Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modifiering och funktionalisering av guanidingruppen från Skräddarsydda prekursorer

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/54873
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, Technische Universität München
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för syntes av alkyl-modifierade guanidiner baserade på användning av de motsvarande prekursorerna presenteras.

Abstract

Guanidingruppen är en av de viktigaste farmakofora grupper i läkemedelskemi. Den enda aminosyra som bär en guanidingruppen är arginin. I denna artikel, är en enkel metod för modifiering av guanidingruppen i peptidligander anordnade, med ett exempel på RGD-bindande integrinligander. Det var nyligen visat att den distinkta modifiering av guanidingruppen i dessa ligander möjliggör selektiv modulering av subtyp (t ex mellan de subtyper aV och α5). Dessutom var en tidigare okänd strategi för funktionalisering via guanidingruppen visat, och det syntetiska tillvägagångssätt granskas i detta dokument. De ändringar som beskrivs här involverar terminalt (N ω) alkylerade och acetylerade guanidin grupper. För syntesen, är skräddarsydda prekursormolekyler syntetiseras, vilka därefter utsattes för en reaktion med en ortogonalt avskyddade aminen att överföra pre-modifierade guanidingruppen. För syntesen av alkylerade guanidiner, prekursorer baserat på N, N '-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboxamidin som används för att syntetisera acylerade föreningar, prekursorn för valet att vara en motsvarande acylerad derivat av N-Boc- S - metylisotiourea, som kan erhållas i en-och två-stegsreaktioner.

Introduction

Bland de mest förekommande farmakofora grupper i naturliga ligander är guanidingruppen, som är involverat i flera interaktioner 1, 2. Till exempel, fungerar den som en potentiell fyrfaldig vätedonator i vätebindningsväxelverkningar och är involverad i elektrostatiska interaktioner, såsom saltbryggor eller katjon-π interaktioner. I medicinsk kemi, är denna grupp ofta i läkemedel och läkemedelskandidater 4, även om mycket ofta som guanidin mimetika 5, 6. Anledningen till utvecklingen av guanidin härmare är borttagandet av den allestädes närvarande, positivt laddade guanidingruppen, liksom justeringen av lipofilicitet av liganden. I peptidligander, är det enda guanidin gruppinnehållande aminosyran arginin, som därför påträffas ofta i det bioaktiva området av peptidligander.

En mycket prominent exempel för en arginin-innehållande ligand-familjen är underfamiljen av de RGD-bindande integriner. I allmänhet, integriner är en klass av celladhesionsreceptorer, som tar över viktiga funktioner i alla högre organismer. Några av dessa funktioner innebär celladhesion, migrering och cellöverlevnad. Således är de också involverade i patologiska indikationer, såsom cancer och fibros. Integriner är transmembran heterodimera proteiner bestående av en α- och en β-subenheten som bildar 24 närvarande kända grinundertyper; 8 av dem att känna igen tripeptidsekvensen Arg-Gly-Asp (= RGD) i deras ligander 7. Bindningsregionen är belägen vid gränsytan mellan dessa två undertyper i den extracellulära delen, den så kallade grin huvudgrupp 8. RGD känns igen av två gemensamma interaktioner: metall-jon-beroende adhesion site (MIDAS) region, som ligger i beta-subenheten och som binder karboxylsyran i ligandema (sido chai i Asp); och guanidingruppen i liganderna, som ligger i alfa-subenheten. De flesta av de grin subtyper är promiskuös och dela åtminstone en del av sin naturliga extracellulära matrisen (ECM) ligander 9. Sålunda, för utveckling av artificiella grinligander, är det huvudsakliga fokus, förutom en hög bindningsaffinitet, subtyp-selektivitet. Nyligen kunde vi presentera ett nyckelelement för generering av subtypselektiva ligander: guanidingruppen. Genom distinkta modifieringar, biselective ligander för αv- och α5 innehållande integrinundertyper kan omvandlas till selektiva föreningar genom enkla modifieringar på guanidingruppen, som sedan kan särskilja olika α-underenheter 10.

