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Biology

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

doi: 10.3791/54879 Published: December 25, 2016

Abstract

산화 질소 (NO), 혈관 항상성과 같은 신경 전달 물질의 주요 조절 분자이다. 효소 생성 된 NO는 다양한 옥시 헴 (heme) 단백질 및 기타 아직 잘 알려져 있지 경로와 상호 작용에 의해 아질산염과 질산염으로 산화된다. 역방향 프로세스는 NO로 아질산염 및 질산염의 환원은 지난 10 년 포유류에서 발견되었다 그것을 방지하거나 것으로 생각된다 심혈관, 대사 및 근육 질환의 전체 범위를 완화하는 하나의 가능한 경로들 중 하나로서 주목 받고있다 NO의 감소 된 수준과 연관 될 수있다. 혈액, 체액 및 다양한 조직 - 다른 신체 구획 NO 및 대사 물질의 양을 추정하는 것이 중요하다. 혈액 의한 쉬운 접근성, NO 대사 추정을 위해 사용되는 것이 바람직 함이다. 그것의 짧은 수명 (밀리 초)과 낮은 서브 나노 몰 농도, NO 혈액의 직접 신뢰할 수있는 측정에 <EM> 생체 본 큰 기술적 인 문제입니다. 따라서 예약 가능한 보통의 산화 생성물, 아질산, 질산의 양에 기초하여 추정되지 않는다. 이 두 대사는 항상 개별적으로 측정된다. 생물학적 체액 및 조직에서 자신의 농도를 결정하기 위해 몇 가지 잘 확립 된 방법이 있습니다. 여기에서 우리는 각각 트리 요오드 또는 바나듐 (III) 클로라이드 솔루션에 의해 아질산염이나 질산염 감소 후 NO의 spectrophotometrical 검출에 기초하여, 화학 발광 법 (CL)에 대한 프로토콜을 제시한다. 아질산염 및 질산염 검출 감도는 NO 대사 경로의 변화를 결정하기 위해 현재 이용 가능한 가장 민감한 방법으로 CL 설정 낮은 나노 몰 범위이다. 우리의 샘플에서 각각의 양을 결정하는 방법과 수집시 아질산염 및 질산염 본 원래 양을 보존하기 위해 생물학적 유체 및 조직으로부터 샘플을 준비하는 방법을 상세히 설명한다. CL 기술의 한계도 특급lained.

Introduction

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아질산염, 그리고 덜 확장 질산에, 혈액 수준은 신체의 전반적인 상태를 NO 신진 대사를 반영하지 않습니다. 마이크로 범위 - 아질산염의 혈중 농도와 대부분의 기관 및 조직은 높은 나노 몰거나 낮은 마이크로 몰 범위에서, 질산염이 훨씬 높은 금액에 일반적으로 존재한다. 인한 질병 진행에 아질산 수준의 변화 나 식생활의 변화는 상당히 작기 때문에 단지 매우 민감한 방법을 사용하여 측정 할 수있다. 때문에 매우 다른 수준과 다른 대사 과정의, 아질산염과 질산염 수준의 별도의 결정이 필수적이다. 아질산염과 질산염이 함께 측정 아주 작은 값을 가지고있다 "질소 산화물의 결정"소위 없습니다.

다양한 생물학적 시료의 아질산염의 정량을위한 여러 방법이 개발되어 - 가장 일반적인 원래도 현대 modificatio와 1879에서 설명되었던은 Griess 반응을 이용한 가장 오래된 하나 인NS는은 Griess '방법에 의해 달성 아질산염의 감도 한계는 낮은 마이크로 몰의 범위이다. 트리 요오드 용액을 환원 결합 화학 발광 (CL)은, 현재 아질산염 농도 1-8,10,11 낮은 나노 몰 범위의 정량화를 허용 가장 민감한 방법으로 간주된다. 바나듐 (III) 클로라이드 용액을 줄이는 조합 같은 CL에있어서, 상기 나노 몰 범위 9 정밀도, 질산 민감한 측정에 사용될 수있다.

