Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Измерение нитритов и нитратов, метаболиты в оксид азота Pathway, в биологических материалах с использованием метода хемилюминесценции

doi: 10.3791/54879 Published: December 25, 2016

Abstract

Оксид азота (NO), является одним из основных молекул регулятора в сосудистом гомеостазе, а также нейромедиатор. Ферментативно NO окисляется до нитритов и нитратов в результате взаимодействия с различными кислородно-гема белков и других до сих пор не очень хорошо известных путей. Обратный процесс, восстановление нитрита и нитрата в NO были обнаружены у млекопитающих, в последнее десятилетие, и все большее внимание привлекает как один из возможных путей, чтобы предотвратить или облегчить целый ряд сердечно-сосудистых, метаболических и мышечных расстройств, которые, как полагают, быть связано со снижением уровня NO. Поэтому важно, чтобы оценить количество NO и его метаболитов в различных отсеках тела - кровь, жидкости организма и различных тканей. Кровь, из-за его легкой доступности, является предпочтительным отделение используется для оценки NO метаболитов. Из-за короткого времени жизни (несколько миллисекунд) и низкой концентрации к югу от наномолярной, прямых надежных измерений крови NO <EM> в естественных условиях нынешних больших технических трудностей. Таким образом НЕТ Наличие не обычно оценивается на основе количества продуктов его окисления, нитритов и нитратов. Эти два метаболита всегда измеряются отдельно. Есть несколько хорошо известных методов для определения их концентрации в биологических жидкостях и тканях. Здесь мы приводим протокол для метода хемилюминесценции (CL), на основе спектрофотометрического обнаружения NO после нитритов или нитратов сокращения на три-йодида или ванадия (III) хлоридных растворов, соответственно. Чувствительность к нитритов и обнаружения нитратов находится в низком диапазоне наномолярной, который устанавливает CL как наиболее чувствительный метод имеющихся в настоящее время для определения изменений в NO метаболических путей. Мы подробно объяснить, как подготовить образцы из биологических жидкостей и тканей с целью сохранения первоначальных количеств нитрита и нитрата в настоящее время сбора и как определить их соответствующие суммы в образцах. Ограничения метода CL также ехржаловались,.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Нитриты и менее продлить нитратов, уровни в крови не отражают общее состояние организма NO метаболизм. концентрации нитрита в крови и большинство органов и тканей только в высокой наномолярной или низком диапазоне микромолярном, нитратов обычно присутствует в гораздо больших количествах - в микромолярном диапазоне. Изменения в уровнях нитритов вследствие прогрессирования заболевания или изменения привычек питания достаточно малы и могут быть измерены только с помощью очень чувствительный метод. Из-за их самых разных уровней и различных метаболических процессов, раздельное определение нитритов и нитратов уровней имеет важное значение. Так не называется "NO определения х" , где нитритов и нитратов измеряются вместе имеет очень мало значения.

Было разработано несколько методов количественного определения нитрита в различных биологических образцах - наиболее распространенным является самой старой, основанный на реакции Грисса, которые были первоначально описанной в 1879. Даже с современной modificatioнс, предел чувствительности для нитрита достижимый методом Грисс 'находится в низком диапазоне микромолярном. Хемилюминесценции (ХЛ), в сочетании с три-йодид раствора восстанавливающего, в настоящее время считается наиболее чувствительным методом, что позволяет количественно оценить в низком диапазоне наномолекулярных концентрации нитрита 1-8,10,11. Тот же метод CL, в сочетании с ванадий (III) , хлорид раствора восстанавливающего, могут быть использованы для чувствительных измерений нитратов, с точностью в диапазоне наномолярной 9.

CL обнаруживает свободный газ NO. Поэтому, нитриты, нитраты, R-нитрозотиолы (R-SNO), R-нитрозоамины (R-нно), или соединения металла NO (далее в рукописи упоминается как "R- (X) -NO"), должны быть преобразованы в бесплатно без газа для того, чтобы количественно оценить свои первоначальные суммы через CL. Преобразование в NO достигается с помощью нескольких различных восстанавливающих растворов, в зависимости от характера NO метаболита. После преобразования, свободный газ не удаляется из реакционного сосуда с помощью газа-носителя (He, N2 или Ar) в реакционную камеру анализатора CL , где озон (O 3) в сочетании с NO с образованием диоксида азота (NO 2) в активированном состоянии. С возвращением в основное состояние, NO 2 * излучает в инфракрасной области спектра и излучается фотон регистрируется ФЭУ (ФЭУ) КЛ инструмента. Интенсивность излучаемого света прямо пропорциональна концентрации NO в реакционной камере, что позволяет рассчитывать концентрацию исходных видов, используя соответствующие калибровочные кривые.