I fickan på aV, interagerar guanidingruppen sida-on via en tvåtandad saltbrygga med Asp218 11, 12. Denna interaktion cen också observeras i α5β1 (här, med Asp227 i α5), men dessutom är en slut-på interaktionen av guanidingruppen med en Gin-rest (Gln221) observeras det 13. Sålunda, modifierade vi guanidingruppen i två motsatta sätt: i ett fall, genom att blockera sido på interaktion med metylering av den N δ av guanidingruppen, och i det andra fallet, med metylering av guanidin N ω, blockerar slut på interaktion. Överraskande nog ledde denna lilla ändring till en komplett selektivitet förskjutning i ligander. Förutom alkyleringen har en ny funktionalise metod introducerades i denna publikation. Den klassiska funktionalisemetod för denna typ av pentapeptidic liganden är genom sidokedjan konjugering av en aminosyra inte är involverad i bindning (t.ex., K i c (RGDfK)) 14, 15. Här,Vi visar att funktionalisering är också möjlig genom att modifiera guanidin - vilket är avgörande för bindning - med en acyl- eller alkylerad länk. Den positiva laddningen som är nödvändig för bindning behålls, och modeller tyder på att de långa punkter kedjan av bindningsfickan, vilket sålunda ger en idealisk möjlighet för fastsättning av ytterligare linkers och märkning enheter (t ex en fluorescerande märkning eller en kelator för molekylär imaging).

I detta arbete koncentrerar vi oss på de förberedande steg för modifiering av guanidingruppen i arginin innehållande ligander. Detta innefattar syntes av N ω -metylerade arter, samt guanidiner med längre länkenheterna. De olika modifieringar innefattar acyl- och alkylgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Notera: Alla reagens och lösningsmedel erhölls från kommersiella leverantörer och användes utan ytterligare rening.

Varning: Kontakta alla relevanta material säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Använd all lämplig säkerhetsutrustning när man utför kemiska synteser (t.ex. dragskåp, skyddsglasögon, handskar, laboratorierock, full längd byxor, och sluten tå skor).

