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Biology

मापने नाइट्राइट और नाइट्रेट, मेटाबोलाइट्स नाइट्रिक ऑक्साइड मार्ग में, जैविक सामग्री में Chemiluminescence विधि का उपयोग

Published: December 25, 2016 doi: 10.3791/54879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Molecular Medicine Branch, NIDDK, NIH

Abstract

नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) संवहनी homeostasis और यह भी एक न्यूरोट्रांसमीटर में मुख्य नियामक अणुओं में से एक है। Enzymatically उत्पादित सं विभिन्न ऑक्सी हीम प्रोटीन और अन्य अभी भी अच्छी तरह से नहीं जाना जाता रास्ते के साथ बातचीत के द्वारा नाइट्राइट और नाइट्रेट में ऑक्सीकरण हो जाता है। रिवर्स प्रक्रिया, सं में नाइट्राइट और नाइट्रेट की कमी पिछले एक दशक में स्तनधारियों में खोज की गई थी और यह संभव रास्ते या तो रोकने या हृदय, चयापचय और मांसपेशियों में विकारों की एक पूरी श्रृंखला है कि माना जाता है कम करने के लिए एक के रूप में ध्यान प्राप्त कर रहा है सं के कम स्तर के साथ जुड़ा हो। खून, शरीर के तरल पदार्थ और विभिन्न ऊतकों - यह शरीर के विभिन्न डिब्बों में कोई और इसकी चयापचयों की राशि का अनुमान करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। रक्त, इसकी आसान पहुंच के कारण, सं चयापचयों के आकलन के लिए इस्तेमाल को प्राथमिकता दी कम्पार्टमेंट है। अपने छोटे जीवनकाल (कुछ मिसे) और कम उप nanomolar एकाग्रता, कोई खून का सीधा विश्वसनीय माप के कारण <उन्हें> विवो उपस्थित महान तकनीकी कठिनाइयों में। इस तरह कोई उपलब्धता आमतौर पर इसकी ऑक्सीकरण उत्पादों, नाइट्राइट और नाइट्रेट की मात्रा पर आधारित अनुमान है। इन दो चयापचयों हमेशा अलग से मापा जाता है। वहाँ कई अच्छी तरह से स्थापित तरीकों जैविक तरल पदार्थ और ऊतकों में उनकी सांद्रता निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं। यहाँ हम chemiluminescence विधि (सीएल) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, सप्ताह में तीन आयोडाइड या वैनेडियम (तृतीय) क्लोराइड समाधान क्रमश नाइट्राइट या नाइट्रेट कमी के बाद कोई spectrophotometrical का पता लगाने पर आधारित है। नाइट्राइट और नाइट्रेट का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता कम nanomolar रेंज है, जो सबसे ज्यादा संवेदनशील विधि कोई चयापचय मार्ग में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध के रूप में सीएल सेट में है। हम कैसे आदेश संग्रह और कैसे के समय के नमूनों में उनके संबंधित मात्रा निर्धारित करने के लिए कम से नाइट्राइट और नाइट्रेट वर्तमान की मूल राशि को बनाए रखने के लिए जैविक तरल पदार्थ और ऊतकों से नमूने तैयार करने के लिए विस्तार से समझाओ। सीएल तकनीक की सीमाएं भी विस्तार कर रहे हैंlained।

Introduction

नाइट्राइट, और एक कम का विस्तार करने के लिए नाइट्रेट, रक्त में स्तर को प्रतिबिंबित शरीर के समग्र राज्य का कोई चयापचय। रक्त में नाइट्राइट सांद्रता और सबसे अंगों और ऊतकों हैं केवल उच्च nanomolar या कम micromolar रेंज में, नाइट्रेट आमतौर पर बहुत अधिक मात्रा में मौजूद है - micromolar रेंज में। या आहार आदतों में परिवर्तन रोग प्रगति के कारण नाइट्राइट के स्तर में परिवर्तन काफी छोटे हैं और केवल एक बहुत ही संवेदनशील पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है। क्योंकि उनके बहुत विभिन्न स्तरों और विभिन्न चयापचय की प्रक्रिया को, नाइट्राइट और नाइट्रेट के स्तर के अलग दृढ़ संकल्प जरूरी है। तथाकथित "नहीं x दृढ़ संकल्प" जहां नाइट्राइट और नाइट्रेट एक साथ मापा जाता है बहुत कम मूल्य है।

विभिन्न जैविक नमूने में नाइट्राइट बढ़ाता के लिए कई तरीकों का विकास किया गया है - सबसे आम प्राचीनतम जा रही है, Griess प्रतिक्रिया है कि मूल रूप से यहां तक ​​कि आधुनिक modificatio के साथ 1879 में वर्णित किया गया था पर आधारितएनएस, Griess 'विधि द्वारा प्राप्य नाइट्राइट के लिए संवेदनशीलता सीमा कम micromolar रेंज में है। Chemiluminescence (सीएल), सप्ताह में तीन आयोडाइड समाधान को कम करने के साथ संयुक्त, वर्तमान में सबसे संवेदनशील तरीका माना जाता है, नाइट्राइट सांद्रता 1-8,10,11 की कम nanomolar रेंज में मात्रा का ठहराव की इजाजत दी। एक ही सीएल विधि, वैनेडियम (तृतीय) क्लोराइड समाधान को कम करने के साथ संयुक्त, नाइट्रेट के संवेदनशील मापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, nanomolar रेंज 9 में परिशुद्धता के साथ।

सीएल मुक्त गैस कोई पता लगाता है। इसलिए, नाइट्राइट, नाइट्रेट, आर nitrosothiols (आर-SNO), आर nitrosoamines (आर-NNO), या धातु-नो यौगिकों (बाद में पांडुलिपि के रूप में भेजा "आर (एक्स) -नहीं"), में परिवर्तित किया जाना चाहिए आदेश सीएल के माध्यम से उनके मूल मात्रा यों में कोई गैस मुक्त। नहीं करने के लिए कई अलग अलग रूपांतरण को कम करने के समाधान का उपयोग कर हासिल की है, नहीं मेटाबोलाइट की प्रकृति पर निर्भर करता है। रूपांतरण के बाद, मुक्त कोई गैस एक वाहक गैस (वह, एन द्वारा प्रतिक्रिया पोत से पर्ज है2 या आर) सीएल विश्लेषक की प्रतिक्रिया कक्ष जहां ओजोन (ओ 3) कोई साथ संयुक्त है नाइट्रोजन डाइऑक्साइड के लिए फार्म में (सं 2) अपनी सक्रिय राज्य में। जमीन राज्य में लौटने के साथ, कोई 2 * अवरक्त क्षेत्र में उत्सर्जन करता है और उत्सर्जित फोटोन photomultiplier सीएल साधन की (पीएमटी) द्वारा पता चला है। उत्सर्जित प्रकाश की तीव्रता सीधे प्रतिक्रिया कक्ष में कोई एकाग्रता, जो उचित अंशांकन घटता का उपयोग मूल प्रजातियों की एकाग्रता की गणना के लिए अनुमति देता है के लिए आनुपातिक है।

हमारे प्रोटोकॉल में, हम सबसे अधिक इस्तेमाल किया नैदानिक ​​सेटिंग में नाइट्राइट और नाइट्रेट की पहली उपस्थित CL-आधारित दृढ़ संकल्प - रक्त और प्लाज्मा में, और फिर हम कैसे ऊतकों के नमूनों में इन आयनों निर्धारित करने के लिए चर्चा की। हम यह भी कि कैसे इस तरह के खून और उसके डिब्बों, प्लाज्मा और लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में नाइट्राइट प्रतिक्रियाशील वातावरण में मूल शारीरिक नाइट्राइट एकाग्रता संरक्षित करने के लिए विस्तार से समझाओ।

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Protocol

जानवरों के उपयोग सहित सभी प्रोटोकॉल NIDDK पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है और मानव रक्त दाताओं से स्वस्थ एनआईएच ब्लड बैंक से प्राप्त हुई थी।

1. नमूना तैयार

  1. नाइट्राइट संरक्षण समाधान की तैयारी
    1. एक समाधान 890 मिमी पोटेशियम ferricyanide युक्त तैयार (कश्मीर 3 फे (सीएन) 6) और आसुत जल में 118 मिमी NEM (एन ethylmaleimide)। अच्छी तरह से भंग है जब तक यह वर्तमान में कोई क्रिस्टल के साथ स्पष्ट पीला है। 9 अनुपात (वी / वी, एनपी 40 / समाधान): एनपी 40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) एक 1 में जोड़ें। धीरे मिक्स एक सप्ताह के बारे में 4 डिग्री सेल्सियस पर झाग और दुकान से बचने के लिए)।
  2. संग्रह और रक्त के नमूनों की तैयारी
    1. कम से कम एक 20 जी सुई का उपयोग हेपरिन के साथ hemolysis से बचने के लिए जमावट (5 यू / एमएल) को रोकने के लिए खून ले लीजिए। पूरे रक्त के नमूने लिए, नाइट्राइट एक 1 में तुरंत समाधान के संरक्षण के साथ रक्त मिश्रण: 4 अनुपात (v/ वी समाधान / रक्त)।
    2. प्लाज्मा और लाल रक्त कोशिकाओं के नमूने लिए, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर 5 मिनट के लिए एकत्र रक्त लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और प्लाज्मा अलग करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा) ले लो और नाइट्राइट के रूप में प्लाज्मा में नाइट्राइट स्तरों के निर्धारण के लिए ऊपर वर्णित समाधान के संरक्षण के साथ मिश्रण।
    3. ध्यान से शेष नमूना और ट्यूब के नीचे से पिपेट आरबीसी नमूना से प्लाज्मा और बफी कोट एक कट ऑफ विंदुक टिप का उपयोग रक्त कोशिकाओं के अन्य प्रकार से संक्रमण से बचने के हटाने, और उसी में नाइट्राइट संरक्षण समाधान युक्त एक ट्यूब में यह हस्तांतरण ऊपर के रूप में अनुपात।
    4. 1 या 1: एक अनुपात 1 में ठंड मेथनॉल के साथ प्रत्येक नमूना (प्लाज्मा और आरबीसी) मिक्स 2 (वी / वी नमूना / मेथनॉल) और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र प्रोटीन वेग। सतह पर तैरनेवाला ले लो और नाइट्राइट माप के लिए इसका इस्तेमाल या तैयार नमूनों फ्रीज, अगर -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान पर, की जरूरत है।
      नोट: नाइट्राइट तेजी से वजहरक्त बनाने नाइट्रेट में oxyhemoglobin (oxyHb) के साथ सीटीएस। oxyHb हमेशा नाइट्राइट से अधिक बड़े अधिक में मौजूद है के बाद से, इस प्रतिक्रिया ~ के 10 मिनट के लिए एक समय सीमा के साथ देशी रक्त नाइट्राइट के लगभग पूर्ण विनाश की ओर जाता है। आदेश अंतर्जात रक्त नाइट्राइट का सबसे को संरक्षित करने के लिए, नाइट्राइट-संरक्षण समाधान तुरंत रक्त ड्रॉ के बाद पूरे रक्त के नमूने लिए कहा है। समाधान तेजी से लाल रक्त कोशिकाओं है कि रासायनिक नाइट्राइट साथ प्रतिक्रिया नहीं करता हीमोग्लोबिन की एक निष्क्रिय फार्म lyse और methemoglobin (metHb) में oxyHb oxidize जाएगा।
  3. शरीर के तरल पदार्थ के अन्य प्रकार से नमूनों की तैयारी
    1. उचित कंटेनर में नमूना संग्रह के बाद, नाइट्राइट संरक्षण समाधान, deproteinate के साथ अच्छी तरह से मिलाएं और तुरंत उपाय या -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और दुकान।
  4. संग्रह और ऊतकों के नमूनों की तैयारी
    1. heparinized खारा समाधान (10 यू HEPA के साथ perfused जानवरों से ऊतकों लीजिएरिन / एमएल)। आबकारी वांछित ऊतक के बारे में 1 ग्राम और homogenize या तो एक मैनुअल homogenizer या एक स्वचालित homogenizer का उपयोग।
    2. नाइट्राइट के रूप में चिकनी homogenate हासिल करने की जरूरत समाधान के संरक्षण के नाम से जाना जाता राशि जोड़ें।
    3. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर (2 अनुपात वी / वी नमूना / मेथनॉल: 1 या 1 1) के रूप में ऊपर वर्णित है, 13,000 XG पर तो सेंट्रीफ्यूज नमूने एक बार ऊतक homogenized है, ठंड मेथनॉल का उपयोग कर प्रोटीन वेग।
    4. सतह पर तैरनेवाला और उपाय नाइट्राइट का स्तर लीजिए। यदि आवश्यक हो, -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान पर तैयारी के किसी भी स्तर पर नमूने फ्रीज।

2. समाधान को कम करने की तैयारी

  1. त्रि-आयोडाइड (मैं 3) नाइट्राइट और आर (एक्स) -नहीं प्रजातियों दृढ़ संकल्प 1,3,4 के लिए समाधान को कम करने
    1. 138 मिमी पानी में मेरे पास 2 समाधान के साथ एक साथ 301 मिमी KI का एक समाधान तैयार है। सब जब तक ~ 30 मिनट के लिए एक चुंबकीय दोषी पर 7 अनुपात (वी / वी समाधान / एसिड): 2 में हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ मिक्सक्रिस्टल भंग कर रहे हैं। अधिमानतः, अंधेरे बोतल में रखने के रूप में आयोडाइड प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, और तैयारी से एक सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
      नोट: यह समाधान नहीं में नाइट्राइट कम हो जाएगा और यह भी आर-SNO, आर NNO और फे कोई कार्यात्मक समूह (आर (एक्स) -नहीं) से कोई रिलीज नहीं होगी, लेकिन नाइट्रेट प्रभावित नहीं होगा। ऊपर कोई आधारित कार्य समूहों से संकेत acidified sulfanilamide (एएस) के रूप में इलाज की तुलना और इलाज संकेत के साथ नमूना के आधे के उपचार से सच नाइट्राइट संकेत से अलग किया जा सकता है। के रूप में अचल नाइट्राइट साथ diazonium केशन रूपों और इस जटिल मैं 3 समाधान से कम नहीं किया जा सकता है। उपचार के रूप में के लिए, 1 एम एचसीएल में sulfanilamide के 290 मिमी समाधान तैयार है और अनुपात 1 में नमूने के एक विभाज्य में जोड़ें: 9 (वी / वी के रूप में / नमूना)। उपाय के नमूने के रूप में इलाज और इलाज भागों में सीएल संकेत। नमूने के रूप में इलाज और इलाज भाग के एक अंतर के रूप में सच्चा नाइट्राइट संकेत गणना। नाइट्राइट भी एक चयनात्मक लीख का उपयोग करके मापा जा सकता हैसंस्कार को कम हिस्सा 2.2 में वर्णित के रूप में एस्कॉर्बिक / एसिटिक एसिड के मिश्रण का समाधान। हालांकि, की वजह आर (एक्स) -नहीं प्रजातियां मौजूद हैं, की आम तौर पर छोटे-राशि के रूप में इलाज के नमूने का उपयोग माप कुल नाइट्राइट सामग्री का एक बहुत अच्छा सन्निकटन ज्यादातर मामलों में हैं।
  2. एस्कॉर्बिक एसिड / एसिटिक एसिड (4 क) नाइट्राइट 2 के चुनिंदा निर्धारण के लिए समाधान
    1. पानी में 500 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड तैयार करें। प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए 7 (वी / वी, एस्कॉर्बिक एसिड / एसिटिक एसिड): एक अनुपात 1 में हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ इस समाधान मिश्रण।
      नोट: यह समाधान नाइट्राइट के लिए विशिष्ट है, किसी भी आर (एक्स) -नहीं प्रजाति या नाइट्रेट से कोई रिलीज नहीं होगी। हालांकि, एस्कॉर्बिक और एसिटिक एसिड के समाधान, माप से पहले हर दिन के हौसले से तैयार किया जाना चाहिए के रूप में एस्कॉर्बिक अम्ल आसानी से समाधान में ऑक्सीकरण होता।
      नाइट्राइट कमी के समापन एस्कॉर्बिक एसिड एकाग्रता पर निर्भर करता है; और कम से कम 50 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड पूरा R के लिए सिफारिश की हैप्लाज्मा नाइट्राइट की शिक्षा। हालांकि, यह अंतिम नमूना माप से पहले होने की उम्मीद है नाइट्राइट एकाग्रता रेंज में एस्कॉर्बिक एसिड और नाइट्राइट मानकों के विभिन्न सांद्रता के साथ कुछ पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने की सिफारिश की है। ध्यान रखें कि एस्कॉर्बिक एसिड थोड़ा माप के दौरान depletes, कांच प्रतिक्रिया कक्ष में प्रतिक्रिया मिश्रण के इतने लगातार परिवर्तन की सिफारिश की है।
  3. Vanadium (तृतीय) क्लोराइड नाइट्रेट दृढ़ संकल्प 9 के लिए कम करने के समाधान
    1. 1 एम एचसीएल में VCL 3 की 51 मिमी समाधान तैयार है। एक अंधेरे बोतल में 200 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से फिल्टर समाधान, दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
      नोट: यह समाधान नाइट्रेट, नाइट्राइट और सभी आर (एक्स) -नहीं प्रजातियों कम हो जाएगा, तो गणना की जानी है, तो नाइट्राइट या अन्य आर के तुलनीय मात्रा में (एक्स) -नहीं प्रजातियां एक साथ नाइट्रेट के साथ मौजूद हैं, अंतिम नाइट्रेट सामग्री है VCL 3 और मैं साथ प्राप्त सीएल संकेतों के बीच अंतर के रूप में3 समाधान को कम करने।

3. Chemiluminescence (सीएल) विश्लेषक सेटअप और माप

  1. मानक समाधान
    1. (नैनो 2) सोडियम नाइट्राइट का 1 माइक्रोन समाधान तैयार है। एक ही समाधान नाइट्राइट और नाइट्रेट निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. कोई विश्लेषक का उपयोग
    नोट: वर्तमान में दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं एनालाइजर कि जैविक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए काफी संवेदनशील होते हैं - Sievers नोआ और Ecophysics CLD 88Y। वे दोनों एक ही सिद्धांत पर काम; मुख्य अंतर यह है कि CLD 88Y कमरे में हवा से ऑक्सीजन का उपयोग करता है ओजोन बनाने के लिए है (ओ 3), NOA इस उद्देश्य के लिए एक बाहरी ऑक्सीजन टैंक की आवश्यकता है। प्रक्रिया नीचे Sievers NOA के लिए सेट अप का वर्णन है।
    1. साधन सेटअप
      1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार कोई विश्लेषक के आरंभिक सेट के लिए प्रदर्शनके रूप में चित्रा 1 पर देखा।
      2. ओपन हे 2 टैंक साधन से जुड़ा है। "विश्लेषण" चुनें और सामने पैनल पर मुख्य मेनू से "प्रवेश"। अगले स्क्रीन पर चुनें "शुरू" और प्रेस "दर्ज करें।" के रूप में चित्रा 1 में देखा साधन के लिए एसिड जाल (युक्त 1 एम NaOH) कनेक्ट।
      3. जब तक photomultiplier नीचे -12 डिग्री सेल्सियस तापमान पर ठंडा और प्रतिक्रिया कक्ष 6 Torr को खाली करा लिया गया है रुको। यह एक स्थिर फ्लैट आधारभूत तक पहुंचने के लिए के बारे में 30 मिनट लगते हैं। आधारभूत 1 के भीतर स्थिर करने की जरूरत है - 2 एम वी, अपने नाममात्र मूल्य अपनी स्थिरता से भी कम महत्वपूर्ण नहीं है।
        नोट: नाइट्रेट मापा जाता है, ठंडा पानी से स्नान (4 डिग्री सेल्सियस, जो एसिड और पानी वाष्प के लिए ठंड के रूप में कार्य करता है के जाल में सेट) और पानी गर्म स्नान (मुख्य प्रतिक्रिया कक्ष, 95 डिग्री सेल्सियस) पर बारी। VCL 3 समाधान में नाइट्रेट की कमी NO में की दर तापमान पर निर्भर है, और यह कमरे के न्यू यॉर्क में बहुत धीमी हैrature, तापमान के इतने पर्याप्त वृद्धि की प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने की जरूरत है।
      4. उन्होंने टैंक खुला और चित्रा 1 पर देखा एसिड फंसाने के लिए कांच प्रतिक्रिया कक्ष कनेक्ट। उचित कम करने के समाधान के साथ प्रतिक्रिया कक्ष भरें, न्यूनतम करने के लिए उत्साह से भरा हुआ कम करने और एसिड फंसाने के लिए प्रतिक्रिया कक्ष कनेक्ट। परीक्षण और त्रुटि का उपयोग करना, साधन सक्शन दर (आमतौर पर ~ 200 मिलीग्राम / Siever के NOA के लिए न्यूनतम) मैच के लिए वह बुदबुदाती दर को समायोजित।
      5. कंप्यूटर साधन को नियंत्रित करने पर मुड़ें और Labview आधारित तरल सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं। साधन और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, प्रेस के बीच संचार को चालू करने के लिए "प्रवेश" जब "डेटा मेनू" में जब तक स्क्रीन पढ़ता "उत्पादन सक्षम", तो प्रेस "स्पष्ट" डाटा स्क्रीन पर वापस लौटने के लिए।