В нашем протоколе мы дадим сначала CL на основе определения нитритов и нитратов в наиболее часто используемых клинических условиях - в крови и плазме, а затем мы рассмотрим, как определить эти ионы в образцах ткани. Мы также подробно объяснить, как сохранить первоначальную физиологическую концентрацию нитритов в нитрит-реактивных средах, таких как кровь и его отделений, плазмы и красных кровяных телец.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все протоколы, включая использование животных были одобрены для использования NIDDK уходу и использованию животных комитета и человеческая кровь была получена из банка крови NIH от здоровых доноров.

1. Подготовка образцов

  1. Приготовление раствора нитрита с сохранением
    1. Готовят раствор , содержащий 890 мМ феррицианида калия (K 3 Fe (CN) 6) и 118 мМ NEM (N-этилмалеимид) в дистиллированной воде. Растворите хорошо, пока не станет ясно, желтый, без кристаллов присутствующих. Добавить NP-40 (октил phenoxylpolyethoxylethanol) в соотношении 1: 9 (об / об, NP-40 / раствор). Осторожно перемешать, чтобы избежать пенообразования и хранят при температуре 4 ° С в течение недели).
  2. Сбор и подготовка проб крови
    1. Сбор крови с использованием, по меньшей мере, 20 G иглы, чтобы избежать гемолиза с гепарином для предотвращения коагуляции (5 ед / мл). Для получения образца цельной крови, перемешать кровь с нитритом сохранением раствора сразу в соотношении 1: 4 (об/ Об раствора / кровь).
    2. Для получения плазмы и эритроцитов образцов, центрифуга собранную кровь в течение 5 мин при 4000 х г при 4 ° С для отделения красных кровяных клеток (эритроцитов) и плазмы. Возьмем супернатант (плазма) и смешать его с нитритом сохранением раствора, как описано выше, для определения уровня нитритов в плазме.
    3. Осторожно удалить остатки плазмы и поглощающее покрытие из образца и пипетки RBC образца из нижней части трубки, чтобы избежать загрязнения другими типами клеток крови с использованием среза пипетку, и передать его в пробирку, содержащую нитрит сохраняющее раствор в том же самом соотношение, как указано выше.
    4. Смешайте каждого образца (плазмы и эритроцитов) с холодным метанолом в соотношении 1: 1 или 1: 2 (объем / объем пробы / метанол) и центрифугировать их при 13.000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин для осаждения белков. Возьмите супернатант и использовать его для измерения нитритов или заморозить Приготовленные образцы, если это необходимо, на сухом льду и хранят при -80 ° С.
      Примечание: Нитрит быстро ReaКТС с оксигемоглобина (oxyHb) в формировании нитрата крови. Так как oxyHb всегда присутствует в большом избытке над нитрита, эта реакция приводит к почти полное уничтожение родного нитрита крови с временной рамкой из ~ 10 мин. Для того чтобы сохранить большую часть эндогенного нитрита крови, нитритов, сохраняющих раствор добавляют к цельной крови сразу после взятия крови. Раствор быстро лизировать эритроциты и окисляют oxyHb в метгемоглобин (metHb), неактивную форму гемоглобина, который не вступает в химическую реакцию с нитритом.
  3. Подготовка образцов из других видов жидкости организма
    1. После взятия пробы в соответствующий контейнер, хорошо перемешать с нитритом сохранением раствора, deproteinate и измерить сразу или заморозить и хранить при температуре -80 ° C.
  4. Сбор и подготовка образцов тканей
    1. Собирают ткани от животных увлажненную с гепарином солевым раствором (10 U HEPARin / мл). Акцизной около 1 г желаемой ткани и гомогенизируют либо с помощью ручного гомогенизатора или автоматизированный гомогенизатора.
    2. Добавить известное количество нитрита, сохраняющих решение по мере необходимости для достижения гладкой гомогената.
    3. После того, как ткань гомогенизируют, осадить белки с использованием холодного метанола (1: 1 или 1: 2 соотношение объем / объем образца / метанол), как описано выше, а затем центрифуга образцы при 13.000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин.
    4. Соберите супернатант и измерения уровней нитритов. При необходимости, заморозить образцы на любой стадии приготовления на сухом льду и хранят при -80 ° С.