1. Syntes av de Guanidinylation Prekursorer

  1. alkylerade arter
    1. metylerade arter
      1. Lös upp 1,0 g N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboxamidin (3,2 mmol, 1 ekv.) Och 1,0 g trifenylfosfin (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 ekv.) I 10 ml torr tetrahydrofuran (THF) i en 50-ml rundbottnad kolv i en inert atmosfär med användning av ett gummiseptum vid rumstemperatur (RT). Lägga 194 mikroliter torr metanol med användning av en spruta (4,8 mmol, 1,5 ekv.) Och let det rör om vid RT.
      2. Separat framställning av en lösning med 747 mikroliter av diisopropylazodikarboxylat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 ekv.) I 2 ml torr THF i en liten glasflaska. Under omrörning, tillsätt lösningen av DIAD i THF droppvis till lösningen av N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboxamidin, PPh3, och metanol med användning av en spruta (under 15 min). Låt lösningen omröras under 2 h vid RT.
      3. Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare och lös råprodukten i 1 ml diklormetan (DCM). Ladda en flash-kolonn (2,5 cm x 20 cm) med 100 g av kiseldioxid i 10% etylacetat (EtOAc) i en pentanlösning. Ladda den lösta råprodukten på kolonnen och tillsätt lösningsmedel under tryck (1,5 bar).
      4. Samla fraktionerna (lösningsmedelssystem: isokratisk 10% EtOAc i pentan), identifiera den önskade föreningen fläck med tunnskiktskromatografi (TLC), och samla in det (Rf = 0,4, EtOAc / pentan 1: 9, UV). Kombinera den önskadefraktionerna och indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare för erhållande av 0,85 g av titelföreningen som en gul, viskös olja (2,6 mmol, 81% utbyte). Lagra den gav förening vid RT för vidare användning.
    2. Hexylamin-modifierade arter
      1. Lös upp 1,0 g N, N'-di-boc-1 H-pyrazol-1-karboxamidin (3,2 mmol, 1,0 ekv.), 0,9 g av Dde-6-aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 ekv.), Och 1,0 g av PPh3 (3,8 mmol, 1,2 ekv.) i 10 ml torr THF i en 50-ml rundbottnad kolv i inert atmosfär med användning av ett gummiseptum vid RT.
      2. Separat framställning av en lösning med 747 mikroliter av DIAD (3,8 mmol, 1,2 ekv.) I 2 ml torr THF i en liten glasflaska. Under omrörning, tillsätt lösningen av DIAD i THF droppvis till lösningen av N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboxamidin, PPh3 och Dde-6-aminohexanol med användning av en spruta (under 15 min) . Låt lösningen omröras under 2 h vid RT.
      3. Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare och ta den råa produkten upp i en ml DCM. Ladda en flash-kolonn (2,5 cm x 20 cm) med 100 g av kiseldioxid i en lösning av pentan / EtOAc (2: 1). Tillämpa den lösta råprodukten på kolonnen och lägga lösningsmedel under tryck (1,5 bar).
      4. Samla fraktionerna (lösningsmedelssystem: isokratisk 2: 1 pentan / EtOAc), identifiering av de önskade fraktionerna med TLC, och samla dem (Rf = 0,66, 2: 1 pentan / EtOAc, UV). Kombinera de önskade fraktionerna och indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare för erhållande av 1,6 g av titelföreningen som en gul, viskös olja (2,8 mmol, 88% utbyte). Lagra den gav förening vid RT för vidare användning.
  2. Acylerade arter (2 reaktionssteg)
    1. Lös upp 1,4 g S -methylisothiuronium hemisulfat (10 mmol, 1,0 ekv.) Och 2,2 g di (tert-butyl) dikarbonat (10 mmol, 1,0 ekv.) I en kraftigt omrörasring bifasisk lösning av DCM / sat. aq. NaHCO 3 och låt det rör om 24 h vid RT.
    2. Separera skikten i en separationstratt och extrahera vattenfasen tre gånger med DCM. Kombinera de organiska faserna, torka dem med Na 2 SO 4, och avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare. Ta den råa produkten upp i 1 ml hexan.
    3. Ladda en flash-kolonn (2,5 cm x 20 cm) med 100 g av kiseldioxid i en lösning av 4: 1 hexan / EtOAc. Ladda den lösta råprodukten på kolonnen. Lägga lösningsmedel under tryck. Identifiera de önskade fraktionerna med TLC (lösningsmedelssystem: 4: 1 isokratisk hexan / EtOAc (UV-detektion: 254 nm), och samla dem (Rf = 0,30).
    4. Kombinera de önskade fraktionerna och indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare för erhållande av 1,1 g av titelföreningen som en gul, viskös olja (5,8 mmol, 58% utbyte). Lagra reagenset, N - (tert-butoxikarbonyl) - S-Methylisothiourea, vid RT för vidare användning.
    5. Upplös 250 mg N - (tert-butoxikarbonyl) - S-metylisotiokarbamid (1,3 mmol, 1,0 ekv.) I 10 ml torr N, N-dimetylformamid (DMF) i en 50-ml rundbottnad kolv i en inert atmosfär vid RT. Lägg 440 pl N, N-diisopropyletylamin (DIPEA) (2,6 mmol, 2 ekv.) Under användning av en spruta. Under omrörning, tillsätt 245 | il av AC2O (5,2 mmol, 4,0 ekv.) Droppvis med en spruta och låt det rör om under 1 h vid RT.
    6. Sätta ett överskott av metanol (2 ml) till blandningen med hjälp av en spruta och låt det rör om i 15 min vid RT. Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare. Ta den råa produkten upp i 1 ml DCM.
    7. Ladda en flash-kolonn (2,5 cm x 20 cm) med 60 g kiseldioxid i en lösning av 3: 1 hexan / EtOAc 3: 1. Tillämpa den lösta råprodukten till kolonnen. Lägga lösningsmedel (3: 1 hexan / EtOAc) och tryck (1,5 bar). Identifiera de önskade fraktionerna med TLC (3: 1 hexan / EtOAc, UV: 220 nm), och colLect dem (Rf = 0,62).
    8. Kombinera de önskade fraktionerna och indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare för att erhålla 210 mg av titelföreningen som ett vitt fast material (0,9 mmol, 70% utbyte). Lagra föreningen vid RT under ytterligare användning.