CL은 무료 가스 NO를 감지합니다. 따라서, 아질산염, 질산염, R-nitrosothiols (R-SNO)는, R-니트로 소아 민 (R-NNO) 또는 금속 NO 화합물 (이후 원고라고도 "R- (X) -NO")로 변환해야 CL을 통해 원래의 양을 정량화하기 위해 NO 가스를 해제하지 않습니다. NO로 변환은 NO 대사 산물의 특성에 따라 여러 가지 환원 용액을 사용하여 달성된다. 변환 후에, 무료 NO 가스는 캐리어 가스 (그는, N에 의해 ​​반응 용기에서 제거되지이 오존 (O 3) 이산화질소를 형성 NO와 결합 CL 분석기의 반응 챔버 내로 AR) (NO 2)의 활성화 된 상태이다. 그라운드 상태로 되돌아와, NO 2 * 적외선 영역에서 방출 및 방출 광자 CL 악기의 광전자 증 배관 (PMT)에 의해 검출된다. 발광 강도는 적절한 보정 곡선을 사용하여 원래 종의 농도의 산출이 가능 반응 챔버의 NO 농도에 정비례한다.

우리의 프로토콜에서는 가장 많이 사용되는 임상 설정에서 아질산염과 질산염의 첫 번째 본 CL 기반의 결정 - 혈액과 혈장, 그리고 우리는 조직 샘플에서 이러한 이온을 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 혈액과 구획 혈장과 적혈구 등의 아질산염 - 반응성 환경에서 본래 생리 아질산염 농도를 보존하는 방법을 상세히 설명한다.

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Protocol

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동물의 사용을 포함한 모든 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었고, 인간의 혈액은 건강한 기증자로부터 NIH 혈액 은행에서 얻었다.

1. 샘플 준비

  1. 아질산염 보존 용액의 조제
    1. 890 MM의 페리 시안화 칼륨 함유 한 용액 준비 (K 3의 Fe (CN)을 6) 및 증류수에 118 밀리미터 NEM (N-에틸 말레이 미드). 그것은 현재없이 결정 노란색 선명해질 때까지 잘 녹여. 9 비율 (V / V를, NP-40 / 솔루션) : 1에서 NP-40 (옥틸 phenoxylpolyethoxylethanol)를 추가합니다. )에 대한 주 동안 4 ° C에서 발포 및 저장을 피하기 위해 부드럽게 섞는다.
  2. 수집 및 혈액 샘플의 제조
    1. 응고 (5 U / ㎖)을 방지하기 위해 헤파린 용혈을 방지하기 위해 적어도 20 G 바늘을 사용하여 혈액을 수집한다. (4 비율 절 : 전체 혈액 샘플의 경우, 아질산염은 1에서 즉시 해결책을 유지하여 혈액을 혼합/ V 솔루션 / 혈액).
    2. 혈장과 적혈구 샘플은 원심 분리 4 ℃에서 4,000 × g으로 5 분에 수집 된 혈액을 적혈구 (RBC) 및 혈장을 분리한다. 상층 액 (혈장)을 가지고 플라즈마 아질산염 농도의 측정에 대해 상술 한 바와 같이 아질산 용액을 유지와 함께 혼합한다.
    3. 조심스럽게 차단 피펫 팁을 이용하여 혈액 세포의 다른 형태에 의한 오염을 방지하기 위해 관의 하단에서 샘플 피펫 RBC 샘플로부터 혈장과 버피 코트를 나머지 제거 같은 아질산염 보존 용액을 함유하는 관에 옮긴다 상기와 비율.
    4. 1 또는 1 : 비율 1 냉 메탄올 각 샘플 (플라즈마 및 RBC)를 혼합 2 (v / V를 샘플 / 메탄올)과 단백질을 침전시켜 15 분 동안 4 ° C에서 13,000 XG에 그들을 원심 분리기. -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 필요한 경우, 상층 액을 가지고 아질산염 측정을 위해 사용하거나 준비된 샘플을 동결.
      참고 : 아질산염이 빠르게 REA혈액 형성 질산에 산화 헤모글로빈 (oxyHb)와 캐럿. oxyHb 항상 아질산 이상의 과량으로 존재하기 때문에,이 반응은 10 분 ~의 시간 프레임 네이티브 혈액 아질산 거의 완전히 소멸 리드. 내인성 혈액 아질산염의 대부분을 보존하기 위해, 아질산 보존 용액은 즉시 채혈 후의 전혈 샘플에 첨가한다. 용액을 신속하게, 화학적 아질산과 반응하지 않는 헤모글로빈의 비활성 형태 적혈구 용균 및 메트 헤모글로빈 (metHb) oxyHb로 산화된다.
  3. 다른 유형의 체액 샘플에서의 제조
    1. 적당한 용기에 시료 채취 후, 아질산 보존 솔루션, deproteinate과 잘 혼합하고 즉시 측정하거나 -80 ° C에서 동결 및 저장.
  4. 수집 및 조직 샘플의 제조
    1. 헤파린 염수 용액 (10 U 헤파 관류 동물 조직 수집린 / ㎖). 원하는 조직의 소비세 약 1 g 및 균질화 중 하나를 수동으로 균질화 또는 자동화 된 호모 게 나이저를 사용하여.
    2. 부드러운 균질를 달성하기 위해 필요한 솔루션을 보존 아질산염의 알려진 금액을 추가합니다.
    3. 15 분 동안 39 ° C에서 전술 한 바와 같이 (2 비 V / V 샘플 / 메탄올 : 1 또는 1) 13,000 XG에서 원심 분리 한 후 시료의 조직이 균질화되면, 냉 메탄올을 사용하여 단백질을 침전.
    4. 뜨는 및 측정 아질산염 수준을 수집합니다. 필요한 경우, -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 대한 준비의 모든 단계에서 샘플을 동결.

