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Biochemistry

Modificación y funcionalización del grupo guanidina por Precursores adaptado

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

Se presenta un protocolo para la síntesis de guanidinas modificados con alquilo basados ​​en el uso de los precursores correspondientes.

Abstract

El grupo guanidina es uno de los grupos farmacofóricos más importantes en la química medicinal. El único aminoácido que lleva un grupo de guanidina es arginina. En este artículo, se proporciona un método fácil para la modificación del grupo guanidina en ligandos peptídicos, con un ejemplo de ligandos de integrina de unión a RGD. Se ha demostrado recientemente que la modificación distinta del grupo guanidina en estos ligandos permite la modulación selectiva del subtipo (por ejemplo, entre los subtipos alpha v y α5). Por otra parte, una estrategia anteriormente desconocida para la funcionalización a través del grupo guanidina se demostró, y el enfoque sintético se revisa en este documento. Las modificaciones descritas aquí implican terminal (N ω) grupos guanidina alquiladas y acetilados. Para la síntesis, las moléculas precursoras hechos a la medida son sintetizados, que se somete luego a una reacción con una amina ortogonalmente desprotege para transferir el pregrupo guanidina -Modificado. Para la síntesis de guanidinas alquiladas, precursores basan en N, N '-Di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina se utilizan para sintetizar compuestos acilados, el precursor de elección es un derivado correspondientemente acilado de N -Boc- S - metilisotiourea, que puede ser obtenido en las reacciones de uno y de dos pasos.

Introduction

Entre los grupos farmacofóricos más abundantes en ligandos naturales es el grupo de guanidina, que está implicado en interacciones múltiples 1, 2. Por ejemplo, sirve como un potencial de cuatro veces donante de hidrógeno en las interacciones de enlaces de hidrógeno y está implicado en interacciones electrostáticas, tales como puentes de sal o interacciones de cationes π. En la química medicinal, este grupo se encuentra a menudo en las drogas y fármacos candidatos 4, aunque muy a menudo como miméticos de guanidina 5, 6. La razón para el desarrollo de miméticos de guanidina es la eliminación del grupo guanidina ubicuo, cargado positivamente, así como el ajuste de la lipofilicidad del ligando. En ligandos peptídicos, el único aminoácido que contiene un grupo de guanidina es arginina, que por lo tanto se encuentra a menudo en la región bioactiva de ligandos peptídicos.

Una muy prejemplo ominent para una familia ligando que contiene arginina-es la subfamilia de las integrinas RGD-unión. En general, las integrinas son una clase de receptores de adhesión celular, que tienen más de funciones importantes en todos los organismos superiores. Algunas de estas funciones implican la adhesión celular, la migración y la supervivencia celular. Por lo tanto, ellos también están involucrados en indicaciones patológicas, como el cáncer y fibrosis. Las integrinas son proteínas heterodiméricas de transmembrana que consisten en un α- y una β-subunidad que forman 24 subtipos de integrina actualmente conocidos; 8 de ellos reconocen la secuencia de tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD =) en sus ligandos 7. La región de unión se encuentra en la interfaz entre estos dos subtipos en la parte extracelular, el llamado grupo de cabeza integrina 8. RGD es reconocido por dos interacciones comunes: la región del sitio de adhesión a metal-ion-dependiente (MIDAS), que se encuentra en la subunidad beta y que se une el ácido carboxílico en los ligandos (cha secundariosen de Asp); y el grupo guanidina en los ligandos, que se encuentra en la subunidad alfa. La mayoría de los subtipos de integrina son promiscuos y comparten al menos una parte de su matriz extracelular naturales (ECM) ligandos 9. Por lo tanto, para el desarrollo de ligandos de integrinas artificiales, el principal objetivo es, además de una alta afinidad de unión, la selectividad del subtipo. Recientemente, hemos sido capaces de dar a conocer un elemento clave para la generación de ligandos selectivos de subtipo: el grupo guanidina. A través de modificaciones distintas, ligandos biselective para el αv- y α5 que contienen subtipos de integrina se pueden convertir en compuestos selectivos por modificaciones sencillas en el grupo guanidina, que puede discriminar la diferente α-subunidades 10.