2. Syntes av cyklisk peptid Prekursorer

  1. Lastning och capping TCP-harts
    1. Lägga 1,00 g av 2-chlortriyl klorid (CTC) harts (0,9 mmol / g) och 320 mg av Fmoc-Gly-OH (1,2 ekv.) I en plast 20-ml spruta med en fritta. Framställa en lösning av 313 mikroliter av DIPEA (2 ekv.) I 5 ml torr DCM och lägga den på sprutan. Låt den rotera under 1 h vid RT med användning av en rotationsenhet.
    2. Under tiden, framställa en 2-ml lösning av 5: 1 metanol / DIPEA (volym / volym; capping lösning). Tillsätt tak lösningen till sprutan och låt den rotera i ytterligare 15 minuter. Tvätta hartset med DCM (5x) och DMF (3 x).
  2. On-harts Fmoc deprotektion
    1. Behandla den hartsbundna Fmoc-Gly med 20% piperidin i DMF under 10 min och därefter under 5 min. Tvätta hartset med DMF (3x).
  3. On-harts koppling av Fmoc-Orn (Dde) -OH
    1. Lägg 934 mg Fmoc-l-Orn (Dde) -OH (2 ekv.), 684 mg 1- [bis (dimetylamino) metylen] -1-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxid (HATU) (2 ekv.), och 245 mg av en-hydroxi-7-azabensotriazol (HOAt) (2 ekv.) och en liten glasflaska och lös den i 5 ml DMF. Lägg 814 mikroliter av DIPEA.
    2. Lägga till denna lösning på Fmoc-avskyddades, tvättades och hartsbundna Gly och låt den rotera under 1 timme. Tvätta hartset med DMF (3x).
  4. On-harts Fmoc deprotektion
    1. Behandla den hartsbundna Fmoc-Orn (Dde) -Gly med 20% piperidin i DMF under 10 min och därefter under 5 min. Tvätta hartset med DMF (3x).
  5. On-harts koppling av Fmoc-Val-OH
    1. Lägg 610 mg Fmoc-Val-OH (2 ekv.), 684 mg av HATU (2 ekv.), Och 245 mg av HOAt (2 ekv.) Till en liten glasflaska och lös den i 5 ml DMF. Lägg 814 mikroliter av DIPEA.
    2. Lägga till denna lösning på Fmoc-avskyddades, tvättades och hartsbundna Orn (Dde) -Gly och låt den rotera under 1 timme.
  6. On-harts Fmoc deprotektion
    1. Behandla den hartsbundna Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly med 20% piperidin i DMF under 10 min och därefter under 5 min. Tvätta hartset med DMF (3x).
  7. On-harts N- metylering
    1. Tvätta hartset med DCM (3x). Lös upp 887 mg av 2-nitrobenzenesulfonylchloride (o -NBS-Cl, 4 ekv.) I DCM och tillsätt 1,2 ml av 2,4,6-kollidin (10 ekv.).
    2. Tillsätta lösningen till den hartsbundna peptiden och låt den inkubera i 20 min vid RT.
    3. Tvätta hartset med CH 2 Cl 2 (3x) och med THF (5 x). Bered en lösning med 1,18 g PPh3 (5 ekv.) Och 365 mikroliter av metanol i THF. Lägg denna lösning tillspruta.
    4. Bered en lösning med 883 mikroliter av DIAD i 2 ml THF och tillsätt den på sprutan. Låt det inkubera i 15 min. Tvätta hartset med THF (5x) och med DMF (5x).
  8. o -NS avskyddning
    1. Bered en lösning med 570 mikroliter av merkaptoetanol (10,0 ekv.) Och 672 mikroliter av diazabicycloundecen (DBU) i 2 ml DMF. Lägg denna lösning till sprutan och låt den inkubera i 5 minuter.
    2. Upprepa avskyddningssteg och sedan tvätta hartset med DMF (5x).
  9. On-harts koppling av Fmoc-D-Phe-OH
    1. Lägg 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 ekv.), 684 mg HATU (2 ekv.), Och 245 mg av HOAt (2 ekv.) Till en liten glasflaska och lös den i 5 ml DMF . Lägg 814 mikroliter av DIPEA.
    2. Lägga till denna lösning på Fmoc-avskyddades, tvättades och hartsbundna peptiden och låta den rotera under 1 timme.
  10. On-harts Fmoc deprotektion
    1. Behandla hartset-bound peptid med 20% piperidin i DMF under 10 min och därefter under 5 min. Tvätta hartset med DMF (3x).
  11. On-harts koppling av Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH
    1. Lägg 741 mg Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH (2 ekv.), 684 mg HATU (2 ekv.), Och 245 mg av HOAt (2 ekv.) Till en liten glasflaska och lös den i 5 ml DMF. Lägg 814 mikroliter av DIPEA.
    2. Lägga till denna lösning på Fmoc-avskyddades, tvättades och hartsbundna peptiden och låta den rotera under 1 timme.
  12. Klyvning av den linjära peptiden från hartset
    1. Tvätta hartset med DCM (3 x) och därefter framställa 10 ml av en lösning av hexafluorisopropanol (HFIP) i DCM (1: 4; volym / volym).
    2. Tillsätt lösningen till hartset och låt den rotera under 15 min. Samla upp lösningen i en rundbottnad kolv. Upprepa klyvning och indunsta lösningsmedlet under användning av en rotationsindunstare.
  13. Cyklisering av den linjära peptiden
    1. dissolve 384 mg NaHCOa 3 (5,0 ekv.) och 582 mikroliter av difenylfosforylazid (DPPA) (3,0 ekv.) i 50 ml DMF och tillsätt den till den råa produkten. Låta det omröras över natten eller tills ingen linjära peptiden observeras med ESI-MS (10 h) 17.
    2. Under reducerat tryck, minska lösningsmedlet till en liten volym under användning av en rotationsindunstare. Bered en mättad vattenlösning av NaCl (saltlösning). Med användning av en pasteurpipett, lägga den cykliserade peptiden droppvis till 40 ml av en mättad vattenlösning av NaCl i ett centrifugrör.
    3. Centrifugera suspensionen (5000 xg, 5 min) och tvätta fällningen med HPLC-kvalitet vatten (2x). Frystorka produkten.

3. Guanidinylation och Deprotektion i lösning

  1. Guanidinylation med skräddarsydda prekursorer
    1. Upplösa en liten mängd (t ex 25 mg) av den ortogonalt avskyddas cykliska peptiden i en liten volym DMF (t ex 2 mL). Tillsätt 2 eq. av guanidinylation prekursorn och 2 ekv. DIPEA till lösningen och låt den rör om under 2 h vid RT.
    2. Övervaka fortskridandet av reaktionen med HPLC-MS. Efter det att reaktionen är fullbordad, avlägsna lösningsmedlet, åter-upplösa guanidinylated cykliska peptiden i acetonitril, och utför semipreparativ HPLC-rening 16.
  2. Avlägsnande av syralabila sidokedjeskyddsgrupper
    1. Framställa 2 ml av en lösning innehållande trifluorättiksyra (TFA), vatten och triisopropylsilan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; vol / vol / vol). Lägga till denna lösning för att den renade produkten i en liten glasflaska och låta det omröras vid RT under minst 1 timme. Observera den fullständiga avskyddande med ESI-MS 17.
    2. Indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck till en liten volym. Förbereda iskall eter och tillsätt 10 ml i ett 50-ml centrifugrör. Fälla den avskyddade peptiden i iskall eter med användning av en Pasteur-pipett genom att lägga till detdroppvis. Centrifugera suspensionen (5000 xg, 5 min) för att erhålla en pellet.
    3. Tvätta fällningen med iskall eter och centrifugera det (5000 xg, 5 min, 2x). Upplösning av produkten i 2 ml HPLC-kvalitet vatten och rena det med semipreparativ HPLC 16.

4. Analytiska data och Parametrar för rening

  1. Analytisk HPLC-ESI-MS
    1. Utföra analytisk HPLC-ESI-MS med en LCQ masspektrometer med användning av en C18-kolonn (12-nm porstorlek, 3-im partikelstorlek, 125 mm x 2,1 mm) eller en C8-kolonn (20-nm porstorlek, 5 ^ m partikel storlek, 250 mm x 2,1 mm), med H2O (0,1% vol / vol myrsyra) / acetonitril (0,1% vol / vol myrsyra) som elueringsmedel.
  2. Semi-preparativ HPLC
    1. Utföra semi-preparativ HPLC med användning av en preparativ HPLC-instrument med en ODS-A-kolonn (20 x 250 mm, 5 | im), en flödeshastighet av 8 ml / min, och linjära gradienterH2O (0,1% volym / volym TFA) och acetonitril (0,1% volym / volym TFA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den cykliska peptiden prekursor syntetiserades som en linjär peptid, cykliseras, och ortogonalt Dde-avskyddades. Efter utfällningen, var renheten av föreningen analyseras med HPLC-MS (fig 1). Att övervaka framskridandet av reaktionen genomfördes en HPLC-analys utförs efter 2-h reaktionstid (Figur 2).

För större rester på guanidingruppen, är reaktionstiden av 2 h ofta inte tillräckligt. I detta fall, fortsattes reaktionen och övervakades med LC-MS. Efter reaktionen och slutlig avskyddning, erhölls föreningarna renades med användning av semipreparativ HPLC-utrustning (utbyten typiskt i låg mg intervall). De slutliga föreningarna analyserades med HPLC-MS för att utvärdera renhet (se Figur 3).

En liten mängd vägdes in i ett mikrocentrifugrör och späddes med DMSO för att erhålla en stamlösning för den biologiska utvärderingen av föreningen i en ELISA-liknande, fast fas bindningsanalys. Resultaten avbildas i Figur 4. Standard molekylen Cilengitid (omodifierad guanidingruppen) ingår som en referens. Alla föreningar har en relativ hög affinitet för integrinet subtyp avp3 och hög selektivitet mot α5β1.

Figur 1
Figur 1: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% acetonitril (ACN) i ett tvåfasigt lösningsmedelssystem med H2O och ACN) hos den ortogonalt Dde-avskyddades derivatet c (OrnGD (Ot Bu) f (N Me) V ) (beräknad massa: 602,34 g / mol), som erhållits efter cykliseringen av den linjära peptiden, efterföljande Dde-skyddsavlägsnande, och utfällning.ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% ACN i ett tvåfasigt lösningsmedelssystem med H2O och ACN) av reaktionsblandningen efter guanidinylation reaktionen av den ortogonalt avskyddas cykliska peptiden och den metylerade prekursor för guanidinylation. Förutom produkttoppen (Rt = 7,50 min, beräknad massa = 858,49 g / mol), kan observeras endast överskottet av guanidinylation prekursor (Rt = 6,38 min) och basen DIPEA (Rt = 0,90 min). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3: HPLC-MS-spektrum (gradient: 10-90% ACN i ett tvåfasigt lösningsmedelssystem med H2O och ACN) av den råa föreningen 2 (Rt = 3,69 min, beräknad massa = 603,32 g / mol) efter avskyddning av de syralabila sidokedjor innan läkemedlet semipreparativ rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Funktionalisering av guanidiner i lösning och biologisk utvärdering. Förening 1, med en oförändrad guanidin-grupp, är Cilengitid. Modifiering behandlas i detta manuskript är den metylerade (2), funktionaliserade (här, acetyl amino hexan; 3), och acetylerade (4) derivat. Than bindningsaffinitet bestämdes i en fast fas-bindningsanalysen med användning av isolerade proteiner 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prekursorn för guanidinylation är en ortogonalt avskyddas cykliskt peptidderivat, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), som syntetiseras genom en standard Fmoc protokoll av fast-fas peptidsyntes (SPPS). Ornithin användes som den ortogonalt skyddade derivatet, (Fmoc-Orn (Dde) -OH), som kan avskyddas med hydrazin i DMF efter cykliseringen av peptiden ställningen. Peptiden prekursorn renas genom utfällning av föreningen och genom efterföljande lyofilisering.

Alkylerade prekursorer för guanidinylation kan erhållas i goda utbyten i en enstegsreaktion startande från den kommersiellt tillgängliga substansen N, N'-di-Boc-1 H-pyrazol-1-karboxamidin genom en alkyleringsreaktion under Mitsunobu-betingelser (PPh3 , DIAD, THF) 19, 10. Med denna reaktion är ett enormt utbud av prekursorer ACCEssible från motsvarande alkoholer. Den guanidinylation reaktion med de alkylerade prekursorerna ger den definierade produkten i en ren reaktion. Om fullständig omvandling av reaktionskomponenten inte observeras efter 2 h, bör reaktionen fortsättas. Under de betingelser som anges i protokollet, endast mindre sidoprodukter bildas; emellertid, kan högre mängder av föroreningar inte uteslutas för alla, särskilt annorlunda skyddad, substrat som bär större delar.