      6. स्क्रीन पर एक स्थिर आधारभूत का पता लगाने के लिए प्रतीक्षा करें और पट के माध्यम से समाधान को कम करने में नमूने और नाइट्राइट मानकों इंजेक्शन लगाने शुरू करते हैं। हमेशा के लिए एक स्थिर आधारभूत पिछाड़ी तक पहुंचने के लिए इंतजारशिखर इंजी। यह 2 मिनट तक का समय लग सकता है। तरल सॉफ्टवेयर एक विकल्प के इंजेक्शन के लिए "मार्क" कई बार किया है और इंजेक्शन व्याख्या और यह एक अलग फ़ाइल (filename.info) डेटा फ़ाइल (filename.data) के लिए एक उपयोगी पूरक के रूप में इन टिप्पणियों के निर्यात करेगा।
      7. एक बार नमूने और मानकों को मापा जाता है, का चयन तरल सॉफ्टवेयर मेनू में विकल्प "रोक" - यह एक स्थायी "filename.data" के रूप में जाना जाता है फ़ाइल में एक अस्थायी फ़ाइल से डेटा लिखेंगे। दबाने "गर्भपात" विकल्प के लिए एक स्थायी फ़ाइल में अधिग्रहीत डेटा लिखने के बिना माप को समाप्त होगा।
      8. , प्रयोग को समाप्त प्रतिक्रिया पोत के शीर्ष पर पानी निकलने की टोंटी बंद करके प्रतिक्रिया पोत से मशीन काटना और एसिड जाल और प्रतिक्रिया पोत के बीच ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट करने के लिए (चित्रा 1 देखें)। अब रोक NOA विश्लेषक - प्रेस "स्पष्ट", "विश्लेषण", पर "स्टैंडबाय" और "पुष्टि" स्टैंडबाय मशीन लगाने के लिए जाना। अगर नियमित रूप से इस्तेमाल कियासाधन कई हफ्तों के लिए स्टैंडबाई मोड में छोड़ा जा सकता है। ऑक्सीजन की आपूर्ति बंद कर दें। तो फिर प्रतिक्रिया कक्ष हैं, काट से कम करने के समाधान निकलवाने और कांच प्रतिक्रिया पोत से वह टैंक को बंद करने और प्रतिक्रिया पोत सफाई खत्म।
    2. मानक और नमूना इंजेक्शन
      1. एक अच्छी तरह से धोया हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग प्रतिक्रिया मिश्रण में 1 माइक्रोन नाइट्राइट समाधान के 50 μl इंजेक्षन। कम से कम 1 के लिए प्रतीक्षा करें - इंजेक्शन के बीच 2 मिनट चोटियों का अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए। 50 μl की दोहराएँ इंजेक्शन प्रत्येक डेटा बिंदु को डुप्लिकेट पाने के लिए। प्रत्येक इंजेक्शन के बाद विआयनीकृत पानी के साथ सिरिंज धो लें।
      2. , मानक वक्र के लिए डेटा का पूरा सेट प्राप्त करने के लिए 100, 150 μl के नकली इंजेक्शन के साथ जारी रखने के लिए (अतिरिक्त 200 μl जरूरत हो सकती है नाइट्राइट या नाइट्रेट की उच्च सांद्रता की उम्मीद कर रहे हैं) 1 माइक्रोन नाइट्राइट समाधान की। प्रत्येक मामले में, जब तक संकेत आधारभूत वापस चला जाता इंतजार करने के लिए ध्यान रखना और फिर 1 अधिग्रहण - 2 मीलआधारभूत के एन चोटियों का अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए।
        नोट: नाइट्राइट मानकों प्रयोगों के दौरान किसी भी समय पर मापा जा सकता है। हालांकि, यह डेटा माप से पहले की अवस्था मानक हासिल करने के लिए बेहतर है, क्योंकि यह भी साधन कार्यक्षमता की एक स्वतंत्र जांच के रूप में कार्य करता है।
        डेटा एकत्र कर रहे हैं, नमूने की राशि में अच्छी तरह से स्पष्ट चोटियों तक ले जाना चाहिए इंजेक्शन। हालांकि यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि photomultiplier केवल ~ 800 एम वी अप करने के लिए रैखिक है, इसलिए चोटी से कोई भी ~ 700 एम वी से अधिक होना चाहिए। इस राशि को इंजेक्शन के नमूने की कम या विआयनीकृत पानी के साथ नमूना गिराए द्वारा या तो हासिल की जा सकती है। प्रत्येक बिंदु दो प्रतियों में कम से कम मापा जाना चाहिए।

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Representative Results

चित्रा 2 मानकों और पाँच अलग अलग नमूने से एकत्र प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है। जैसा कि इस आंकड़े में दिखाया गया है, photomultiplier वोल्टेज बढ़ तुरंत बाद नाइट्राइट युक्त समाधान (मानकों या नमूने) समाधान को कम करने में इंजेक्ट किया जाता आधारभूत मूल्य को और रिटर्न इंजेक्शन में एक बार सभी नाइट्राइट वर्तमान (इंजेक्शन बार वक्र नीचे लाल तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं) समाधान कम हो गया था। यह भी यह आंकड़ा है कि सही मात्रा माप अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं से स्पष्ट है। हम सटीक हैमिल्टन सीरिंज का उपयोग कर इंजेक्शन की मात्रा को मापने के लिए सलाह देते हैं। मैं 3 (या एस्कॉर्बिक एसिड या VCL 3) समाधान की क्षमता को कम करने की हानि त्रुटि के एक अन्य आम स्रोत है। एक सामान्य नियम है, जब चोटियों के आधारभूत चौड़ाई काफी चौड़ा करने के लिए शुरू होता है, को कम करने प्रतिक्रिया कक्ष में समाधान परिवर्तित किया जाना है के रूप में। चोटी की चौड़ाई NO में गैस के प्रवाह पर निर्भर करता हैएक प्रतिक्रिया कक्ष (चित्रा 1 पर आर सी के रूप में चिह्नित), और यह थोड़ा एक प्रयोगात्मक एक और स्थापित करने के लिए से भिन्न होता है। हम पर विचार सामान्य चौड़ाई नाइट्राइट मापन के लिए और नाइट्रेट के मापन के लिए 2 मिनट के लिए ऊपर लगभग 1 न्यूनतम हो।

आदेश में पता चला सं की राशि के साथ photomultiplier से संकेत से संबंधित करने के लिए, एक मानक वक्र चोटी के तहत क्षेत्र के एक भूखंड और नाइट्राइट की राशि (pmol में) के रूप में निर्माण किया है के रूप में चित्रा 3 ए पर देखा इंजेक्शन। चोटी के तहत क्षेत्र को मापने के लिए किसी भी उपयुक्त सॉफ्टवेयर ऐसी उत्पत्ति, एक्सेल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है या पसंद है। इस वक्र, कश्मीर (चित्रा 3 बी में लाल रंग में चिह्नित) की ढलान, photomultiplier (प्रधानमंत्री) संकेत के 1 एम वी के सं के कारण वृद्धि की pmol की राशि देता है। चोटी के तहत वक्र के ढलान है, बजाय क्षेत्र का उपयोग करने का लाभ यह है कि कोई की तय राशि से संबंधित है, सटीक बढ़ जाती है। मानक वक्र कम से कम 3 अलग से निर्माण किया हैअंक, उनमें से प्रत्येक दो प्रतियों में मापा जा रहा है और अगर वहाँ कुछ अवशिष्ट नाइट्राइट या मानक समाधान तैयार करने के लिए उपयोग किए गए पानी में नाइट्रेट, कश्मीर का उपयोग कर इस अवशिष्ट मात्रा में करने के लिए सुधार की आवश्यकता समाप्त। इसके अलावा, अपने प्रधानमंत्री linearity के लिए NOA साधन के बारे में हमारी प्रारंभिक परीक्षणों के बाद, हमने पाया कि रेखीय प्रतिक्रिया 700 अप करने के लिए होता है - 800 एम वी। इसलिए, हमारे मानक वक्र इस PM सीमा तक नमूनों से सभी संकेतों के लिए मान्य है। linearity रेंज PM पर निर्भर करता है और समय के साथ बदल सकते हैं। यह पहले भी साधन पहली बार इस्तेमाल किया और प्रधानमंत्री उम्र के हर दो साल के रूप में परीक्षण किया गया है निर्धारित किया जाना चाहिए।

नमूने से एकत्र आंकड़ों एक समान तरीके से कार्रवाई कर रहे हैं के रूप में मानक की अवस्था के लिए एकत्र डेटा: पहला, चोटी के तहत क्षेत्र चुना गया है। फिर इस क्षेत्र मानक अवस्था है, जो सं pmol की संख्या इंजेक्शन नमूने की राशि से उत्पन्न कर देता है की ढलान कश्मीर से विभाजित है।

के रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया परिणाम आम तौर पर जैविक तरल पदार्थ (रक्त, मूत्र) के लिए या के रूप में ठोस नमूने के मामले में ऊतक के picomoles / ग्राम नाइट्राइट या नाइट्रेट एकाग्रता (एनएम या माइक्रोन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। डाटा तो चित्रा 3 बी में उदाहरण के लिए इसी तरह की साजिश रची जाती है। चित्रा 3 बी में दिए गए उदाहरण में हम साजिश रची 5 अलग-अलग पैनल ए में दिखाया गया नमूनों से परिणाम यहाँ हम 2 इंजेक्शन से औसत मूल्यों की साजिश और एसडी व्यक्ति बिंदु माप के reproducibility दिखाने के लिए दे।

चित्रा 3 में नमूने के लिए, एस 1, एस 2 और एस 4 चूहे रक्त और S3 और S5 चूहा जिगर रहे हैं। चित्रा -3 सी चलता अंतिम परिणाम के साथ एसडी एक साथ साजिश और एनएम में व्यक्त (रक्त के लिए, एन = 3) या प्रधानमंत्रीराजभाषा / मिलीग्राम ऊतक (जिगर के लिए, एन = 2)।

आकृति 1
चित्रा 1: Sievers NOA Chemiluminescence साधन का सेटअप। रिएक्शन पोत मैं 3 (एस्कॉर्बिक / एसिटिक एसिड या VCL 3) वह वाहक गैस धीरे माध्यम से बुदबुदाती के साथ समाधान से भर जाता है। नमूना मैं 3 समाधान जहां कोई संबंधित घटकों कोई गैस के लिए कम और सं विश्लेषक में किया जाता है में पट के माध्यम से हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग इंजेक्ट किया जाता है। ठंड जाल, NaOH से भरे जाल, और फिल्टर नमी और एसिड वाष्प के खिलाफ विश्लेषक की रक्षा करना। प्रतिक्रिया कक्ष में (आर सी) कोई गैस ओ 3 (ओ 3 जनरेटर में उत्पन्न) ऑक्सीजन से हे 2 टैंक से साथ संयुक्त है। सं 2 * से Chemiluminescence संकेत photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) द्वारा पता लगाया जाता है और आगे परिलक्षित और प्रसंस्कृत। डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण पीसी पर किया जाता है। वैक्यूम पंपप्रतिक्रिया कक्ष (आर सी) में कम दबाव बनाया और लकड़ी का कोयला फिल्टर (सीएफ) के माध्यम से chemiluminescence माप के बाद evacuates विषाक्त सं 2 गैस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सीएल द्वारा उत्पन्न कोई चोटियों के प्रतिनिधि प्लॉट। इस ग्राफ समय के एक समारोह के रूप में photomultiplier (पीएमटी) संकेत से पता चलता है। चोटियों (मानक) और नमूने के 100 μl 1 माइक्रोन नाइट्राइट समाधान के विभिन्न मात्रा के इंजेक्शन से परिणाम (एस 1 - S5) डुप्लिकेट और तीन प्रतियों में इंजेक्शन (नाइट्राइट मानक समाधान के 50 μl)। वक्र के तहत लाल तीर इंजेक्शन के समय से संकेत मिलता है। एक ला देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की rger संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3: मानक वक्र (ए) और चूहा खून और जिगर (बी) से प्रतिनिधि परिणाम, अंतिम परिणाम साजिश (सी)। मानक वक्र (एक पैनल), पानी में 1 माइक्रोन नाइट्राइट समाधान के 50, 100 और 150 μl इंजेक्शन लगाने चोटियों के तहत क्षेत्र को मापने के द्वारा प्राप्त किया गया था। ढलान, कश्मीर (लाल संख्या) photomultiplier वोल्टेज में एक 1mV वृद्धि के लिए कोई आवश्यक का nmol देता है। मूल मानक वक्र के लिए इस्तेमाल किया चोटियों चित्रा 2 में हैं और 50, 100 और 150 μl के रूप में चिह्नित कर रहे हैं। एस 1, एस 2 और एस 4 (डार्क ग्रे) चूहा खून से, S3 और S5 चूहा जिगर ऊतक से दो प्रतियों में सभी इंजेक्शन - चित्रा 2 भी हमारे लिए नमूने के लिए मूल इंजेक्शन से पता चलता है। इन चोटियों के तहत क्षेत्र मापा गया था और बाद में dilutions के लिए सभी सुधार हिस्सा 3.2.1 में वर्णित के रूप में बनाया गया था।, Resव्यक्ति के नमूनों के लिए पैनल बी में दिखाया गया ults pmol / जी जिगर में या रक्त के लिए एनएम में नाइट्राइट की राशि के रूप में गणना की गई। chemiluminescence विधि के reproducibility की सराहना करने के लिए, हम औसत और प्रत्येक व्यक्ति के लिए नमूना मानक विचलन साजिश रची। पैनल सी चलता अंतिम उत्पादों नाइट्राइट और चूहे खून और जिगर में नाइट्रेट मानक विचलन के साथ मिलकर जिगर के लिए रक्त और दो के लिए तीन अलग-अलग नमूनों की औसत के रूप में साजिश रची। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

(पानी सहित) सभी समाधान, तैयार पतला या अन्यथा के इलाज के लिए इस्तेमाल किया मूल नमूने की aliquots को बचाया जा सकता है और संभव नाइट्राइट या (अधिक बार) नाइट्रेट प्रदूषण के लिए जाँच की। हमने पाया है कि सबसे अधिक प्रदूषण को पानी से आता है और कई रसायनों भी कुछ बहुत सारे है कि अंतर्जात नाइट्रेट दृढ़ संकल्प के साथ हस्तक्षेप में नाइट्रेट प्रदूषण का महत्वपूर्ण मात्रा में होते हैं नमूना (विशेष रूप से ferricyanide) के इलाज के लिए इस्तेमाल किया। इसलिए हम नाइट्राइट और नाइट्रेट contaminants के लिए हमारे रसायनों के सभी जांच करने से पहले हम उन्हें नियमित रूप से प्रयोग में इस्तेमाल करते हैं।

चूंकि नमूने उपचार के दौरान पर्याप्त dilutions के लिए कई बार के अधीन किया जा सकता है, सभी नमूना जोड़तोड़ अंतिम एकाग्रता की गणना के लिए दस्तावेज की जरूरत है। अधिकांश गलतियों प्रोटोकॉल के इस हिस्से में बना रहे हैं।

जब नाइट्राइट माप, में त्वरित हस्तांतरण के लिए नमूने से निपटनेनाइट्राइट समाधान के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब ऐसे हीमोग्लोबिन, कि नाइट्राइट के साथ प्रतिक्रिया करता है और नाइट्रेट में ऑक्सीकरण के रूप में हीम युक्त प्रोटीन, मौजूद हैं। एक बार स्थिर, नमूने assays से पहले लंबे समय तक भंडारण के लिए जमे हुए किया जा सकता है।

जैविक नमूने (विशेष रूप से RX-सं) में कई सं चयापचयों की मात्रा बहुत कम कर रहे हैं, कभी कभी उत्पन्न सं का स्तर NOA विश्लेषक की पृष्ठभूमि शोर के स्तर पर हैं। यह हमेशा के लिए जितना संभव हो कम कमजोर पड़ने के साथ नमूने तैयार करने के लिए बेहतर है अगर ऐसे यौगिकों मापा जा रहे हैं।

तकनीक की सीमाएं

सावधान नमूना तैयार करने और इंजेक्शन के साथ, संवेदनशीलता की कम सीमा पूरी तरह से तैयार नमूने में कोई अभिवर्तन वर्तमान के 20 एनएम के करीब है। नाइट्राइट और नाइट्रेट के सामान्य जैविक सांद्रता इन सांद्रता से अधिक करते हैं, हालांकि, आर (एक्स) -नहीं मात्रा में इस सीमा के करीब गिर सकता है।

सीएल के उच्च सेनsitivity सावधान नमूना तैयार करने और सटीक मात्रा माप की मांग।

सं चयापचयों माप के वैकल्पिक तरीकों के सम्बंध में सीएल का महत्व

Chemiluminescence (सीएल) नहीं, नाइट्राइट, नाइट्रेट और RX-नो पता लगाने के लिए एक बहुत ही संवेदनशील तरीका है। वर्तमान में, सीएल कोई और इसकी चयापचयों के निर्धारण में सोने के मानक माना जाता है।

अन्य आम विकल्प नाइट्राइट का निर्धारण करने के Griess प्रतिक्रिया (जीआर) है। जीआर एक सुविधाजनक और सस्ता वर्णमिति विधि diazotization प्रतिक्रिया नाइट्रेट की 1879 विश्लेषण में पीटर Griess द्वारा वर्णित के आधार पर पहले की रासायनिक या नाइट्राइट को नाइट्रेट के enzymatic कमी की आवश्यकता है। सबसे अच्छा वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट, नाइट्राइट के लिए चारों ओर 100 एनएम संवेदनशीलता है सबसे नाइट्रेट और नाइट्रेट का निर्धारण करने के लिए अनुमति किट की संवेदनशीलता कम माइक्रोन के रेंज में है। जीआर का उपयोग करते नाइट्राइट और नमूने में नाइट्रेट का निर्धारण करने के लिए, दो कदम आवश्यक हैं; पहला, नाइट्राइट बजे निर्धारितount नमूना के पहले विभाज्य में है, तो दूसरी विभाज्य का उपयोग नाइट्राइट में नाइट्रेट को कम करने और कुल नाइट्राइट और नाइट्रेट (कभी कभी NOx के रूप में कहा गया है) नमूने में सामग्री को मापने के लिए। यह सच है कि नाइट्रेट मूल्य दोनों माप का अंतर है। इस दो कदम प्रोटोकॉल के लिए बेहतर विकल्प क्रोमैटोग्राफी द्वारा नाइट्राइट और नाइट्रेट की पूर्व जुदाई है। बहरहाल, यह काफी संवेदनशीलता कम हो जाती है और विश्लेषण के समय बढ़ जाती है।

भविष्य के अनुप्रयोगों

जैविक प्रणाली में कोई मार्ग के महत्व के बारे में बढ़ती सबूत के साथ, हम हृदय स्वास्थ्य के बायोमार्कर के रूप में नाइट्राइट या नाइट्रेट या अन्य कोई चयापचयों का अधिक लगातार उपयोग की उम्मीद है। वृद्धि सबूत भी पता चलता है कि इन अणुओं व्यायाम चिकित्सा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण हो सकता है और अपने स्तर से मधुमेह, मोटापा और उपापचयी सिंड्रोम के साथ लोगों में बदला जा सकता है।

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Disclosures

डॉ एलन चेस्टर हृदय रोगों के उपचार के लिए नाइट्राइट लवण के उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के लिए जारी किए गए कई पेटेंट पर एक सह-आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध है। उन्होंने कहा कि विकास के नैदानिक ​​लेकिन कोई अन्य मुआवजे के लिए इन पेटेंट के एनआईएच लाइसेंस के आधार पर रॉयल्टी प्राप्त करता है।

Acknowledgments

लेखक रक्त में नाइट्राइट मापन के लिए नाइट्राइट संरक्षण समाधान के उपयोग के विकास में डॉ ए Dejam और एम.एम. पेलेटियर के महत्वपूर्ण योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385
sulfanilamide; AS  Sigma S9251
HCl Sigma H1758
acetic acid, glacial Sigma A9967
ascorbic acid  Sigma A7506
potassium iodide; KI Sigma 60399
iodine; I2 Sigma 207772 light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2 Sigma 563218
vanadium(III) chloride; VCl3 Sigma 208272 ligt sensitive, toxic
GentleMac Miltenyi
Sievers NOA 280i GE
CLD 88Y  Ecophysics 

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References

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जैव रसायन अंक 118 नाइट्रेट नाइट्राइट नाइट्रिक ऑक्साइड chemiluminescence रक्त जानवरों के ऊतकों हृदय रोग रक्तचाप endothelial रोग
मापने नाइट्राइट और नाइट्रेट, मेटाबोलाइट्स नाइट्रिक ऑक्साइड मार्ग में, जैविक सामग्री में Chemiluminescence विधि का उपयोग
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Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. … More

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).

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