En el bolsillo de alpha v, el grupo guanidina interactúa lado-a través de un puente de sal bidentado con Asp218 11, 12. Esta interacción cuna también observarse en α5β1 (aquí, con Asp227 en α5), pero, además, se observa un extremo en la interacción del grupo de guanidina con un residuo de Gln (Gln221) hay 13. Por lo tanto, hemos modificado el grupo guanidina de dos maneras opuestas: en un caso, mediante el bloqueo del lado de la interacción con la metilación de la δ N del grupo de guanidina, y en el otro caso, con la metilación de la ω guanidina N, bloqueo de la interacción de fin en. Sorprendentemente, esta pequeña modificación dio lugar a un cambio completo selectividad en los ligandos. Además de la alquilación, se introdujo un nuevo método de funcionalización en esta publicación. El método de funcionalización clásica para este tipo de ligando pentapeptidic es a través de la conjugación de la cadena lateral de un aminoácido no implicada en la unión (por ejemplo, K en c (RGDfK)) 14, 15. Aquí,se muestra que la funcionalización es también posible mediante la modificación de la guanidina - que es crucial para la unión - con un acilo o enlazador alquilado. La carga positiva que es esencial para la unión se retiene, y los modelos sugieren que los puntos de cadena larga fuera del bolsillo de unión, proporcionando así una posibilidad ideal para la fijación de otros enlazadores y equipos de etiquetado (por ejemplo, un marcador fluorescente o un quelante para molecular de formación de imágenes).

En este trabajo, nos concentramos en las etapas preparativas para la modificación del grupo guanidina en ligandos que contienen arginina. Esto implica la síntesis de las especies -methylated N ω, así como guanidinas con unidades enlazadoras más largos. Las diferentes modificaciones comprenden grupos acilo y alquilo.

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Protocol

Nota: Todos los reactivos y disolventes se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional.

Precaución: Por favor, consultar a todas las hojas de datos de seguridad (MSDS) antes de usar. Utilice todo el equipo de seguridad adecuado al realizar la síntesis química (por ejemplo, campana extractora de humos, gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones de longitud completa, y zapatos cerrados).

1. Síntesis de los precursores Guanidinylation

  1. especies alquiladas
    1. especies metilados
      1. Disolver 1,0 g de N, N '-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina (3,2 mmol, 1 eq.) Y 1,0 g de trifenilfosfina (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) En 10 ml de seco tetrahidrofurano (THF) en un matraz de fondo redondo de 50 ml en una atmósfera inerte utilizando un septo de goma a temperatura ambiente (RT). Añadir 194! ​​L de metanol seco mediante una jeringa (4,8 mmol, 1,5 eq.) Y let se agita a RT.
      2. Por separado, preparar una solución con 747! L de azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) En 2 ml de THF seco en un vial de vidrio pequeño. Mientras se agita, añadir la solución de DIAD en THF gota a gota a la solución de N, N '-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina, PPh3, y metanol usando una jeringa (más de 15 min). Deje que la agitación solución durante 2 h a TA.
      3. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio y se disuelve el producto bruto en 1 ml de diclorometano (DCM). Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 100 g de sílice en acetato de etilo 10% (EtOAc) en una solución de pentano. Cargar el producto bruto disuelto en la columna y añadir el disolvente a presión (1,5 bar).
      4. Reunir las fracciones (sistema disolvente: isocrático 10% de EtOAc en pentano), identificar el punto de compuesto deseado por cromatografía en capa fina (TLC), y recogerlo (Rf = 0,4, EtOAc / pentano 1: 9, UV). Combinar el deseadofracciones y evaporar el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 0,85 g del compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo (2,6 mmol, 81% de rendimiento). Almacenar el compuesto producido a temperatura ambiente para su uso posterior.
    2. Hexilamina especies modificadas
      1. Disolver 1,0 g de N, N '-Di-BOC-1 H-pirazol-1-carboxamidina (3,2 mmol, 1,0 eq.), 0,9 g de Dde-6-aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.), Y 1,0 g de PPh3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) en 10 ml de THF seco en un matraz de fondo redondo de 50 ml en atmósfera inerte utilizando un septo de goma a temperatura ambiente.
      2. Por separado, preparar una solución con 747 l de DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) En 2 ml de THF seco en un vial de vidrio pequeño. Mientras se agita, añadir la solución de DIAD en THF gota a gota a la solución de N, N '-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina, PPh3, y Dde-6-aminohexanol usando una jeringa (más de 15 min) . Deje que la agitación solución durante 2 h a TA.
      3. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio y tomar el producto bruto en 1 ml de DCM. Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 100 g de sílice en una solución de pentano / EtOAc (2: 1). Aplicar el producto bruto disuelto en la columna y añadir disolvente a presión (1,5 bar).
      4. Reunir las fracciones (sistema disolvente: isocrático 2: 1 de pentano / EtOAc), identificar las fracciones deseadas con TLC, y recogerlos (R f = 0,66, 2: 1 de pentano / EtOAc, UV). Combinar las fracciones deseadas y se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 1,6 g del compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo (2,8 mmol, 88% de rendimiento). Almacenar el compuesto producido a temperatura ambiente para su uso posterior.
  2. Especies aciladas (2 etapas de reacción)
    1. Disolver 1,4 g de S hemisulfato -methylisothiuronium (10 mmol, 1,0 eq.) Y 2,2 g de di (terc-butil) dicarbonato (10 mmol, 1,0 eq.) En un agitar vigorosamentesonar solución bifásica de DCM / sat. ac. De NaHCO3 y se deja agitar durante 24 h a TA.
    2. Separar las capas en un embudo de decantación y se extrae la fase acuosa tres veces con DCM. Se combinan las fases orgánicas, se secan con Na 2 SO 4, y eliminar el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio. Tome el producto bruto en 1 ml de hexano.
    3. Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 100 g de sílice en una solución de 4: 1 hexano / EtOAc. Cargar el producto bruto disuelto en la columna. Añadir disolvente bajo presión. Identificar las fracciones deseadas con TLC (sistema disolvente: 4: 1 hexano isocrático / EtOAc (detección UV: 254 nm), y recogerlos (R f = 0,30).
    4. Combinar las fracciones deseadas y se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 1,1 g del compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo (5,8 mmol, 58% de rendimiento). Almacenar el reactivo, N - (terc -butoxicarbonil) - S -methylisothiourea, a TA durante su uso posterior.
    5. Disolver 250 mg de N - (terc -butoxicarbonil) - S -methylisothiourea (1,3 mmol, 1,0 eq.) En 10 ml de N, N -dimetilformamida seca (DMF) en un matraz de fondo redondo de 50 ml en una atmósfera inerte a RT. Añadir 440! L de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) (2,6 mmol, 2 eq.) Utilizando una jeringa. Mientras se agita, añadir 245 l de Ac 2 O (5,2 mmol, 4,0 eq.) Gota a gota usando una jeringa y se deja agitar durante 1 h a TA.
    6. Añadir un exceso de metanol (2 ml) a la mezcla usando una jeringa y se deja agitar durante 15 min a TA. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. Tome el producto bruto en 1 ml de DCM.
    7. Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 60 g de sílice en una solución de 3: 1 de hexano / EtOAc 3: 1. Aplicar el producto bruto se disolvió a la columna. Añadir disolvente (3: 1 hexano / EtOAc) y la presión (1,5 bar). Identificar las fracciones deseadas con TLC (3: 1 de hexano / EtOAc, UV: 220 nm), y colLect ellos (Rf = 0,62).
    8. Combinar las fracciones deseadas y se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 210 mg del compuesto del título como un sólido blanco (0,9 mmol, 70% de rendimiento). Almacenar el compuesto a temperatura ambiente para su uso posterior.

2. Síntesis de péptido cíclico Precursores

  1. Cargando y taponado de resina TCP
    1. Añadir 1,00 g de resina de 2-chlortriyl cloruro de (CTC) (0,9 mmol / g) y 320 mg de Fmoc-Gly-OH (1,2 eq.) En una jeringa de plástico de 20 ml con una frita. Preparar una solución de 313 l de DIPEA (2 eq.) En 5 ml de DCM seco y añadirlo a la jeringa. Deje que se gire durante 1 h a RT utilizando una unidad giratoria.
    2. Mientras tanto, preparar una solución de 2 ml de 5: 1 de metanol / DIPEA (v / v; solución tapado). Añadir la solución de nivelación a la jeringa y se deja girar durante otros 15 minutos. Se lava la resina con DCM (5x) y DMF (3x).
  2. On-resina Fmoc desprotección
    1. Tratar el unido a la resina Fmoc-Gly con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x).
  3. On-resina acoplamiento de Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Añadir 934 mg de-l-Orn Fmoc -OH (Dde) (2 eq.), 684 mg de 1- [bis (dimetilamino) metileno] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] piridinio hexafluorofosfato de 3-óxido (HATU) (2 eq.), y 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 eq.) a un vial de vidrio pequeño y se disuelven en 5 ml de DMF. Añadir 814! L de DIPEA.
    2. Añadir esta solución a la Gly desprotegió Fmoc-, se lavó, y unido a la resina y se deja girar durante 1 h. Lavar la resina con DMF (3x).
  4. On-resina Fmoc desprotección
    1. Tratar el unido a la resina Fmoc-Orn (Dde) Gly con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x).
  5. Acoplamiento sobre resina de Fmoc-Val-OH
    1. Añadir 610 mg de Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), Y 245 mg de HOAt (2 eq.) A un pequeño vial de vidrio y se disuelven en 5 ml de DMF. Añadir 814! L de DIPEA.
    2. Añadir esta solución a la Fmoc-desprotegió, se lava, y Orn unido a la resina (Dde) Gly y se deja girar durante 1 h.
  6. On-resina Fmoc desprotección
    1. Tratar el unido a la resina Fmoc-Val-Orn (Dde) Gly con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x).
  7. On-resina N- metilación
    1. Se lava la resina con DCM (3x). Disolver 887 mg de 2-nitrobencenosulfonilo (O NBS-Cl, 4 eq.) En DCM y añadir 1,2 ml de 2,4,6-colidina (10 eq.).
    2. Añadir la solución del péptido unido a la resina y se deja incubar durante 20 min a TA.
    3. Se lava la resina con CH 2 Cl 2 (3x) y con THF (5x). Preparar una solución con 1,18 g de PPh 3 (5 eq.) Y 365 l de metanol en THF. Añadir esta solución a lajeringuilla.
    4. Preparar una solución con 883 l de DIAD en 2 ml de THF y añadirlo a la jeringa. Deje que se incuba durante 15 min. Se lava la resina con THF (5x) y con DMF (5x).
  8. o desprotección ns
    1. Preparar una solución con 570 l de mercaptoetanol (10,0 eq.) Y 672 l de diazabicycloundecen (DBU) en 2 ml de DMF. Añadir esta solución a la jeringa y se deja incubar durante 5 minutos.
    2. Repetir la etapa de desprotección y después se lava la resina con DMF (5x).
  9. Acoplamiento On-resina de Fmoc- D-Phe-OH
    1. Añadir 697 mg de Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), Y 245 mg de HOAt (2 eq.) A un pequeño vial de vidrio y se disuelven en 5 ml de DMF . Añadir 814! L de DIPEA.
    2. Añadir esta solución al péptido desprotegido Fmoc-, se lavó, y unido a la resina y se deja girar durante 1 h.
  10. On-resina Fmoc desprotección
    1. El tratamiento de la resina-bound péptido con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x).
  11. Acoplamiento sobre resina de Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH
    1. Añadir 741 mg de Fmoc Asp (Ot Bu) -OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), Y 245 mg de HOAt (2 eq.) A un pequeño vial de vidrio y se disuelven en 5 ml de DMF. Añadir 814! L de DIPEA.
    2. Añadir esta solución al péptido desprotegido Fmoc-, se lavó, y unido a la resina y se deja girar durante 1 h.
  12. La escisión del péptido lineal de la resina
    1. Se lava la resina con DCM (3x) y, posteriormente, preparar 10 ml de una solución de hexafluoroisopropanol (HFIP) en DCM (1: 4; v / v).
    2. Añadir la solución a la resina y se deja girar durante 15 min. Recoger la solución en un matraz de fondo redondo. Repita la escisión y evaporar el disolvente usando un evaporador rotatorio.
  13. La ciclación del péptido lineal
    1. dissolve 384 mg de NaHCO3 (5,0 eq.) y 582 l de difenilfosforil azida (DPPA) (3,0 eq.) en 50 ml de DMF y añadirlo al producto bruto. Deje que se agita durante una noche o hasta que no se observa ningún péptido lineal con ESI-MS (10 h) 17.
    2. Bajo presión reducida, reducir el disolvente a un pequeño volumen usando un evaporador rotatorio. Preparar una solución acuosa saturada de NaCl (salmuera). Utilizando una pipeta Pasteur, añadir gota a gota el péptido ciclado a 40 ml de solución acuosa saturada de NaCl en un tubo de centrífuga.
    3. Centrifugar la suspensión (5.000 xg, 5 min) y se lava el precipitado con agua de grado HPLC (2x). Liofilizar el producto.

3. Guanidinylation y desprotección en la Solución

  1. Guanidinylation con los precursores hechos a la medida
    1. Disolver una pequeña cantidad (por ejemplo, 25 mg) del péptido cíclico ortogonalmente desprotegido en un pequeño volumen de DMF (por ejemplo, 2 mL). Añadir 2 eq. del precursor guanidinylation y 2 eq. de DIPEA a la solución y se deja agitar durante 2 h a TA.
    2. Monitorear el progreso de la reacción con HPLC-MS. Después de que la reacción es completa, retire la re-disolver el péptido cíclico disolvente, guanidinylated en acetonitrilo, y llevar a cabo la purificación por HPLC semipreparativa 16.
  2. La eliminación de grupos de cadena lateral lábil protector de ácido
    1. Preparar 2 ml de una solución que contiene ácido trifluoroacético (TFA), agua, y triisopropilsilano (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Añadir esta solución al producto purificado en un pequeño vial de vidrio y se deja agitar a TA durante al menos 1 h. Observe la desprotección completa con ESI-MS 17.
    2. Se evapora el disolvente bajo presión reducida a un pequeño volumen. Preparar éter enfriado con hielo y añadir 10 ml en un tubo de centrífuga de 50 mL. Precipitar el péptido desprotegido en éter enfriado con hielo utilizando una pipeta Pasteur añadiéndolagota a gota. Centrifugar la suspensión (5.000 xg, 5 min) para obtener un pellet.
    3. Lavar el precipitado con éter enfriado con hielo y centrifugar ella (5000 xg, 5 min, 2x). Se disuelve el producto en 2 ml de agua de calidad de HPLC y se purifica con HPLC semipreparativa 16.

4. Datos analíticos y parámetros para la purificación

  1. Analytical HPLC-ESI-MS
    1. Realizar analítico HPLC-ESI-MS con un espectrómetro de masas LCQ usando una columna C18 (tamaño de 12 nm de poro, tamaño de partícula 3-m, 125 mm x 2,1 mm) o una columna C8 (tamaño de poro de 20 nm, partículas 5-m tamaño, 250 mm x 2,1 mm), con H 2 O (0,1% v v / ácido fórmico) / acetonitrilo (0,1% v v / ácido fórmico) como eluyentes.
  2. HPLC semi-preparativa
    1. Realizar HPLC semi-preparativa usando un instrumento de HPLC preparativa con un ODS-A de columna (20 x 250 mm, 5 micras), una velocidad de flujo de 8 ml / min, y los gradientes linealesde H 2 O (0,1% v / v de TFA) y acetonitrilo (0,1% v / v de TFA).

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Representative Results

El precursor del péptido cíclico fue sintetizado como un péptido lineal, ciclizado, y ortogonalmente desprotege-Dde. Después de la precipitación, la pureza del compuesto se analizó con HPLC-MS (Figura 1). Para supervisar el progreso de la reacción, se realizó un análisis HPLC después del tiempo de reacción de 2 h (Figura 2).

Para los residuos más grandes en el grupo de guanidina, el tiempo de reacción de 2 h a menudo no es suficiente. En este caso, se continuó la reacción y se controló con LC-MS. Después de la reacción y la desprotección final, los compuestos se purificaron utilizando un equipo HPLC semipreparativa (rendimientos típicamente en el intervalo de bajo mg). Los compuestos finales se analizaron con HPLC-MS para evaluar la pureza (véase la Figura 3).

Una pequeña cantidad se pesó en un tubo de microcentrífuga y se diluye con DMSO para obtener una solución madre para la evaluación biológica del compuesto en un ELISA similar, ensayo de unión en fase sólida. Los resultados se representan en la Figura 4. La molécula estándar Cilengitide (grupo guanidina no modificado) se incluye como referencia. Todos los compuestos poseen una alta afinidad relativa para el V? 3 integrina subtipo y alta selectividad contra α5β1.

Figura 1
Figura 1: HPLC-MS espectro (gradiente: 10-90% de acetonitrilo (ACN) en un sistema disolvente bifásico con H2O y ACN) de la desprotegió-Dde ortogonalmente c derivado (OrnGD (Ot Bu) f (N Me) V ) (masa calculada: 602,34 g / mol), tal como se obtiene después de la ciclación del péptido lineal, posterior Dde-desprotección, y la precipitación.ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: espectro de HPLC-MS (gradiente: 10-90% de ACN en un sistema disolvente bifásico con H2O y ACN) de la mezcla de reacción después de la reacción guanidinylation del péptido cíclico ortogonalmente desprotegido y el precursor metilado para guanidinylation. Además del pico de producto (R t = 7,50 min, masa calculada = 858,49 g / mol), se puede observar solamente el exceso de precursor guanidinylation (R t = 6,38 min) y la DIPEA base (R t = 0,90 min). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: HPLC-MS espectro (gradiente: 10-90% de ACN en un sistema disolvente bifásico con H2O y ACN) del compuesto bruto 2 (R t = 3,69 min, masa calculada = 603,32 g / mol), después de la desprotección de las cadenas laterales lábiles ácido antes de la purificación semipreparativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: La funcionalización de guanidinas en solución y evaluación biológica. Compuesto 1, con un grupo guanidina inalterada, es Cilengitide. Las modificaciones abordados en este manuscrito son los metilados (2), funcionalizado (aquí, acetilo amino hexano; 3), y acetilados (4) derivados. Tque la afinidad de unión se determinó en un ensayo de unión en fase sólida usando proteínas aisladas 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El precursor para guanidinylation es un derivado de péptido cíclico ortogonalmente desprotegido, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), que se sintetiza por un protocolo Fmoc estándar de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Ornitina se utilizó como el derivado protegido ortogonalmente, (Fmoc-Orn (Dde) -OH), que puede desprotegerse con hidrazina en DMF después de la ciclación del andamio péptido. El precursor del péptido se purifica mediante la precipitación del compuesto y por la liofilización subsiguiente.

Precursores alquilados para el guanidinylation se pueden obtener con buenos rendimientos en una reacción de una etapa a partir de la sustancia disponible comercialmente N, N '-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina a través de una reacción de alquilación en condiciones de Mitsunobu (PPh3 , DIAD, THF) 19, 10. Con esta reacción, una gran variedad de precursores es accessible partir de los alcoholes correspondientes. La reacción guanidinylation con los precursores alquilados produce el producto definido en una reacción limpia. Si la conversión completa del reactivo no se observa después de 2 h, la reacción se debe continuar. En las condiciones dadas en el protocolo, los productos secundarios formados sólo pequeñas; sin embargo, mayores cantidades de impurezas no pueden ser excluidas para todos, especialmente de manera diferente protegidos, los sustratos que llevan restos más grandes.

Si el uso de péptidos de guanidina-funcionalizado (enlazadores más largos), el grupo protector Dde en la amina terminal del enlazador se elimina y se puede conjugar por acoplamiento de amida de un ácido correspondiente. La desprotección de Dde se lleva a cabo en una solución de 2% de hidrazina en DMF y se produce el péptido desprotegido ortogonalmente, que debe ser purificado (por ejemplo, HPLC semipreparativa) antes de su uso posterior. En este caso, una reacción de acetilación sencilla se llevó a cabo in situ.

Siusando guanidinas acetilados, una estrategia precursor diferente se debe aplicar. A partir de S -methylisothiourea, se requiere una secuencia de reacción de dos etapas 20. En primer lugar, un mono Boc protección de S -methylisothiourea debe realizarse 21 antes de la acetilación con un ácido de elección (en este caso, el ácido acético). La reacción guanidinylation es una reacción muy limpio y rápido, se obtiene el compuesto final después de la desprotección final de los grupos protectores de la cadena lateral lábil en medio ácido.

Como ya se ha indicado en la introducción, este método permite la modificación y la funcionalización de cualquier grupo guanidina peptídico. Hemos demostrado que esta técnica de ligandos de integrinas, que permiten, en este caso, el ajuste de la selectividad del subtipo de los ligandos. El no modificada Cilengitide antagonista de integrina es biselective para los subtipos de? V? 3 / α5β1. A través de la metilación de la ω terminal de N deel grupo guanidina, un ligando de? V? 3-selectiva se produjo. Esto bloquea una importante interacción extremo en que se observa únicamente en α5β1, inactivando de este modo el ligando para esta integrina. La principal interacción con el sitio de unión del subtipo? V? 3 es un fin-de interacción que no se perturba por esta interacción 10.

Mediante la modificación del ligando con unidades de enlazador más largo ( "funcionalización"), dos objetivos se pueden alcanzar de una sola vez: se genera selectividad a través de romper el extremo en interacción con el subtipo α5β1 y, en el otro lado, los puntos de engarce de la bolsillo de unión, lo que permite la conjugación a grandes entidades (por ejemplo, quelantes o colorantes fluorescentes para técnicas de imagen) 10.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

TGK reconoce la Escuela Internacional de Posgrado de Ciencia e Ingeniería (IGGSE) de la Universidad Técnica de Múnich por su apoyo financiero. HK reconoce el Centro de Ciencias de la proteína integrada Múnich (CIPSM) por su apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

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References

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Bioquímica No. 122 guanidina arginina péptido modificación guanidinylation alquilación de Mitsunobu
Modificación y funcionalización del grupo guanidina por Precursores adaptado
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Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

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