2. Подготовка решений Снижение

  1. Tri-йодид (I 3) раствора восстанавливающего для нитритов и R- (X) -NO видов определения 1,3,4
    1. Приготовьте раствор 301 мМ KI вместе с 138 2 мМ раствора I в воде. Смешать с помощью ледяной уксусной кислоты в соотношении 2: 7 (об / об раствора / кислоты) на магнитной мешалке в течение ~ 30 мин, пока всекристаллы растворяются. Предпочтительно иметь в темную бутылку, как йодид чувствителен к свету, и использовать в течение одной недели с момента приготовления.
      Примечание: Это решение позволит сократить нитрита в NO , и он также выпустит NO из R-SNO, R-NNO и Fe-NO функциональных групп (R- (X) -NO), но нитрат не будут затронуты. Сигнал от вышеуказанных NO на основе функциональных групп могут быть отделены от истинного сигнала нитрита путем обработки половины образца с подкисленной сульфаниламида (AS) и сравнив AS-обработанных и необработанных сигналов. А.С. образуют необратимые диазония катион с нитритом и этот комплекс не может быть уменьшена путем I 3 раствора. Для лечения AS, подготовить 290 мМ раствора сульфаниламида в 1 М HCl и добавить его к аликвоте образца в соотношении 1: 9 (v / v AS / образец). Измерьте сигнал CL в AS-обработанных и необработанных участках образца. Вычислить истинный сигнал нитрита как разность AS-обработанных и необработанных части образца. Нитрит может быть также измерена с применением селективной нитобряду снижающих раствор аскорбиновой / смеси уксусной кислоты, как описано в части 2.2. Тем не менее, из-за обычно небольшого количества R- (X) -NO присутствующих видов, измерения с использованием в качестве необработанной пробы в большинстве случаев очень хорошее приближение общего содержания нитрита.
  2. Аскорбиновая кислота уксусная кислота Раствор / (4A) для селективного определения нитрита 2
    1. Приготовьте 500 мМ аскорбиновой кислоты в воде. Смешайте этот раствор с помощью ледяной уксусной кислоты в соотношении 1: 7 (об / об, аскорбиновая кислота / уксусная кислота) с получением реакционной смеси.
      Примечание: Это решение является специфическим для нитрита, не будет выпускать NO из любого R- (X) -NO видов или нитрат. Тем не менее, раствор аскорбиновой и уксусной кислоты должны быть подготовлены свеже каждый день перед измерениями, как аскорбиновая кислота легко окисляется в растворе.
      Завершение нитрита снижения зависит от концентрации аскорбиновой кислоты; и по меньшей мере 50 мМ аскорбиновой кислоты рекомендуется для полного гОбразование плазменного нитрита. Тем не менее, рекомендуется выполнить несколько пробных экспериментов с различными концентрациями аскорбиновой кислоты и стандартов нитрита в ожидаемом диапазоне концентраций нитритов до окончательных выборочных измерений. Имейте в виду, что аскорбиновая кислота слегка истощает во время измерений, рекомендуется так частые изменения реакционной смеси в реакционной камере стекла.
  3. Ванадий (III) , хлорид восстановительный раствор для определения нитратов 9
    1. Готовят 51 мМ раствор VCl 3 в 1 М HCl. Фильтр раствор через фильтр 200 мкм и хранить в темной бутылке, использовать в течение двух недель.
      Примечание: Пониженная нитраты, нитриты и все R- (X) -NO видов, так что, если сравнимые количества нитритов или других R- (X) , -NO виды присутствуют вместе с нитратом, конечное содержание нитратов следует рассчитать как разность между ХЛ сигналами , полученными с VCl 3 и I3 сокращения решений.