Om användning av guanidin-funktionaliserade peptider (längre linkers), Dde skyddsgruppen på den terminala aminen av linkem avlägsnas och kan konjugeras genom amidkoppling till en motsvarande syra. Avskyddningen av Dde utförs i en lösning av 2% hydrazin i DMF och ger den ortogonalt avskyddade peptiden, som bör renas (t.ex. semipreparativ HPLC) innan ytterligare användning. I detta fall var en enkel acetyleringsreaktion utförs in situ.

Ommed användning av acetylerade guanidiner, bör en annan prekursor strategi tillämpas. Utgående från S-metylisotiokarbamid, är en två-stegs reaktionssekvens som krävs 20. För det första måste en mono Boc skydd av -S-metylisotiokarbamid utföras 21 före acetylering med en syra av val (här, ättiksyra). Den guanidinylation reaktion är en mycket ren och snabb reaktion, den slutliga föreningen erhålles efter den slutliga avskyddande av syralabil sidokedjeskyddsgrupper.

Som redan nämnts i inledningen, gör denna metod för modifiering och funktionalisering av alla peptid guanidingruppen. Vi visade denna teknik på integrinligander, som tillåter, i det här fallet, trimning av subtyp selektivitet av liganderna. Den omodifierade grinantagonist Cilengitid är biselective för aVp3 / α5β1 subtyper. Genom metylering av den terminala N ω avguanidingruppen, en aVp3 selektiv ligand gav. Detta blockerar en viktig slut på interaktions som unikt observeras i α5β1, således inaktiverande liganden för denna integrin. Huvud interaktion med bindningsstället på aVp3 subtyp är ett slut-on interaktion som inte störs av detta samspel 10.

Genom modifiering av liganden med längre linker enheter ( "funktionalisering"), kan två mål nås på en gång: selektivitet genereras genom att bryta slut på interaktion med α5β1 subtyp och, på den andra sidan, de länk poäng av den bindningsficka, vilket möjliggör konjugering till stora enheter (t.ex. kelatorer eller fluorescerande färgämnen för avbildningstekniker) 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

TGK erkänner International Graduate School for Science and Engineering (IGGSE) av Technische Universität München för deras ekonomiska stöd. HK erkänner Centrum för Integrated Protein Science Munich (CIPSM) för deras stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%  Sigma Aldrich 434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99% Sigma Aldrich T84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5% Carl Roth 4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8% Carl Roth 5182
Methanol anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98% Sigma Aldrich 225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5% Carl Roth 8424
Silica gel for flash chromtaography Sigma Aldrich 60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99% Carl Roth 8720
n-Hexane, 99% Carl Roth CP47
Ethylacetate, 99.5% Carl Roth 7338
Aminohexanol, 95% Sigma Aldrich A56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98% Sigma Aldrich M84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99% Sigma Aldrich 205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8% Carl Roth A529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5% Carl Roth 2474
Acetic anhydrid, 99% Carl Roth 4483
Chlortrityl resin Carbolution CC11006
Fmoc-Gly-OH, 98% Carbolution CC05014
Piperidin, 99% Sigma Aldrich 104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OH Iris-Biotech FAA1502
HATU, 99% Carbolution CC01011
HOAt, 99% Carbolution CC01004
Fmoc-Val-OH Carbolution CC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97% Sigma Aldrich N11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99% Sigma Aldrich 27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99%  Sigma Aldrich M6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98% Sigma Aldrich 139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98% Sigma Aldrich 47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98% Carbolution CC05008
Hexafluoroisopropanol Carbolution CC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97% Sigma Aldrich 178756 ALDRICH
TFA, 99.9% Carl Roth P088
Triisopropylsilan, 98% Sigma Aldrich 233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC grade Carl Roth HN44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Tags

Biokemi guanidin arginin peptid modifiering guanidinylation alkylering mitsunobu
Modifiering och funktionalisering av guanidingruppen från Skräddarsydda prekursorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler,… More

Kapp, T. G., Fottner, M., Kessler, H. Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors. J. Vis. Exp. (122), e54873, doi:10.3791/54873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter