Summary
Протокол для синтеза алкильных-модифицированных гуанидин, основанных на использовании соответствующих предшественников представлен.
Abstract
Группа гуанидин является одним из наиболее важных фармакофорных групп в медицинской химии. Только аминокислоты, несущая группу гуанидин представляет собой аргинин. В этой статье, простой способ для модификации гуанидин группы в пептидных лигандах обеспечиваются, с примером RGD-связывающим интегриными лигандов. Недавно было показано , что отличие модификация группы гуанидина в этих лигандов позволяет селективной модуляции подтипа (например, между подтипами αv и а5). Кроме того, ранее неизвестная стратегия для функционализации через группу гуанидин была продемонстрирована, и синтетический подход рассматривается в данном документе. Модификации , описанные здесь , включают терминально (N ω) алкилированная и ацетилированный гуанидин группу. Для синтеза, индивидуальные молекулы-предшественники синтезируются, которые затем подвергают реакции с ортогонально разблокированному амина, чтобы передать предварительно-modified гуанидин группа. Для синтеза алкилированных гуанидин, предшественники на основе N, N'-ди-Вос-1Н - пиразол-1-карбоксамидин используется для синтеза ацилированных соединений, предшественник выбора того , чтобы быть соответствующим образом ацилированной производным N -Boc- S - метилизотиомочевины, которые могут быть получены в одно- и двухступенчатых реакций.
Introduction
Среди наиболее распространенных фармакофорных групп в природных лигандов представляет собой гуанидина группу, которая участвует в множественных взаимодействий 1, 2. Например, она служит в качестве потенциального четырехкратным донора водорода при взаимодействии водородной связи и участвует в электростатических взаимодействиях, такие как солевые мостики или катион-π взаимодействий. В медицинской химии, эта группа часто встречаются в лекарственных препаратах и лекарственных средств - кандидатах 4, хотя и очень часто , как гуанидин миметики 5, 6. Причиной развития гуанидина миметиков является удаление повсеместной, положительно заряженного гуанидина группы, а также регулировка липофильности лиганда. В пептидных лигандов, единственный гуанидина, содержащий группу-аминокислота представляет собой аргинин, который, следовательно, часто встречается в биоактивного области пептидных лигандов.
Очень прominent примером для аргинин-содержащий лиганд семейства является подсемейство из RGD-связывающих интегринов. В общем, интегрины являются классом рецепторов клеточной адгезии, которые принимают более важные функции во всех высших организмов. Некоторые из этих функций включают клеточную адгезию, миграцию и выживание клеток. Таким образом, они также участвуют в патологических признаков, таких как рак и фиброз. Интегрины представляют собой трансмембранные белки гетеродимерных, состоящие из альфа- и бета-субъединицы, которые образуют 24 известных в настоящее время интегрина подтипов; 8 из них признают последовательность трипептида Arg-Gly-Asp (RGD) = в их лигандов 7. Область связывания расположена на границе между этими двумя подтипами во внеклеточной части, так называемого интегрина головной группы 8. РГД признана двух общих взаимодействий: металл-ион-зависимой адгезии сайта (MIDAS) область, которая находится в бета-субъединицы, и который связывает карбоновую кислоту в лигандов (боковые чав АСП); и гуанидин группа лигандов, которая находится в альфа-субъединицы. Большинство интегринов подтипов неразборчивы и разделяют по крайней мере часть их естественного внеклеточного матрикса (ЕСМ) лигандами 9. Таким образом, для развития искусственных интегрина лигандов, основное внимание, помимо высокой аффинности связывания, подтип селективности. Недавно мы смогли раскрыть ключевой элемент для генерации подтипа селективных лигандов: в группу гуанидина. Через различных модификаций, biselective лиганды αv- и а5-содержащие интегрин подтипов может быть превращена в селективные соединения путем простых модификаций на гуанидин группы, которые затем могут различать различные α-субъединиц 10.
В кармане αv, группа гуанидин взаимодействует бок о бидентатном через солевой мостик с Asp218 11, 12. Это взаимодействие стакже наблюдается в α5β1 (здесь, с Asp227 в а5), но , кроме того, там наблюдается 13 конечный на взаимодействии группы гуанидина с остатком Gln (Gln221). Таким образом, мы модифицировали группу гуанидина в двух противоположных направлениях: в одном случае, путем блокирования бок о взаимодействии с метилирования N б группы гуанидина, и в другом случае, с метилирования гуанидин N со, блокируя взаимодействие с торца. Удивительно, но эта небольшая модификация привела к полному смещению селективности в лигандах. В дополнении к алкилированию, новый метод функционализации был введен в данной публикации. Классический метод функционализации для этого типа pentapeptidic лиганда через боковой цепи сопряжения аминокислоты не участвуют в связывании (например, К в с (RGDfK)) 14, 15. Вот,мы покажем, что функционализации также возможны путем модификации гуанидина - которая имеет решающее значение для связывания - с ацил или алкилированным линкером. Положительный заряд , что имеет важное значение для связывания сохраняется, и модели показывают , что длинные точки цепи из кармана связывания, обеспечивая тем самое идеальную возможность для крепления дополнительных линкеров и маркировка единиц (например, флуоресцентная метка или хелатор для молекулярного томография).
В этой работе, мы сосредоточиться на препаративных шагов для модификации группы гуанидина в аргинин-содержащих лигандов. Это предполагает синтез N со | -methylated видов, а также гуанидины с более длинными единицами компоновщика. Различные модификации включают ацильные и алкильные группы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все реагенты и растворители были получены от коммерческих поставщиков и использовались без дополнительной очистки.
Внимание: Пожалуйста , обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Пожалуйста , используйте все необходимые средства индивидуальной защиты при выполнении химических синтезов (например, вытяжку, защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полнометражные брюки и закрытую обувь).
1. Синтез Guanidinylation предвестников
- алкилированные виды
- метилированные виды
- Растворить 1,0 г N, N'-ди-Вос-1Н - пиразол-1-карбоксамидин (3,2 ммоль, 1 экв.) И 1,0 г трифенилфосфина (PPh 3, 3,8 ммоль, 1,2 экв.) В 10 мл сухого тетрагидрофуран (ТГФ) в 50-мл круглодонную колбу в инертной атмосфере с использованием резиновой пробкой при комнатной температуре (RT). Добавьте 194 мкл сухого метанола с помощью шприца (4,8 ммоль, 1,5 экв.) И ли др это перемешивают при комнатной температуре.
- Отдельно готовят раствор с 747 мкл диизопропилазодикарбоксилата (DIAD, 3,8 ммоль, 1,2 экв.) В 2 мл сухого ТГФ в небольшой стеклянной пробирке. При перемешивании добавляют раствор DIAD в ТГФ по каплям к раствору N, N'-ди-Вос-1Н - пиразол-1-карбоксамидин, PPh 3 и метанола с помощью шприца (более 15 мин). Пусть размешать раствор в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя и растворить неочищенный продукт в 1 мл дихлорметана (ДХМ). Загрузка флэш-колонку (2,5 см х 20 см) с 100 г кремнезема в 10% этилацетата (EtOAc) в растворе пентан. Загрузить растворенный сырой продукт на колонке и добавить растворитель под давлением (1,5 бар).
- Собирают фракции (системы растворителей: изократическая 10% EtOAc в пентане), определить желаемое соединение пятно с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), и собирают его (R F = 0,4, EtOAc / пентан 1: 9, УФ). Объединить желаемыйфракции и выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя с получением 0,85 г указанного в заголовке соединения в виде желтого вязкого масла (выход 2,6 ммоль, 81%). Хранить дает соединение при КТ для дальнейшего использования.
- Гексиламин-модифицированные виды
- Растворить 1,0 г N, N'-ди-Вос-1Н - пиразол-1-карбоксамидин (3,2 ммоль, 1,0 экв.), 0,9 г Dde-6-аминогексанол (3,8 ммоль, 1,2 экв.), И 1,0 г из PPh 3 (3,8 ммоль, 1,2 экв.) в 10 мл сухого ТГФ в 50-мл круглодонную колбу в инертной атмосфере с использованием резиновой перегородки при комнатной температуре.
- Отдельно готовят раствор с 747 мкл DIAD (3,8 ммоль, 1,2 экв.) В 2 мл сухого ТГФ в небольшой стеклянной пробирке. При перемешивании добавляют раствор DIAD в ТГФ по каплям к раствору N, N'-ди-Вос-1Н - пиразол-1-карбоксамидин, PPh 3, и ДДЭ-6-аминогексанол с помощью шприца (более 15 мин) , Пусть размешать раствор в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя и взять неочищенный продукт вверх в 1 мл ДХМ. Загрузка флэш-колонку (2,5 см х 20 см) с 100 г кремнезема в растворе пентан / EtOAc (2: 1). Нанесите растворенный неочищенный продукт на колонке и добавить растворитель под давлением (1,5 бар).
- Сбор фракций (системы растворителей: изократическая 2: 1 пентан / EtOAc), определить желаемые фракции с ТСМ, и собирать их (R F = 0,66, 2: 1 пентан / EtOAc, УФ). Зерноуборочный целевых фракций и выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя с получением 1,6 г указанного в заголовке соединения в виде желтого вязкого масла (выход 2,8 ммоль, 88%). Хранить дает соединение при КТ для дальнейшего использования.
- метилированные виды
- Ацилированный вид (2 стадии реакции)
- Растворить 1,4 г S -methylisothiuronium полусульфата (10 ммоль, 1,0 экв.) И 2,2 г ди (трет - бутил) бутилдикарбоната (10 ммоль, 1,0 экв.) В энергично перемешатькольцо двухфазный раствор DCM / насыщ. водн. Раствором NaHCO 3 и пусть это перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре.
- Разделяют слои в делительную воронку и экстрагируют водную фазу три раза ДХМ. Органические фазы объединяют, сушат их с помощью Na 2 SO 4 и удаляют растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя. Возьмем сырой продукт вверх в 1 мл гексана.
- Загрузка флэш-колонку (2,5 см х 20 см) с 100 г кремнезема в растворе 4: 1 гексан / EtOAc. Загрузить растворенный сырой продукт на колонке. Добавить растворитель под давлением. Определение целевых фракций с системой растворителей (ТСХ: 4: 1 изократическая гексан / EtOAc (УФ - детектор: 254 нм), и собирают их (R = 0,30).
- Зерноуборочный целевых фракций и выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя с получением 1,1 г указанного в заголовке соединения в виде желтого вязкого масла (выход 5,8 ммоль, 58%). Хранить реагент, N - (трет - бутоксикарбонил) - S -methylisothiourea, при комнатной температуре для дальнейшего использования.
- Растворяют 250 мг N - (трет - бутоксикарбонил) - S -methylisothiourea (1,3 ммоль, 1,0 экв.) В 10 мл сухого N, N - диметилформамид (ДМФ) в 50-мл круглодонную колбу в инертной атмосфере при RT. Добавьте 440 мкл N, N-диизопропилэтиламин (DIPEA) (2,6 ммоль, 2 экв.) С помощью шприца. При перемешивании добавляют 245 мкл Ac 2 O (5,2 ммоль, 4,0 экв.) По каплям с помощью шприца и пусть это перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Добавить избыток метанола (2 мл) к смеси с использованием шприца и пусть это перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя. Возьмем сырой продукт вверх в 1 мл ДХМ.
- Загрузка флэш-колонку (2,5 см х 20 см) с 60 г диоксида кремния в растворе 3: 1 гексан / EtOAc 3: 1. Нанесите растворенный сырой продукт в колонну. Добавить растворитель (3: 1 гексан / EtOAc), и давление (1,5 бар). Определение целевых фракций с ТСХ (3: 1 гексан / EtOAc, УФ: 220 нм), и ColLect их (R F = 0,62).
- Зерноуборочный целевых фракций и выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя с получением 210 мг указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (выход 0,9 ммоль, 70%). Хранить соединение при комнатной температуре для дальнейшего использования.
2. Синтез циклического пептида предвестников
- Загрузка и укупорки TCP смолы
- Добавить 1,00 г 2-chlortriyl хлорид (СТС) смолы (0,9 ммоль / г) и 320 мг Fmoc-Gly-OH (1,2 экв.) В пластиковый 20-мл шприц с фритте. Готовят раствор 313 мкл DIPEA (2 экв.) В 5 мл сухого дихлорметана и добавить его в шприц. Пусть она вращается в течение 1 ч при комнатной температуре с использованием роторного аппарата.
- В то же время, приготовить раствор 2-мл 5: 1 метанол / DIPEA (об / об; укупорки раствор). Добавьте укупорки решения шприца и дайте ему вращаться еще в течение 15 мин. Промыть смолы с DCM (5x) и ДМФ (3x).
- На смолы Fmoc снятия защиты
- Treat связанного со смолой Fmoc-Gly с 20% пиперидином в ДМФ в течение 10 мин и затем в течение 5 мин. Промыть смолу с ДМФА (ой).
- На смоле муфты из Fmoc-Orn (DDE) -OH
- Добавить 934 мг Fmoc-L-Orn (DDE) -ОН (2 экв.), 684 мг 1- [бис (диметиламино) метилен] -1 - 1,2,3-триазол [4,5-Ь] пиридиний 3-оксидной гексафторфосфат (HATU), (2 экв.), и 245 мг 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt) (2 экв.) в небольшой стеклянный флакон и растворить его в 5 мл ДМФ. Добавить 814 мкл DIPEA.
- Добавьте это решение Fmoc-разблокированному, промывают и смолу Gly и пусть он вращается в течение 1 часа. Промыть смолу с ДМФА (ой).
- На смолы Fmoc снятия защиты
- Treat связанного со смолой Fmoc-Orn (DDE) -Gly с 20% пиперидином в ДМФ в течение 10 мин и затем в течение 5 мин. Промыть смолу с ДМФА (ой).
- На смоле связь Fmoc-Val-OH
- Добавьте 610 мг Fmoc-Val-OH (2 экв.), 684 мг HATU (2 экв.), И 245 мг HOAt (2 экв.) В небольшую стеклянную пробирку и растворить ее в 5 мл ДМФ. Добавить 814 мкл DIPEA.
- Добавьте это решение Fmoc-защитную группу, промывают и связанный со смолой Орн (DDE) -Gly и пусть он вращается в течение 1 часа.
- На смолы Fmoc снятия защиты
- Treat связанного со смолой Fmoc-Val-Orn (DDE) -Gly с 20% пиперидином в ДМФ в течение 10 мин и затем в течение 5 мин. Промыть смолу с ДМФА (ой).
- На смоле N - метилирования
- Промыть смолы с DCM (3х). Растворяют 887 мг 2-nitrobenzenesulfonylchloride (о -NBS-Cl, 4 экв.) В DCM и добавляют 1,2 мл 2,4,6-коллидин (10 экв.).
- Добавить раствор для пептида связанных со смолой, и пусть он инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Промыть смолу с CH 2 Cl 2 (3 ×) и ТГФ (5х). Готовят раствор с 1,18 г PPh 3 (5 экв.) И 365 мкл метанола в ТГФ. Добавьте это решениешприц.
- Готовят раствор с 883 мкл DIAD в 2 мл ТГФ и добавить его в шприц. Пусть инкубировать в течение 15 мин. Промыть смолу с ТГФ (5x) и ДМФ (5x).
- о -ns снятие защиты
- Готовят раствор с 570 мкл меркаптоэтанола (10,0 экв.) И 672 мкл diazabicycloundecen (ДБУ) в 2 мл ДМФ. Добавьте этот раствор в шприц и дайте ему инкубировать в течение 5 мин.
- Повторите шаг удаления защитной группы и затем промыть смолу с ДМФА (ой).
- На смоле связывание Fmoc - D-Phe-OH
- Добавьте 697 мг Fmoc-D-Phe-OH (2 экв.), 684 мг HATU (2 экв.), И 245 мг HOAt (2 экв.) В небольшую стеклянную пробирку и растворить ее в 5 мл ДМФ , Добавить 814 мкл DIPEA.
- Добавьте это решение Fmoc-разблокированному, промывают, и связанного со смолой пептида, и пусть он вращается в течение 1 часа.
- На смолы Fmoc снятия защиты
- Обрабатывают смолы-бound пептид с 20% пиперидином в ДМФ в течение 10 мин и затем в течение 5 мин. Промыть смолу с ДМФА (ой).
- На смоле связь Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH
- Добавить 741 мг Fmoc - Asp (Ot Bu) -ОН (2 экв.), 684 мг HATU (2 экв.), И 245 мг HOAt (2 экв.) В небольшую стеклянную пробирку и растворить ее в 5 мл ДМФ. Добавить 814 мкл DIPEA.
- Добавьте это решение Fmoc-разблокированному, промывают, и связанного со смолой пептида, и пусть он вращается в течение 1 часа.
- Расщепление линейного пептида от смолы
- Промыть смолы с DCM (3 раза), а затем приготовить 10 мл раствора гексафторизопропанола (HFIP) в DCM (1: 4 об / об).
- Добавьте решение смолы и дайте ему вращаться в течение 15 мин. Собирают раствор в круглодонную колбу. Повторите расщепление и выпаривания растворителя, используя роторный испаритель.
- Циклизация линейного пептида
- диssolve 384 мг NaHCO 3 (5,0 экв.) и 582 мкл дифенилфосфорилазида (DPPA) (3,0 экв.) в 50 мл ДМФ и добавить его к сырому продукту. Пусть это перемешивают в течение ночи или до тех пор не линейный пептид не наблюдается с ESI-MS (10 ч) 17.
- При пониженном давлении растворитель уменьшают до небольшого объема с использованием роторного испарителя. Приготовьте насыщенный водный раствор NaCl (рассол). С помощью пипетки Пастера, добавьте по каплям циклизованного пептида 40 мл насыщенного водного раствора NaCl в центрифужной пробирке.
- Центрифуга суспензии (5000 XG, 5 мин) и промывают осадок с помощью ВЭЖХ-класса водой (2х). Лиофилизации продукт.
3. Guanidinylation и деблокирование в растворе
- Guanidinylation с специализированными прекурсорами
- Растворите небольшое количество (например, 25 мг) из ортогонально разблокированному циклического пептида в небольшом объеме ДМФА (например, 2 мЛ). Добавить 2 экв. предшественника guanidinylation и 2 экв. ДИПЭЫ к раствору и пусть перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Контроль за ходом реакции с помощью ВЭЖХ-МС. После того как реакция завершена, удалить растворитель, повторно растворить guanidinylated циклического пептида в ацетонитриле, и выполнить очистку 16 полупрепаративные ВЭОЙ.
- Удаление кислотно - лабильную защитные группы боковой цепи
- Подготовьте 2 мл раствора, содержащего трифторуксусной кислоты (TFA), вода, и триизопропилсилан (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5 об / об / об). Добавьте это решение очищенного продукта в небольшом стеклянную пробирку и пусть это перемешивают при комнатной температуре в течение не менее 1 ч. Обратите внимание на полное удаление защитных групп с ESI-MS 17.
- Выпаривают растворитель при пониженном давлении до небольшого объема. Подготовьте ледяной эфир и добавляют 10 мл в центрифужную пробирку на 50 мл. Осадить незащищенный пептид в ледяном эфире с помощью пипетки Пастера, добавив егопо каплям. Центрифуга суспензии (5000 XG, 5 мин), чтобы получить осадок.
- Промывают осадок с охлажденным льдом эфиром и центрифугировать его (5000 мкг, 5 мин, 2x). Растворить продукт в 2 мл ВЭОГО-сорт воды и очищают его с полупрепаративными ВЭЖМИ 16.
4. Аналитические данные и параметры для очистки
- Данные аналитической ВЭЖХ-ESI-МС
- Выполнение аналитической ВЭЖХ-ESI-МС с LCQ масс-спектрометра с использованием колонки С18 (12-нм пор по размерам, 3 мкм размер частиц, 125 мм × 2,1 мм) или С8 колонке (20-нм размер пор, частиц 5 мкм размер, 250 мм × 2,1 мм), с H 2 O (0,1% об / об муравьиной кислоты) / ацетонитрил (0,1% об / об муравьиной кислоты) в качестве элюентов.
- Полупрепаративные ВЭЖЙ
- Выполните полупрепаративной ВЭЖХ с использованием препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии инструмент с ODS-A колонку (20 х 250 мм, 5 мкм), скорость потока 8 мл / мин и линейных градиентовН 2 О (0,1% об / об трифторуксусной кислоте) и ацетонитрил (0,1% об / об) трифторуксусной кислоте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пептид-предшественник циклического синтезируют в виде линейного пептида, циклизуют и ортогонально Dde-деблокировали. После осаждения, чистота соединения анализировали с помощью ВЭЖХ-МС (рисунок 1). Для того, чтобы следить за ходом реакции, анализ ВЭЖХ проводили после времени реакции 2-х (рисунок 2).
Для более крупных остатков на группе гуанидина, время реакции 2 ч часто бывает недостаточно. В этом случае, реакция продолжает и контролироваться с LC-MS. После завершения реакции и окончательного удаления защитной группы, соединения очищали с помощью полупрепаративного ВЭОГО оборудования (выходы, как правило, в низких мг диапазона). Конечные соединения были проанализированы с помощью ВЭЖХ-МС для оценки чистоты (см рисунок 3).
Небольшое количество отвешивало в микроцентрифужной пробирку и разбавляет ДМСО, чтобы получить стволовое решение для биологической оценки соединения в ELISA-подобный, твердофазный анализ связывания. Результаты представлены на фиг.4. Стандартная молекула Cilengitide (немодифицированного гуанидин группа) включена в качестве ссылки. Все соединения обладают относительно высоким сродством к интегрину подтип v 3 и высокой селективности в отношении α5β1.
Рисунок 1: ВЭЖЙ-МС - спектр (градиент: 10-90% ацетонитрил (ACN) в двухфазной системе растворителей с H 2 O и ACN) из ортогонально Dde-разблокированному производной с (OrnGD (Ot - Б) F (N Me) V , ) (в расчете на массу: 602,34 г / моль), полученного после циклизации линейного пептида, последующее удаление защитных групп Dde-, и осаждение.апк "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: ВЭЖХ-МС - спектр (градиент: 10-90% ACN в двухфазной системе растворителей с H 2 O и ACN) реакционной смеси после реакции guanidinylation из ортогонально разблокированному циклического пептида и метилированного предшественника для guanidinylation. Кроме того, пик продукта (R T = 7,50 мин, вычисляется масса = 858,49 г / моль), можно наблюдать только избыток guanidinylation предшественника (R T = 6,38 мин) и базовой DIPEA (R T = 0,90 мин). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: ВЭЖХ-МС - спектр (градиент: 10-90% ACN в двухфазной системе растворителей с H 2 O и ACN) неочищенного соединения 2 (R T = 3,69 мин, вычисляется масса = 603,32 г / моль) после сн ти защиты кислотных лабильных боковых цепей до начала полупрепаративной очистки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Функционализация гуанидинов в растворе и биологической оценке. Соединение 1, с неизмененной гуанидина группы, является Cilengitide. Модификации , рассматриваемые в этой рукописи являются метилированными (2), функционализированными (здесь, ацетилом амина гексана; 3) и ацетилированным (4) производные. Tон аффинность связывания определяли в анализе связывания твердофазного с использованием изолированных белков 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предшественником guanidinylation является ортогонально деблокировали циклический пептид производного (с (OrnD (Ot - Бу) Gf (N Me) V)), который синтезировали с помощью стандартного протокола Fmoc твердофазного пептидного синтеза (SPPS). Ornithin был использован в качестве защищенного производного ортогонально, (Fmoc-Orn (DDE) -ОН), который может быть удален с гидразином в ДМФА после циклизации пептида помоста. Предшественник пептид очищают с помощью осаждения соединения и последующей лиофилизации.
Алкилированные предшественники для guanidinylation может быть получены с хорошими выходами в одностадийной реакции , начиная от коммерчески доступного вещества N, N'-ди-Вос-1Н - пиразол-1-карбоксамидин через реакцию алкилирования в условиях реакции Мицуноба (PPh 3 , ДИАД, ТГФ) 19, 10. С помощью этой реакции, огромное разнообразие прекурсоров ACCEssible из соответствующих спиртов. Реакцию guanidinylation с алкилированными предшественниками дает определенный продукт в чистой реакции. Если полное превращение реагента не наблюдается через 2 ч, реакция должна быть продолжена. В условиях, приведенных в протоколе, образуются только незначительные побочные продукты; Однако, большее количество примесей не может быть исключено для всех, особенно по-разному защищены, субстратов, несущих большие фрагменты.
При использовании гуанидин-функционализированных пептидов (длинные линкеры), то Dde защитного группы на концевой амин линкера удаляется и может быть конъюгировано с помощью амидной связи с соответствующей кислотой. Сн тие защиты DDE выполняется в растворе 2% гидразина в ДМФ и дает ортогонально незащищенное пептид, который должен быть очищен (например, полупрепаративной ВЭЖХ) перед дальнейшим использованием. В этом случае простая реакция ацетилирования была выполнена на месте.
Еслииспользуя ацетилированные гуанидин, другая стратегия предшественника должна быть применена. Начиная от S -methylisothiourea, последовательность реакции двухступенчатой требуется 20. Во- первых, моно Вос защита S -methylisothiourea должны быть выполнены , прежде чем 21 ацетилирования с кислотой выбора (здесь, уксусная кислота). Реакция guanidinylation является очень чистой и быстрой реакцией, окончательное соединение получают после окончательного удаления защитной группы в кислой среде защитных групп боковой цепи.
Как уже было сказано во введении, этот метод позволяет для модификации и функционализации любой пептидной группы гуанидина. Мы продемонстрировали эту технику на интегрин лигандов, которые позволяют, в этом случае, настройку подтипа селективности лигандов. Неизмененной антагонист интегрина Cilengitide является biselective для v 3 / α5β1 подтипов. Через метилирования терминала N со точкигуанидин группа, v 3-селективный лиганд дала. Это блокирует важный конец от взаимодействия, что однозначно наблюдается в α5β1, таким образом, инактивировать лиганд для этого интегрина. Основное взаимодействие с сайтом связывания с v 3 подтипа является конечным на взаимодействие , которое не нарушается этим взаимодействием 10.
Путем модификации лиганда с более длинными единицами компоновщика ( «функционализации»), две цели могут быть достигнуты за один раз: селективность генерируется посредством разрыва конца-на взаимодействии с α5β1 подтипа и, с другой стороны, точки компоновщика из ряда связывающий карман, что позволяет для конъюгации с большими объектами (например, энтеросорбентов или флуоресцентными красителями для методов визуализации) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
ТГК признает Международную Высшую школу по науке и технике (IGGSE) из Technische Universität München за финансовую поддержку. HK признает центр Integrated Protein Science Мюнхен (CIPSM) для их поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98% | Sigma Aldrich | 434167 ALDRICH | |
| Triphenylphosphine, 99% | Sigma Aldrich | T84409 SIGMA-ALDRICH | |
| Tetrahydrofuran, >99.5% | Carl Roth | 4745 | |
| Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% | Carl Roth | 5182 | |
| Methanol anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 322415 SIGMA-ALDRICH | |
| Diisopropyl azodicarboxylate, 98% | Sigma Aldrich | 225541 ALDRICH | |
| Dichlormethan, for synthesis, 99.5% | Carl Roth | 8424 | |
| Silica gel for flash chromtaography | Sigma Aldrich | 60738 SIGMA-ALDRICH | |
| n-Pentane, 99% | Carl Roth | 8720 | |
| n-Hexane, 99% | Carl Roth | CP47 | |
| Ethylacetate, 99.5% | Carl Roth | 7338 | |
| Aminohexanol, 95% | Sigma Aldrich | A56353 ALDRICH | |
| S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% | Sigma Aldrich | M84445 ALDRICH | |
| Di-tert-butyl dicarbonate, 99% | Sigma Aldrich | 205249 ALDRICH | |
| N,N-Dimethylformamid, 99.8% | Carl Roth | A529 | |
| N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% | Carl Roth | 2474 | |
| Acetic anhydrid, 99% | Carl Roth | 4483 | |
| Chlortrityl resin | Carbolution | CC11006 | |
| Fmoc-Gly-OH, 98% | Carbolution | CC05014 | |
| Piperidin, 99% | Sigma Aldrich | 104094 SIGMA-ALDRICH | |
| Fmoc-Orn(Dde)-OH | Iris-Biotech | FAA1502 | |
| HATU, 99% | Carbolution | CC01011 | |
| HOAt, 99% | Carbolution | CC01004 | |
| Fmoc-Val-OH | Carbolution | CC05028 | |
| 2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% | Sigma Aldrich | N11507 ALDRICH | |
| 2,4,6-Collidine, 99% | Sigma Aldrich | 27690 SIGMA-ALDRICH | |
| Mercaptoethanol, 99% | Sigma Aldrich | M6250 ALDRICH | |
| Diazabicycloundecen, 98% | Sigma Aldrich | 139009 ALDRICH | |
| Fmoc-D-Phe-OH, 98% | Sigma Aldrich | 47378 ALDRICH | |
| Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% | Carbolution | CC05008 | |
| Hexafluoroisopropanol | Carbolution | CC03056 | |
| Diphenylphosphoryl azide, 97% | Sigma Aldrich | 178756 ALDRICH | |
| TFA, 99.9% | Carl Roth | P088 | |
| Triisopropylsilan, 98% | Sigma Aldrich | 233781 ALDRICH | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Carl Roth | HN44 |
References
- Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
- Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
- Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
- Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
- Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
- Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
- Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
- Liddington, R. C.
- Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
- Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
- Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
- Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
- Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
- Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
- de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
- Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
- Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
- Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
- Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).