3. Хемилюминесценция (CL) Analyzer Настройка и Измерения

  1. Стандартное решение
    1. Готовят 1 мкМ раствор нитрита натрия (NaNO 2). То же самое решение может быть использовано для нитритов и нитратов определений.
  2. НЕ используя анализатор
    Примечание: В настоящее время два коммерчески доступных NO анализаторы , которые являются достаточно чувствительными для биологических целей исследований - Сиверс NOA и Ecophysics CLD 88Y. Они оба работают по тому же принципу; Основное различие заключается в том , что CLD 88Y использует кислород из воздуха в помещении , чтобы сделать озон (O 3), в то время как NOA требуется внешний бак кислорода для этой цели. Приведенная ниже процедура описывает набор вверх для Сиверса НОА.
    1. установка параметров прибора
      1. Выполнение начальной настройки на NO анализатора в соответствии с рекомендациями завода-изготовителякак видно на рисунке 1.
      2. Открыть O 2 бак подключен к прибору. Выберите "анализ" и "войти" в главном меню на передней панели. На следующем экране выберите "Пуск" и нажмите "Enter". Подключите кислоты ловушку (содержащего 1 М NaOH) к прибору , как показано на рисунке 1.
      3. Подождите, пока ФЭУ не остынет до температуры ниже -12 ° С, и реакционную камеру вакуумируют до 6 мм рт. Она занимает около 30 минут, чтобы достичь стабильного плоской базовой линии. Базовая линия должна стабилизироваться в течение 1 - 2 мВ, его номинальное значение имеет меньшее значение, чем его стабильность.
        Примечание: Если нитрат измеряется, включите ванну охлаждающей воды (устанавливается при 4 ° С, которая служит в качестве охлаждаемой ловушки для паров кислоты и воды) и нагрева водяной бане (основной реакционной камере, 95 ° C). Скорость восстановления нитрата в NO в 3 растворе Vcl зависит от температуры, и это очень медленно при комнатной Температура, так что значительное повышение температуры необходимо, чтобы наблюдать за реакцией.
      4. Откройте He бак и подключить стеклянную реакционную камеру к кислотной ловушке , как показано на рисунке 1. Наполните реакционную камеру с соответствующим восстанавливающим раствором, уменьшить прорывается к минимуму и соединить реакционную камеру к кислотной ловушке. С помощью метода проб и ошибок, регулировать скорость кипящий он соответствовал скорости всасывания прибора (обычно ~ 200 мл / мин для NOA Сивер в).
      5. Включите компьютер, контролирующий прибор и запустить программное обеспечение Liquid Labview основе. Для включения связи между прибором и программным обеспечением сбора данных, нажмите "ввод", когда в меню "данных", пока экран не читает "включен выход", а затем нажмите кнопку "Очистить", чтобы вернуться к экрану данных.
      6. Дождитесь стабильной базовой линии следа на экране и начать инъекционным образцы и стандарты нитритов в сокращении раствор через перегородку. Всегда ждать, чтобы достичь стабильного базового кормовой частиэр пик. Это может занять до 2 мин. Liquid программное обеспечение имеет возможность «отметить» времена инъекции и аннотирования инъекции, и она будет экспортировать эти комментарии в отдельный файл (filename.info) в качестве полезного дополнения к файлу данных (filename.data).
      7. После того, как образцы и стандарты измеряются, выберите "стоп" опцию в меню Liquid программного обеспечения - это будет записывать данные из временного файла в постоянный файл, известный как "filename.data". Опция При нажатии кнопки "прервать" прекратит измерение без записи полученных данных в постоянный файл.
      8. Для завершения эксперимента, отсоедините машину от реакционного сосуда, отключив запорный кран на верхней части реакционного сосуда и отсоедините трубку между кислотой ловушку и реакционный сосуд (см рисунок 1). Теперь остановить анализатор NOA - нажмите "Очистить", перейдите в раздел "анализ", поставить машину на "ожидания" и "Confirm" в режиме ожидания. Если используется регулярно, тоПрибор может быть оставлен в режиме ожидания в течение нескольких недель. Выключите подачу кислорода. Затем промойте восстанавливающий раствор из реакционной камеры, отсоединить и закрыть He бак из реакционного сосуда и стеклянный По окончании очистки реакционного сосуда.
    2. Стандарты и образцы инъекции
      1. Вводят 50 мкл 1 мкМ раствора нитрита в реакционной смеси с использованием хорошо промытый Гамильтон шприц. Подождите, по крайней мере, 1 - 2 мин между инъекциями, чтобы достичь хорошего разделения пиков. Повторите инъекции 50 мкл, чтобы получить дубликаты в каждой точке данных. Промыть шприц с деионизированной водой после каждой инъекции.
      2. Для получения полного набора данных для стандартной кривой, по-прежнему с повторяющимися инъекциями 100, 150 мкл (дополнительные 200 мкл могут быть необходимы, если высокие концентрации нитритов или нитратов, как ожидается) 1 мкМ раствора нитрита. В каждом случае, позаботиться, чтобы ждать, пока сигнал не падает обратно к базовой линии, а затем приобрести 1 - 2 милип базовой линии для достижения хорошего разделения пиков.
        Примечание: стандарты Нитриты могут быть измерены в любой момент во время экспериментов. Тем не менее, предпочтительно, чтобы приобрести стандартную кривую перед измерением данных, поскольку она также служит в качестве независимой проверки функциональных возможностей прибора.
        При сборе данных, количество образца впрыскивают должно привести к хорошо выраженных пиков. Однако следует иметь в виду, что фотоэлектронный линейна только до ~ 800 мВ, так что ни один из пика не должна быть выше, чем на ~ 700 мВ. Это может быть достигнуто либо за счет уменьшения количества от вводимой пробы или разбавления пробы деионизированной водой. Каждая точка должна быть измерена по крайней мере в двух экземплярах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты , полученные от стандартов и пяти различных образцов. Как показано на этом рисунке, увеличивается фотоэлектронный умножитель напряжения сразу после того, как нитриты, содержащих раствор (стандарты или пробы) вводят в сокращении раствор (инъекции раз обозначены красными стрелками ниже кривой) и возвращается к базовому значению, как только все нитрит, присутствующих в впрыскивается решение было уменьшено. Также ясно, из этого рисунка видно, что точные измерения объема необходимы для получения высокой воспроизводимости данных. Мы рекомендуем использовать прецизионные Hamilton шприцы для измерения объема впрыска. Потеря способности уменьшения в I 3 (или аскорбиновая кислота или Vcl 3) раствора является еще одним распространенным источником ошибок. Как правило, когда базовая ширина пиков начинает значительно увеличиваться, восстановительный раствор в реакционной камере должна быть изменена. Ширина пика зависит от потока газа в NOРеакционная камера (помечено как RC на рисунке 1), и она слегка изменяется от одного экспериментальной установки к другому. Мы считаем, что нормальная ширина составит около 1 мин для измерения нитритов и до 2 мин для измерения нитратов.

Для того чтобы связать сигнал с ФЭУ с количеством обнаруженного NO, стандартная кривая строится как график зависимости площади под пиком , и количество нитрита (в пмоль) впрыскивается , как показано на фигуре 3А. Для измерения площади под пиком любое подходящее программное обеспечение может быть использовано, например, происхождения, Excel или нравится. Наклон этой кривой, K (отмеченные красным цветом на рисунке 3б), дает количество пмоль NO вызывает увеличение 1 мВ ФЭУ сигнала (ПМ). Преимущество использования крутизну кривой, а не площадь под пиком, который связан с фиксированным количеством NO, повышается точность. Калибровочная кривая строится по крайней мере, 3 различныхточки, причем каждый из них измеряется в двух экземплярах, и если есть некоторый остаточный нитрит или нитрат в воде, используемой для приготовления стандартного раствора, используя K исключает необходимость поправок к этим остаточных количеств. Кроме того, после наших первоначальных испытаний NOA инструмента для его ПМ линейности, мы определили, что линейный отклик происходит до 700 - 800 мВ. Таким образом, наша стандартная кривая действительна для всех сигналов от образцов до этого диапазона ТЧ. Диапазон линейности зависит от PM и может меняться со временем. Она должна быть определена до того, как прибор впервые использован и испытаны, как PM возрастов каждые несколько лет.

Данные, собранные из образцов обрабатываются аналогичным образом, как и данные, собранные для стандартной кривой: Во-первых, площадь под пиком определяется. Затем эта область делится на склоне К стандартной кривой, которая дает число пмоль NO происходит от количества введенного образца.

фигуре 3В. Затем данные нанесены аналогично примеру на рисунке 3B. В примере , приведенном на рисунке 3B построена зависимость результатов от 5 отдельных образцов , показанных на панели A. Здесь мы наносим средние значения от 2 -х инъекций и дают SD , чтобы показать воспроизводимости отдельных точечных измерений.

Для получения образцов на рисунке 3, S1, S2 и S4 крови крыс и S3 и S5 печени крысы. показаны конечные результаты сюжет вместе с СД и выражали в нмоль (для крови, п = 3) или PMол / мг ткани (для печени, п = 2).

Рисунок 1
Рисунок 1: Настройка Сиверса NOA Хемилюминесцентный инструмента. Реакционный сосуд заполняют I 3 (аскорбиновая / уксусная кислота или Vcl 3) раствора с газом - носителем Он осторожно барботирования через. Образец вводится с помощью шприца Hamilton через перегородку в I 3 раствора , где NO связанные компоненты не сводятся к NO газа и осуществляется в NO анализатора. Холодная ловушка, NaOH заполненные ловушку, и фильтр защиты анализатора от паров влаги и кислот. В реакционной камере (RC) NO газ в сочетании с O 3 (генерируемой в генераторе O 3) из кислорода O 2 из бака. Хемилюминесценция сигнал от NO 2 * детектируется фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) и далее усиливается и обрабатывается. сбор и анализ данных выполняются на ПК. Вакуумный насоссоздается низкое давление в реакционной камере (RC) и эвакуирует ядовитое NO 2 газа после измерения хемилюминесценции через угольный фильтр (CF). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Представитель Участок замыкающих пиков , порожденных CL. Этот график показывает сигнал ФЭУ (ФЭУ) как функцию времени. Пики в результате инъекции различных количеств раствора 1 мкМ нитрита (стандартов) и 100 мкл образцов (S1 - S5) впрыскивается в дубликатах и ​​трех повторах (50 мкл стандартного раствора нитрита). Красные стрелки под кривой указывают время инъекций. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра а - ляrger версия этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Стандартная кривая (A) и Представитель Результаты из крысиной крови и печени (B), окончательные результаты Plot (C). Стандартная кривая (панель А) получают путем введения 50, 100 и 150 мкл 1 мкМ раствора нитрита в воде, измерения площади под пиками. Склон, K (красный номер) дает нмоль NO, необходимое для увеличения 1 мВ в ФЭУ напряжения. Оригинальные пики , используемые для стандартной кривой находятся на рисунке 2 , и помечены как 50, 100 и 150 мкл. На рисунке 2 также показаны исходные инъекции для наших образцов - S1, S2 и S4 (темно - серый) из крови крыс, S3 и S5 из ткани печени крыс, все инжектированных в дубликате. была измерена площадь под этими пиками и, после того, как были сделаны все исправления для разведений, как описано в части 3.2.1., РезULTS показаны на панели В отдельных образцах были рассчитаны как количество нитрита в пмоль / г печени или в нМ крови. Чтобы оценить воспроизводимости метода хемилюминесценции, мы построили средние значения и стандартные отклонения для каждого отдельного образца. Панель C показывает конечные продукты нитритов и нитратов в крови и печени крыс на графике как среднее из трех отдельных образцов крови и два для печени вместе со стандартным отклонением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Критические шаги в рамках Протокола

Аликвоты всех решений (включая воду), используемых для приготовления, разбавленные или иным образом обработать оригинальные образцы должны быть сохранены и проверены на предмет возможного нитрита или (чаще) загрязнение нитратами. Мы обнаружили, что наиболее загрязнение происходит из воды и многих химических веществ, используемых для лечения образца (кровяной), в частности, также содержат значительное количество нитратов загрязнения в некоторых партий, что мешает определению эндогенных нитратов. Таким образом, мы проверяем все наши химические вещества для нитритов и нитратов загрязняющих веществ, прежде чем мы используем их в обычном эксперименте.

Поскольку образцы могут быть подвергнуты существенной разведений несколько раз во время лечения, все образцы манипуляции должны быть документированы для окончательных расчетов концентрации. Большинство ошибок совершается в этой части протокола.

При работе с образцами для измерения нитритов, быстрого перехода вНитрит сохранение решение имеет решающее значение, особенно, когда гем-содержащих белков, таких как гемоглобин, который вступает в реакцию с нитритом и окисляет его в нитраты, присутствуют. После стабилизации, образцы могут быть заморожены для длительного хранения до анализов.

Суммы нескольких метаболитов NO в биологических образцах (особенно RX-NO) являются очень низкими, иногда уровни генерируемого NO находятся на фоновом уровне шума анализатора NOA. Всегда предпочтительно, чтобы подготовить образцы с минимальным разбавлением, как это возможно, если такие соединения должны быть измерены.

Ограничения техники

С помощью тщательной подготовки проб и инъекций, нижний предел чувствительности близок к 20 нМ NO аддукта, присутствующего в полностью подготовленной пробы. Обычные биологические концентрации нитритов и нитратов делают превышают эти концентрации, однако, R- (X), -NO суммы могут упасть близко к этому диапазону.

высокая сеном CL вствительности требует тщательной подготовки проб и измерения точного объема.

Значение CL в отношении к альтернативным методам измерений NO Метаболиты

ХЛ (CL) является очень чувствительным методом для обнаружения NO, нитритов, нитратов и RX-NO. В настоящее время CL считается золотым стандартом в определении NO и его метаболитов.

Другой распространенной альтернативой для определения нитрит является реакция Грисс (GR). GR является удобным и недорогим колориметрический метод, основанный на реакции диазотирования, описанной Грисс в 1879. Анализ нитратов требует предварительного химического или ферментативного восстановления нитрата в нитрит. Лучшие текущие коммерчески доступные наборы имеют чувствительность около 100 нМ для нитрита, чувствительность большинства комплектов, позволяющих определять нитратов и нитратов находится в диапазоне низких мкМ. При использовании ГР для определения нитритов и нитратов в пробе, требуются два шага; во-первых, определить нитрит утрав р а ф первой аликвоты образца, а затем использовать второй аликвоты для снижения нитратов в нитриты и измерить общую нитрит и нитрат (иногда называют NOx) содержание в образце. Истинное значение селитра представляет собой разность обоих измерений. Лучшей альтернативой этому протоколу в двух шагах является предварительное разделение нитритов и нитратов с помощью хроматографии. Тем не менее, это значительно снижает чувствительность и увеличивает время проведения анализа.

Будущие приложения

С ростом доказательств о значении NO пути в биологической системе, мы предвидим более частое использование нитрита или нитрата или других метаболитов NO в качестве биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний. Повышена данные также свидетельствуют о том, что эти молекулы могут играть важную роль в физической медицины и их уровни могут быть изменены у людей, страдающих сахарным диабетом, ожирением и метаболическим синдромом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Д-р Алан Шехтер указан как соавтор на нескольких патентов, выданных Национальным институтом здоровья для использования нитрита солей для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он получает лицензионные платежи, основанные на NIH лицензирования этих патентов для клинического развития, но никакой другой компенсации.

Acknowledgments

Авторы хотят признать важный вклад д-ра А. Dejam и М. М. Пеллетье в развитии использования нитрита сохранения раствора для измерения нитритов в крови.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385
sulfanilamide; AS  Sigma S9251
HCl Sigma H1758
acetic acid, glacial Sigma A9967
ascorbic acid  Sigma A7506
potassium iodide; KI Sigma 60399
iodine; I2 Sigma 207772 light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2 Sigma 563218
vanadium(III) chloride; VCl3 Sigma 208272 ligt sensitive, toxic
GentleMac Miltenyi
Sievers NOA 280i GE
CLD 88Y  Ecophysics 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
  2. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
  3. Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
  4. Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
  5. Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
  6. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
  7. Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
  8. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
  9. Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104, (5), 538-543 (1997).
  10. Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
  11. Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
Измерение нитритов и нитратов, метаболиты в оксид азота Pathway, в биологических материалах с использованием метода хемилюминесценции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).More

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter