearesde H 2 O (0,1% v / v de TFA) e acetonitrilo (0,1% v / v de TFA).

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Representative Results

O precursor peptico clico foi sintetizado como um péptido linear, ciclizado, e ortogonalmente Dde-desprotegido. Após a precipitação, a pureza do composto foi analisada com HPLC-MS (Figura 1). Para monitorizar o progresso da reacção, a análise por HPLC foi realizada após o tempo de reacção de 2 h (Figura 2).

Para resíduos maiores no grupo guanidina, o tempo de reacção de 2 h muitas vezes não é suficiente. Neste caso, a reacção foi continuada e controlada com LC-MS. Depois da reacção e desprotecção final, os compostos foram purificados utilizando equipamento de HPLC semi-preparativa (rendimentos tipicamente na gama baixa mg). Os compostos finais foram analisados por HPLC-MS para avaliar o grau de pureza (ver Figura 3).

Uma pequena quantidade foi pesado num tubo de microcentrífuga e diluída com DMSO para se obter uma solução de haste para a avaliação biológica do composto em, um ensaio de ligação em fase sólida do tipo ELISA. Os resultados estão representados na Figura 4. A molécula padrão Cilengitida (grupo guanidina não modificada) é incluído como referência. Todos os compostos possuem uma elevada afinidade relativa para o? V? 3 integrina subtipo e elevada selectividade contra α5β1.

figura 1
Figura 1: HPLC-MS espectro (gradiente: 10-90% de acetonitrilo (ACN) em um sistema solvente bifásico com H2O e ACN) do ortogonalmente Dde-desprotegido c derivado (OrnGD (OtBu) f (N Me) V ) (massa calculada: 602,34 g / mol), tal como obtida depois da ciclização do péptido linear, subsequente Dde-desprotecção, e precipitação.ank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: o espectro de HPLC-MS (gradiente: 10-90% de ACN em um sistema solvente bifásico com H2O e ACN) da mistura de reacção após a reacção guanidinylation do péptido cíclico desprotegido e ortogonalmente o precursor metilado para guanidinylation. Além do pico do produto (Rt = 7,50 min, massa calculada = 858,49 g / mol), apenas o excesso de precursor guanidinylation (Rt = 6,38 min) e a base de DIPEA (Rt = 0,90 min) pode ser observada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: HPLC-MS espectro (gradiente: 10-90% de ACN em um sistema solvente bifásico com H2O e ACN) do composto bruto 2 (R t = 3,69 min, massa calculada = 603,32 g / mol) após a desprotecção das cadeias laterais lábeis ácidos anteriores para a purificação do semi-preparativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Funcionalização de guanidinas em solução e avaliação biológica. Composto 1, com um grupo de guanidina inalterada, é Cilengitida. As modificações abordados neste manuscrito são o (2) metilado, funcionalizado (aqui, acetil amino hexano; 3), e (4) os derivados acetilados. Tele afinidade de ligação foi determinada num ensaio de ligação em fase sólida, utilizando proteínas isoladas 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O precursor para guanidinylation é um derivado de péptido cíclico desprotegido ortogonalmente, (C (OrnD (OtBu) Gf (N Me) V)), que é sintetizado por um protocolo Fmoc padrão de síntese de péptidos em fase sólida (SPPS). Ornithin foi utilizada como o derivado protegido ortogonalmente, (Fmoc-Orn (Dde) -OH), que pode ser desprotegido com hidrazina em DMF, após a ciclização do esqueleto de péptido. O precursor do péptido é purificado por precipitação do composto e pela subsequente liofilização.

Precursores alquilados para o guanidinylation podem ser obtidos com bons rendimentos, numa reacção de um passo a partir da substância disponível comercialmente N, N?-Boc-1 -di-pirazole-1-carboxamidina através de uma reacção de alquilação sob condições de Mitsunobu (PPh3 , DIAD, THF) 19, 10. Com esta reação, uma enorme variedade de precursores é accessible a partir dos álcoois correspondentes. A reacção guanidinylation com os precursores alquilados produz o produto definido em uma reacção limpa. Se a conversão completa do reagente não é observada após 2 h, a reacção deve ser continuada. Sob as condições indicadas no protocolo, os produtos secundários formados apenas pequenas; no entanto, quantidades mais elevadas de impurezas que não podem ser excluídos para todos, especialmente diferentemente protegidos, substratos portadores de porções maiores.

Se utilizando péptidos funcionalizados-guanidina (ligantes mais longos), o grupo de protecção Dde na amina terminal do ligante é removido e podem ser conjugados por meio de acoplamento de amida a um ácido correspondente. A desprotecção de Dde é realizada numa solução de 2% de hidrazina em DMF e produz o péptido desprotegido ortogonalmente, que deve ser purificado (por exemplo, por HPLC semi-preparativa) antes de posterior utilização. Neste caso, uma simples reacção de acetilação foi realizada in situ.

E seusando guanidinas acetilados, uma estratégia diferente precursor devem ser aplicados. Começando a partir de S-metilisotioureia, uma sequência de reacção em dois passos é necessário 20. Em primeiro lugar, um mono protecção Boc da S-metilisotioureia deve ser realizado antes de 21 de acetilação com um ácido de escolha (aqui, ácido acético). A reacção guanidinylation é uma reacção muito limpa e rápida, o composto final é obtido após a desprotecção final dos grupos de protecção ácido lábil de cadeia lateral.

Como já indicado na introdução, este método permite a modificação e funcionalização de um grupo guanidina peptídico. Nós demonstramos esta técnica em ligandos de integrina, que permitem que, neste caso, a sintonização do subtipo selectividade dos ligandos. O Cilengitida antagonista de integrina não modificada é biselective para os subtipos de? V? 3 / α5β1. Através da metilação do terminal N ωo grupo guanidina, um ligando de? v? 3-selectiva é cedida. Isto bloqueia uma interacção importante ponta em que é observado exclusivamente no α5β1, inactivando assim o ligando para esta integrina. A interacção principal com o local de ligação da aVp3 subtipo é um fim-de interacção que não é perturbado por esta interacção 10.

Ao modificar o ligando com unidades ligantes mais longas ( "funcionalização"), dois objectivos pode ser alcançado de uma só vez: selectividade é gerado através de quebrar o fim-em interacção com o subtipo α5β1 e, por outro lado, os pontos ligantes para fora do bolsa de ligação, permitindo a conjugação com grandes entidades (por exemplo, quelatos ou corantes fluorescentes para técnicas de imagem) 10.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

TGK reconhece a Escola Internacional de Ciências e Engenharia (IGGSE) da Technische Universität München pelo apoio financeiro. HK reconhece o Centro de Proteína Integrada Ciência Munique (CIPSM) pelo seu apoio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

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References

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Biochemistry 122 Edição guanidina arginina péptidos modificação guanidinylation alquilação de Mitsunobu
Modificação e funcionalização do Grupo de guanidina por precursores sob medida
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