솔루션을 감소 2. 준비

  1. 트라이 - 요오드 (I 3) 아질산염 및 R- (X) -NO 종 결정 1,3,4에 대한 솔루션을 감소
    1. 물에 138 밀리미터 I 2 용액과 함께 301 mM의 KI 용액을 준비합니다. 모든 때까지 ~ 30 분 동안 자기 교반기 7 비율 (V /의 / v 용액 산) : 2 빙초산과 혼합결정을 용해시킨다. 바람직하게는 요오드화 민감한 빛으로 어두운 병에 보관하고, 제조로부터 1 주일 이내에 사용한다.
      참고 :이 솔루션은 NO에 아질산염을 줄일 수 있으며 또한 R-SNO, R-NNO 및 Fe-NO 작용기 (R-(X) -NO)에서 NO 해제되지만, 질산염은 영향을받지 않습니다. 상기 NO 계 관능기로부터 신호 산성화 설파 닐 아미드 (AS) 및 AS 처리 비교 미처리 신호 샘플의 절반의 처리에 의해 참된 아질산 신호로부터 분리 될 수있다. AS 비가 역적으로 아질산으로 디아 조늄 양이온을 형성하고,이 복합체는 I 3 용액에 의해 감소 될 수 없다. 치료 AS를 들어, 1 M 염산에 설파 닐 아미드의 290 mM의 용액을 제조하고 비 1 시료의 분취 량에 추가 : 9 (v / V를 AS / 샘플). 샘플의 AS 처리 및 치료 부분에서 CL 신호를 측정한다. 샘플의 AS 처리 및 처리되지 않은 부분의 차이로 실제 아질산염 신호를 계산합니다. 아질산염은 선택적 NIT를 사용하여 측정 할 수있다라이트 저감 ​​부 2.2에 기재된 아스코르브 / 아세트산 혼합물 용액. 그러나, 본 -NO 종 R- (X)의 보통 소량 AS 미처리 샘플을 이용하여 측정 아질산 총 함량의 좋은 근사 대부분의 경우에 의한.
  2. 아질산염 2의 선택적 결정을위한 아스코르브 산 / 아세트산 (4A) 솔루션
    1. 물에 500 밀리미터의 아스 코르 빈산을 준비합니다. 반응 혼합물을 제조 7 (V / V, 아스코르브 산 / 아세트산) 비율 1 빙초산이 용액을 혼합한다.
      참고 :이 솔루션은 아질산염에 대한 특정이며, 모든 R- (X) -NO 종 또는 질산에서 NO 공개하지 않습니다. 아스코르브 산 용액에 쉽게 산화 그러나 아스코르브 아세트산 용액을 매일 측정 전에 신선하게 제조되어야한다.
      아질산 환원 완료 아스코르브 산 농도에 의존한다; 적어도 50 MM의 아스 코르 빈산는 전체 R을 권장합니다플라즈마 아질산 냄. 그러나, 이전의 마지막 샘플의 측정을 기대 아질산염 농도 범위 아스코르브 산과 아질산 표준 상이한 농도로 몇 파일럿 실험을 수행 할 것을 권장한다. 아스 코르 빈산 약간 측정하는 동안 고갈 있다는 사실을 숙지, 유리 반응 챔버의 반응 혼합물을 너무 자주 변경을 권장합니다.
  3. 질산 판정 9 바나듐 (III) 클로라이드 환원 용액
    1. 1 M 염산에 식 VC1 3의 51 mM의 솔루션을 준비합니다. 어두운 병에 200 μm의 필터와 매장을 통해 필터 솔루션은 2 주 이내에 사용한다.
      참고 :이 솔루션은 질산염, 아질산염 및 모든 R- (X) -NO 종을 줄일 수 있으므로 계산하는 아질산염 또는 기타 R-의 비교 양 (X) -NO 종을 함께 질산과 존재, 최종 질산염 함량이 경우 식 VC1 3 I 얻어진 CL 신호들 간의 차이로서 용액을 감소시킨다.

3. 화학 발광 (CL) 분석기 설치 및 측정

  1. 표준 용액
    1. 아질산 나트륨 용액을 1 μM (에 NaNO 2)을 준비한다. 동일한 용액 아질산염 및 질산염 결정에 사용될 수있다.
  2. NO 분석기를 사용하지
    참고 : 현재 생물학적 연구 목적으로 충분히 구분이 상업적으로 사용 가능한 분석기가 없습니다 - SIEVERS NOA와 Ecophysics CLD의 88Y이. 이들은 모두 동일한 원리로 동작; 주요 차이점은 CLD 88Y 오존 있도록 실내 공기로부터 산소를 사용하는 것이다 (O 3) NOA이 목적을 위해 외부 산소 탱크를 필요로있다. 아래의 절차는 SIEVERS NOA의 설정을 설명합니다.
    1. 장비 설치
      1. 제조업체의 권장 사항에 따라 NO 분석기의 초기 설정을 수행합니다로 그림 1에서 볼.
      2. 악기에 연결 열기 O 2 탱크. "분석"을 선택하고 전면 패널의 주 메뉴에서 "입력". 다음 화면에서 선택 "시작"을 누르면 "입력합니다." 그림 1에서 볼 수 있듯이 악기 (1 M NaOH를 함유) 산 트랩을 연결합니다.
      3. 광전자 증은 -12 ° C 이하의 온도로 냉각하고, 반응 챔버는 6 토르에 철수 될 때까지 기다립니다. 그것은 안정된 평면 기준에 도달하기 약 30 분 소요됩니다. 베이스 라인은 (1) 내에 안정 필요 - 2 MV, 공칭 값은 안정성보다 중요하다.
        참고 : 질산염을 측정하는 경우, 냉각 (산, 물, 증기뿐만 냉각 트랩을 제공 4 ° C에서 설정) 수조 및 가열 수조 (주 반응 챔버, 95 ° C)를 켭니다. 식 VC1 3 용액에 질산 NO의 감소율은 온도 의존적이며, 실내 템페 매우 느리다rature는 온도 정도로 크게 증가하여 반응을 관찰 할 필요가있다.
      4. 헬륨 탱크를 열고 그림 1에서와 같이 산 함정에 유리 반응 챔버를 연결합니다. 적절한 환원 용액과의 반응 챔버를 채우고 최소 버블을 감소시키고 산 트랩에 반응 챔버를 연결한다. 시행 착오를 사용하여 악기 흡입 속도 (Siever의 NOA에 대한 보통 ~ 200 ml / 분)와 일치하는 그는 버블 링 속도를 조정합니다.
      5. 기기를 제어하는 ​​컴퓨터를 켜고와 LabVIEW 기반의 액체 소프트웨어를 시작합니다. 악기와 수집 소프트웨어를 누르 사이의 통신을 설정하려면 화면이 표시 될 때까지 "데이터 메뉴"의 "출력 활성화"할 때, 다음 "명확한"를 눌러 데이터 화면으로 다시 돌아갑니다 "입력".
      6. 화면에 안정적인베이스 라인 추적 기다린 격막을 통해 솔루션을 감소로 샘플 및 아질산염 기준을 주입 시작합니다. 항상 안정된베이스 라인 후방에 도달하는 대기피크 어. 이 2 분까지 걸릴 수 있습니다. 액상 소프트웨어는 주입의 옵션을 "마크"시간을 가지고 있으며, 사출 주석과 데이터 파일 (filename.data)에 유용한 보완와 같은 별도의 파일 (filename.info)에 이러한 의견을 내 보냅니다.
      7. 시료와 표준 측정되면, 선택 액체 소프트웨어 메뉴에서 옵션을 "중지"-이 "filename.data"로 알려진 영구 파일에 임시 파일에서 데이터를 기록합니다. 누르면 "중단"옵션은 영구적 인 파일로 수집 된 데이터를 작성하지 않고 측정을 종료합니다.
      8. 실험 종료 반응 용기의 상부에 콕을 해제하여 반응 용기에서 시스템을 분리하고 아세트산 트랩 반응기 튜브 사이를 분리하기 위해 (도 1 참조). 지금 NOA 분석기를 중지 -를 눌러 "일반", "대기 모드"와 "확인"대기 기계를 넣어 "분석"로 이동합니다. 정기적으로 사용 된 경우기기는 몇 주 동안 대기 상태로 남아있을 수있다. 산소의 공급을 끕니다. 이어서, 반응 챔버로부터 단절 환원 용액을 비우고 유리 반응 용기에서 그 탱크를 닫고 반응 용기 세정을 완료.
    2. 표준 및 샘플 주사
      1. 잘 세척 해밀턴 주사기를 이용하여 반응 혼합물에 1 μM 아질산 용액 50 ㎕를 주입한다. 피크의 좋은 분리를 달성하기 위해 주사 사이의 2 분 - 최소 1 기다립니다. 50 μL의 반복 주입은 각 데이터 포인트에 중복을 얻을 수 있습니다. 각 주사 후 탈 이온수로 주사기를 씻으십시오.
      2. 1 μM 아질산염 용액 100, 150 μL의 중복 주사를 계속, 표준 곡선 데이터의 전체 세트를 획득하려면 (아질산염 또는 질산염의 높은 농도이 예상되는 경우 추가 200 μL 필요). 각각의 경우에, 신호가 기준으로 다시 떨어질 때까지 기다려야하는데주의를 기울여야하고 1 취득 - 2 마일베이스 라인의, n은 피크의 좋은 분리를 달성했다.
        주 : 아질산염 표준은 실험하는 동안 언제든지 측정 할 수있다. 또한 기기의 기능의 독립적 체크로서 기능하지만, 이는, 데이터 측정하기 전에 표준 곡선을 취득하는 것이 바람직하다.
        데이터가 수집되면, 시료의 양이 아니라 발음 봉우리로 연결되어야 주입. 그러나이 광전자 증 배관이 만 ~ 800 MV 최대 선형 있음을 명심해야한다 그래서 피크 아무도 ~ 700 MV보다 높을 수 없습니다. 이 주입 양은 시료의 감소 또는 탈 이온수를 이용하여 시료를 희석하여를 얻을 수있다. 각 점은 중복 적어도 측정해야한다.

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Representative Results

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그림 2는 표준과 다섯 가지의 샘플에서 수집 한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 도면에 도시 된 바와 같이, 광전자 전압 증가 아질산염 - 함유 용액 (표준 또는 샘플) 용액을 감소 주입 직후의 기준 값으로 복귀 주입에 한꺼번에 아질산 본 (주사 시간은 적색 곡선 아래의 화살표로 표시된다) 용액을 감소시켰다. 또한 정확한 부피 측정 재현성 높은 데이터를 얻기 위해 필요한 동 도면으로부터 분명하다. 우리는 사출 볼륨을 측정하는 정밀 해밀턴 주사기를 사용하는 것이 좋습니다. I (3) (또는 아스코르브 산 또는 식 VC1 3) 용액의 용량을 감소 손실은 에러의 또 다른 일반적인 원인이다. 피크의 기준 폭은 반응 실 내의 용액이 변경되어야 감소 상당히 넓게 시작 원칙적있다. 피크 폭은 NO로 가스 흐름에 따라(그림 1에 RC로 표시) 반응 챔버는, 그것은 약간 다른 설정 한 실험에 따라 다릅니다. 우리는 보통 폭이 아질산염 측정 및 질산염 측정을위한 2 분까지 약 1 분이라고 생각.

검출 된 NO의 양을 갖는 광전자 증 배관으로부터의 신호를 관련하기 위해, 표준 곡선이 피크 아래의 면적의 플롯 및 (pmol의)에서 아질산의 양으로 구성되는도 3A에 표시되는 주사. 피크 아래의 면적을 측정하기 위해 임의의 적절한 소프트웨어 등의 원산지, 엑셀로 사용하거나 좋아 할 수 있습니다. (그림 3B에서 빨간색으로 표시)이 곡선, K의 기울기는, 광전자 증 배관 (PM) 신호의 1 MV의 NO의 원인이 증가 pmol의 양을 제공합니다. NO의 정량 관련된 피크 아래의 곡선의 기울기가 아닌 영역을 사용하는 장점은 정확성을 증가시킨다. 표준 곡선은 적어도 3 가지로 구성되어있다포인트는, 그들 각각의 중복 측정 및 K를 사용하여 표준 용액을 제조하는데 사용되는 물에 일부 잔존 아질산이나 질산이 존재하는 경우,이 잔량에 대한 수정의 필요성이 제거된다. 800 MV - 또한, 그 오후 선형성 NOA 악기의 우리의 초기 테스트에 따라, 우리는 선형 응답이 700까지 발생하는 결정. 따라서, 우리의 표준 곡선이 오후 범위까지 샘플에서 모든 신호에 유효합니다. 선형성 범위는 오후에 의존와 시간이 변경 될 수 있습니다. 이 장비가 처음 사용과 오후 세 모든 몇 년 같이 시험 전에 결정해야합니다.

먼저, 피크 아래의 면적을 결정한다 : 표준 곡선에 대해 수집 된 데이터가 샘플로 수집 된 데이터는 유사한 방식으로 처리된다. 그 후이 영역은 NO의 pmol의 수가 주입 시료의 양에 유래 제공 표준 곡선의 기울기를 K로 분할된다.

도 3b에 도시 된 바와 같이, 결과는 일반적으로 생물학적 체액 (혈액, 소변) 또는 고체 시료의 경우에는 조직의 picomoles / g 등의 아질산염 또는 질산염 농도 (㎚ 또는 μM)로 표현된다. 데이터는 그림 3B의 예와 유사하게 그려진다. 도 3b에 주어진 예에서 우리는 패널 A. 5에 도시 개별 샘플의 결과는 여기에 우리가 2 주사에서 평균 값을 플롯과 각 지점 측정의 재현성을 표시하는 SD를 제공 꾸몄다.

그림 3의 샘플의 경우, S1, S2와 S4는 쥐의 혈액과 S3와 S5 쥐의 간입니다. 도 3c는 (N = 3 혈액의 경우) 또는 오후 최종 결과는 SD와 함께 플롯과 nM의 표현을 보여줍니다올 / mg의 조직 (간에있어서, n = 2).

그림 1
그림 1 : SIEVERS NOA 화학 발광 장비의 설치. 반응 용기는 그 캐리어 가스가 부드럽게 통해 버블 링 I 3 (아스코르브 / 아세트산 또는 식 VC1 3) 용액으로 충전된다. 샘플은 NO 관련 구성 요소가 NO 가스 감소하지 않고 NO 분석기로 수행되는 I 3 용액에 격막을 통해 해밀턴 주사기를 사용하여 주입한다. 콜드 트랩, NaOH를 충전 트랩 필터는 습도와 산 증기에 대해 분석기를 보호합니다. 반응 챔버 내에서 (RC) NO 가스 O 2 탱크로부터의 산소 (O 3 발생기에서 발생) O (3)와 결합된다. NO 2 *의 화학 발광 신호는 광전자 증 배관 (PMT)에 의해 검출하고 상기 증폭 처리된다. 데이터 수집 및 분석은 PC에서 실행된다. 진공 펌프반응 챔버 (RC)에서 낮은 압력을 만들어 숯 필터 (CF)를 통해 화학 발광 측정 후 독성 NO 2 가스를 배기한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : CL에 의해 생성 된 NO 피크의 대표 플롯. 이 그래프는 시간의 함수로서 광전자 증 배관 (PMT) 신호를 나타낸다. 봉우리는 1 μM 아질산 솔루션의 다양한 양의 (표준) 및 샘플 100 ㎕의 주사 결과 (S1 - S5) 중복 및 중으로 주입 (아질산 표준 용액 50 μL). 곡선 아래 빨간색 화살표는 주사의 시간을 나타냅니다. 라를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rger 버전입니다.

그림 3
그림 3 : 표준 곡선 (A)와 쥐 혈액 및 간 (B)의 대표 결과, 최종 결과 플롯 (C). 표준 곡선 (패널 A)은 물에 1 μM 아질산 용액 50, 100, 150 μl를 주입하는 피크 아래의 면적을 측정함으로써 얻어졌다. 기울기는, K (빨간색 수) 광전자 증 전압의 1mV의 증가에 필요한 NO의 nmol의를 제공합니다. 표준 곡선에 사용되는 기존 피크는 그림 2에있는 50, 100, 150 μL로 표시됩니다. S1, S2와 S4 (어두운 회색) 쥐의 혈액에서, S3 및 S5 쥐의 간 조직에서 모든 중복 주입 - 그림 2는 또한 우리의 샘플 원래 주사를 보여줍니다. 일부 3.2.1에 설명 된대로 희석에 대한 모든 수정 사항이 후 이러한 봉우리 면적을 측정 하였다., 입술각각의 샘플에 대한 패널 B에 도시 ULTS는 pmol의 / g 간 또는 혈액 nM의에서 아질산염의 양으로 계산 하였다. 화학 발광 법의 재현성을 이해하기 위해, 우리는 각각의 샘플에 대한 평균과 표준 편차를 꾸몄다. 패널 C는 쥐의 혈액과 간에서 최종 제품의 아질산염과 질산염은 표준 편차와 함께 간을 위해 혈액과 두 세 개의 개별 샘플의 평균으로 그려 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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프로토콜 내에서 중요한 단계

원래 샘플을 준비 희석하거나 치료하는 데 사용 (물 포함) 모든 솔루션의 분취 량을 저장해야하고 가능 아질산염 또는 (더 자주) 질산염 오염 검사. 우리는 대부분의 오염 물에서 오는 많은 화학 물질이 또한 내생 질산 결정을 방해하는 몇 가지 많이에서 질산염 오염의 상당량을 함유 샘플 (특히 페리 시안화)을 치료하는 데 사용되는 것으로 나타났습니다. 우리는 일반 실험에 사용하기 전에 따라서 우리는 아질산염과 질산염 오염 물질에 대한 우리의 화학 물질을 모두 확인합니다.

샘플 희석 치료 동안 실질적으로 수 차례 실시 할 수 있으므로, 모든 조작은 샘플을 최종 농도 계산에 기록 될 필요가있다. 대부분의 실수는 프로토콜의이 부분에 만들어집니다.

아질산염의 측정으로 빠른 전송을 위해 샘플을 취급 할 때용액을 보존 아질산염은 아질산과 반응하여 질산으로 산화시킨다 헤모글로빈 등 헴 - 함유 단백질, 존재할 때 특히 중요하다. 일단 안정화, 샘플을 분석하기 전에 장기간 보관을 위해 냉동 할 수 있습니다.

생물학적 시료 (특히, RX-NO) 여러 NO 대사 물질의 양은 때때로 생성 된 NO의 농도는 NOA 분석기의 배경 잡음 레벨에 매우 낮다. 이러한 화합물을 측정 할 경우 항상 가능한 한 적은 희석하여 시료를 준비하는 것이 바람직하다.

기술의 한계

주의 샘플 준비 및 주사로, 감도의 하한은 완벽하게 준비된 샘플에서 NO 부가 존재하는 20 nM의 가까운 거리에 있습니다. 아질산염과 질산염의 일반적인 생물학적 농도이 농도를 초과 할, 그러나, R- (X)는 -NO 금액은 가까운 범위에 떨어질 수 있습니다.

CL의 높은 센sitivity 조심 샘플 준비 정확한 용적 측정을 요구한다.

NO 대사 측정의 대체 방법에 대한 CL의 의미

화학 발광 (CL)은 NO, 아질산염, 질산염 및 RX-NO를 검출하는 매우 민감한 방법이다. 현재, CL은 NO와 그 대사 산물의 결정에 황금 표준으로 간주됩니다.

아질산염을 결정하는 다른 일반적인 대안은 Griess 반응 (GR)입니다. GR 전에 화학적 또는 아질산을 질산 환원 효소를 필요 질산 1879 분석 베드로은 Griess 설명 디아 조화 반응에 기초한 편리하고 저렴 비색 방법이다. 베스트 현재 시판되는 키트는 질산 및 질산을 결정 할 수 있도록 가장 키트의 민감도는 낮은 μM의 범위에, 아질산염 100 nm의 주위에 감도를 가지고있다. 아질산염 및 질산염 샘플을 결정 GR을 사용하는 경우, 두 단계가 필요하다; 우선, 아질산 AM을 결정ount 샘플의 첫 번째 나누어지는에서, 다음 아질산염에 질산을 절감하고 (때로는 질소 산화물로 함) 총 아질산염과 질산염 샘플의 함량을 측정하기 위해 두 번째 나누어지는을 사용합니다. 질산 트루 값은 두 측정치의 차이이다. 이 두 단계 프로토콜에 대한 더 나은 대안은 크로마토 그래피에 의해 아질산염과 질산염의 사전 분리합니다. 그러나, 이러한 상당히 감도 저하 및 분석 시간을 증가시킨다.

미래의 응용 프로그램

생물학적 시스템의 NO 통로의 중요성에 대한 성장하는 증거로, 우리는 심장 혈관 건강의 바이오 마커로 아질산염 또는 질산 또는 다른 NO 대사의 빈번한 사용을 예견한다. 증가 증거는 이러한 분자 운동 의학에서 중요 할 수 있으며, 자신의 수준이 당뇨병, 비만 및 대사 증후군을 가진 사람들에서 변경 될 수 있음을 시사한다.

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Disclosures

박사 앨런있는 Schechter는 심혈관 질환의 치료를위한 아질산 염의 사용을 위해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 발행 된 여러 특허의 공동 발명자로 표시됩니다. 그는 임상 개발하지만 다른 보상을위한 특허의 NIH 라이선스에 따라 로열티를 받는다.

Acknowledgments

저자는 혈액에서 아질산염 측정을위한 아질산 보존 용액의 사용을 개발 박사 A. Dejam와 MM의 Pelletier의 중요한 기여를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385
sulfanilamide; AS  Sigma S9251
HCl Sigma H1758
acetic acid, glacial Sigma A9967
ascorbic acid  Sigma A7506
potassium iodide; KI Sigma 60399
iodine; I2 Sigma 207772 light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2 Sigma 563218
vanadium(III) chloride; VCl3 Sigma 208272 ligt sensitive, toxic
GentleMac Miltenyi
Sievers NOA 280i GE
CLD 88Y  Ecophysics 

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References

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화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정
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Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).More

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).

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