Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Mätning nitrit och nitrat, metaboliter i kväveoxid Pathway, i biologiskt material med hjälp av kemiluminescens metod

doi: 10.3791/54879 Published: December 25, 2016

Abstract

Kväveoxid (NO) är en av de viktigaste regulatormolekyler i vaskulär homeostas och också en neurotransmittor. Enzymatiskt producerade NO oxideras till nitrit och nitrat genom interaktion med olika oxi-hem proteiner och andra ännu inte kända vägar. Den omvända processen, minskning av nitrit och nitrat till NO hade upptäckts i däggdjur under det senaste decenniet och det är få uppmärksamhet som en av de möjliga vägar för att antingen förhindra eller lindra en hel rad av kardiovaskulära, metaboliska och muskelrelaterade skador som tros vara associerad med minskade nivåer av NO. Det är därför viktigt att uppskatta mängden av NO och dess metaboliter i olika kropps fack - blod, kroppsvätskor och de olika vävnaderna. Blod, på grund av dess lätt tillgänglighet, är den föredragna fack som används för estimering av NO metaboliter. På grund av sin korta livstid (några millisekunder) och låg under nanomolar koncentration, direkta tillförlitliga mätningar av blod NO <em> In vivo nuvarande stora tekniska svårigheter. Således ingen tillgänglighet brukar uppskattas baserat på mängden av dess oxidationsprodukter, nitrit och nitrat. Dessa två metaboliter alltid mäts separat. Det finns flera väletablerade metoder för att bestämma deras koncentrationer i biologiska vätskor och vävnader. Här presenterar vi ett protokoll för kemiluminescens-metoden (CL), baserat på spectrophotometrical detektering av NO efter nitrit eller nitrat reduktion av tri-jodid eller vanadin (III) kloridlösningar, respektive. Känsligheten för nitrit och nitrat upptäckt är i låg nanomolära området, som sätter CL som den känsligaste metoden för närvarande tillgängliga för att bestämma förändringar i NO metaboliska vägar. Vi förklarar i detalj hur man förbereder prover från biologiska vätskor och vävnader för att bevara ursprungliga mängder nitrit och nitrat närvarande vid tidpunkten för insamling och hur man bestämmer deras respektive mängder i prover. Begränsningar av CL-tekniken är också expLained.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nitrit och till en mindre sträcka nitrat, i blodet återspeglar allmänna läget för kroppen NO metabolism. Nitritkoncentrationer i blodet och de flesta organ och vävnader är endast i hög nanomolära eller låga mikromolära området, är vanligtvis närvarande i mycket större mängder nitrat - i mikromolära området. Förändringar i nitritnivåer på grund av sjukdomsprogression eller förändringar i matvanor är ganska små och kan endast mätas med hjälp av en mycket känslig metod. På grund av sina mycket olika nivåer och olika metaboliska processer, är viktigt separat bestämning av nitrit och nitrat. Så kallade "NOx bestämningen", där nitrit och nitrat mäts tillsammans har mycket litet värde.

Flera metoder för att kvantifiera nitrit i olika biologiska prover har tagits fram - den vanligaste är den äldsta, baserat på Griess reaktion som hade ursprungligen beskrivits i 1879. Även med modern modifications, är låg mikromolära området känslighetsgränsen för nitrit uppnås genom Griess metoden. Kemiluminiscens (CL), i kombination med tri-jodid reducerande lösning, är för närvarande anses vara den mest känsliga metoden, vilket gör kvantifiering i det låga nanomolära området av nitritkoncentrationer 1-8,10,11. Samma CL-metoden, i kombination med vanadin (III) klorid reducerande lösning, kan användas för känsliga mätningar av nitrat, med precision i nanomolära området 9.

CL upptäcker fri gas NO. Därför, nitrit, nitrat, R-nitrosotioler (R-SNO), R-nitrosaminer (R-NNo), eller metall-NO föreningar (senare i manuskript kallat "R- (X) -NO"), måste omvandlas till gratis ingen gas för att kvantifiera sina ursprungliga belopp via CL. Omvandling till NO uppnås med hjälp av flera olika reducerande lösningar, beroende på naturen av NO-metaboliten. Efter konverteringen är gratis NO-gas avlägsnas från reaktionskärlet genom en bärgas (He, N2 eller Ar) i reaktionskammaren i CL analysator där ozon (O 3) kombineras med NO för att bilda kvävedioxid (NO 2) i sitt aktiverade tillstånd. Med återgång till grundtillståndet, NO2 * emitterar i infraröda området och utsända fotonen detekteras av fotomultiplikator (PMT) CL instrument. Intensiteten för emitterat ljus är direkt proportionell mot NO-koncentrationen i reaktionskammaren, vilket medger beräkning av koncentrationen av den ursprungliga arter med korrekta kalibreringskurvor.

I våra protokoll, vi först före CL-baserade bestämning av nitrit och nitrat i de mest använda kliniska - i blod och plasma och sedan diskuterar vi hur man kan bestämma dessa joner i vävnadsprover. Vi förklarar också i detalj hur man bevara den ursprungliga fysiologiska nitritkoncentrationen i nitrit reaktiva miljöer, såsom blod och dess fack, plasma och röda blodkroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla protokoll inklusive användningen av djur har godkänts för användning av NIDDK Animal Care och användning kommittén och humanblod erhölls från NIH Blodbanks från friska donatorer.

1. Provframställning

  1. Framställning av nitrit bevara lösningen
    1. Bered en lösning innehållande 890 mM kaliumferricyanid (K 3 Fe (CN) 6) och 118 mM NEM (N-etylmaleimid) i destillerat vatten. Lös väl tills den är klar gul utan kristaller närvarande. Lägga NP-40 (oktyl phenoxylpolyethoxylethanol) i en 1: 9-förhållande (volym / volym, NP-40 / lösning). Blanda försiktigt för att undvika skumning och förvara vid 4 ° C i ungefär en vecka).
  2. Insamling och beredning av blodprover
    1. Samla in blod med användning av åtminstone en 20 G nål för att undvika hemolys med heparin för att förhindra koagulering (5 U / ml). För helblodprovet, blanda blod med nitrit bevara lösningen omedelbart i en 1: 4-förhållande (v/ Volym lösning / blod).
    2. För plasma och röda blodkroppar prover, centrifugera det uppsamlade blodet i 5 minuter vid 4000 xg vid 4 ° C för att separera röda blodkroppar (RBC) och plasma. Ta supernatanten (plasma) och blanda det med nitrit bevara lösning såsom beskrivits ovan för bestämning av nitritnivåer i plasma.
    3. Försiktigt bort återstående plasma och buffycoat från provet och pipetten RBC prov från botten av röret för att undvika förorening av andra typer av blodceller med hjälp av en cut-off pipettspetsen och överföra det till ett rör innehållande nitrit bevara lösning i samma förhållande som ovan.
    4. Blanda varje prov (plasma och RBC) med kall metanol med ett förhållande 1: 1 eller 1: 2 (volym / volym prov / metanol) och centrifugera dem vid 13.000 xg vid 4 ° C under 15 min för att fälla ut proteiner. Ta supernatanten och använda den för nitrit mätning eller frysa framställda proverna, om det behövs, på torr is och förvara vid -80 ° C.
      Obs: Nitrit Rea snabbtCTS med oxyhemoglobin (oxyHb) i blodbildande nitrat. Eftersom oxyHb är alltid närvarande i stort överskott över nitrit, leder denna reaktion till nästan fullständig utplåning av nativt blod nitrit med en tidsram på ~ 10 min. För att bevara de flesta av endogent blod nitrit, är nitrit bevarande lösning till helblod omedelbart efter bloddragningen. Lösningen kommer snabbt lysera röda blodkroppar och oxidera oxyHb in methemoglobin (MetHb), en inaktiv form av hemoglobin som inte kemiskt reagerar med nitrit.
  3. Beredning av prover från andra typer av kroppsvätska
    1. Efter provsamling i lämplig behållare, blanda väl med nitrit bevara lösning, deproteinate och mäta omedelbart eller frysa och förvara vid -80 ° C.
  4. Insamling och beredning av vävnadsprov
    1. Samla vävnader från djur perfuserade med hepariniserad koksaltlösning (10 U HEPArin / ml). Punkt ca 1 g önskad vävnad och homogenisera antingen genom att använda en manuell homogenisator eller en automatiserad homogenisator.
    2. Lägg känd mängd av nitrit bevara lösning som krävs för att uppnå jämn homogenatet.
    3. När vävnaden är homogeniserad, fälla ut proteiner med användning av kall metanol (1: 1 eller 1: 2-förhållande volym / volym prov / metanol), såsom beskrivits ovan, centrifugera sedan prover vid 13.000 xg vid 4 ° C under 15 min.
    4. Supernatanten och mäta nitritnivåer. Om det behövs, frysa proverna i något skede av preparatet på torris och förvara vid -80 ° C.

2. Framställning av minska Solutions

  1. Tri-jodid (I 3) reducerande lösningen för nitrit och R- (X) -NO artbestämning 1,3,4
    1. Bered en lösning av 301 mM Kl tillsammans med 138 mM I 2-lösning i vatten. Blanda med isättika i 2: 7-förhållande (volym / volym lösning / syra) på en magnetisk omrörare under ~ 30 minuter till dess att allkristaller är upplösta. Förvara helst i mörk flaska, som jodid är ljuskänslig, och använd inom en vecka från framställning.
      Obs! Denna lösning kommer att minska nitrit till NO och det kommer också att släppa NO från R-SNO, R-NNO och Fe-NO funktionella grupper (R (X) -NO), men nitrat kommer inte att påverkas. Signalen från de ovan NO baserade funktionella grupper kan separeras från sann nitrit signal genom behandling av hälften av provet med surgjord sulfanilamid (AS) och jämföra AS-behandlade och obehandlade signalen. AS irreversibelt bildar diazonium ning med nitrit och detta komplex kan inte minskas med I3 lösning. För AS behandling, förbereda 290 mM lösning av sulfanilamid i en M HCI och lägga till en delmängd av provet i förhållandet 1: 9 (v / v AS / prov). Mät CL signalen i AS-behandlade och obehandlade delar av provet. Beräkna den sanna nitrit signalen såsom en skillnad på AS-behandlade och obehandlade delen av provet. Nitrit kan också mätas med hjälp av en selektiv nitrit-reducerande lösning av askorbinsyra / ättiksyra blandning som beskrivs i del 2.2. Men på grund av den vanligtvis liten mängd av R- (X) -NO arter närvarande, mätningar med användning av AS-obehandlade prover är i de flesta fall en mycket god approximation av den totala nitrithalt.
  2. Askorbinsyra / ättiksyra (4A) lösning för selektiv bestämning av nitrit 2
    1. Förbereda 500 mM askorbinsyra i vatten. Blanda denna lösning med isättika i ett förhållande 1: 7 (volym / volym, askorbinsyra / ättiksyra) för att framställa reaktionsblandningen.
      Obs: Denna lösning är specifik för nitrit, kommer inte att släppa NO från någon R- (X) -NO art eller nitrat. Dock måste lösningen av askorbinsyra och ättiksyra kan beredas varje dag innan mätningarna askorbinsyra oxiderar lätt i lösning.
      Slutförande av nitrit reduktion beror på askorbinsyrakoncentration; och åtminstone 50 mM askorbinsyra rekommenderas för fullständig reduction av plasma nitrit. Det är dock rekommenderas att utföra några pilotförsök med olika koncentrationer av askorbinsyra och nitrit standarder inom förväntade nitrit koncentrationsområdet innan mätningar slutliga provet. Tänk på att askorbinsyra utarmar något under mätningarna är så täta byten av reaktionsblandningen i glasreaktionskammaren rekommenderas.
  3. Vanadin (III) klorid reducerande lösningen för nitratbestämning 9
    1. Förbered 51 mM lösning av VCI3 i en M HCI. Filterlösning genom 200 pm filter och förvara i en mörk flaska ska användas inom två veckor.
      Obs! Denna lösning kommer att minska nitrat, nitrit och alla R- (X) -NO art, så om jämförbara mängder av nitrit eller andra R- (X) -NO arter förekommer tillsammans med nitrat, har den slutliga nitrathalten beräknas som skillnaden mellan de CL signaler erhållna med VCI3 och jag3 minska lösningar.

3. Kemiluminiscens (CL) Analyzer Setup och mätningar

  1. standard~~POS=TRUNC lösning~~POS=HEADCOMP
    1. Framställ 1 uM lösning av natriumnitrit (NaNOa 2). Samma lösning kan användas för nitrit och nitrat som bestämningar.
  2. Använda NO-analysatorn
    Obs! För närvarande finns det två kommersiellt tillgängliga INGA analysatorer som är känsliga nog för biologiska forskningsändamål - Sievers NOA och Ecophysics CLD 88Y. Båda fungerar på samma princip; den största skillnaden är att CLD 88Y använder syre från rumsluften för att göra ozon (O 3), medan NOA kräver en extern syrgastank för detta ändamål. Proceduren nedan beskriver uppsättningen upp för Sievers NOA.
    1. instrument~~POS=TRUNC
      1. Utför inledande uppbyggnaden av NO-analysatorn enligt tillverkarens rekommendationersom kan ses på figur 1.
      2. Öppna O2 tank ansluten till instrumentet. Välj "analys" och "enter" från huvudmenyn på frontpanelen. På nästa skärm väljer du "start" och tryck på "Enter". Anslut syrafälla (innehållande 1 M NaOH) till instrumentet, såsom visas i figur 1.
      3. Vänta tills fotomultiplikatorn kyls till temperatur under -12 ° C och reaktionskammaren evakueras till 6 Torr. Det tar ca 30 minuter att nå en stabil plan baslinje. Baslinjen måste stabiliseras inom 1-2 mV, är mindre viktig än dess stabilitet dess nominella värde.
        Obs: Om nitrat mäts, slå på kylning vattenbad (satt till 4 ° C, som fungerar som kall fälla för syra- och vattenånga) och värme vattenbad (huvudreaktionskammaren, 95 ° C). Graden av minskning av nitrat till NO i VCI3 lösning är temperaturberoende, och det är mycket långsam vid rums tempeperatur, behövs så att väsentlig ökning av temperaturen för att observera reaktionen.
      4. Öppna Han tanken och anslut glasreaktionskammaren syrafälla som kan ses på figur 1. Fylla reaktionskammaren med lämplig reducerande lösning, minska bubblande till minimum och anslut reaktionskammare till syrafälla. Använda trial and error, justera Han bubblande hastigheten för att matcha instrument Sughastighet (vanligtvis ~ 200 ml / min för Siever s NOA).
      5. Slå på datorn styra instrumentet och starta Labview-baserade flytande programvara. För att slå på kommunikationen mellan instrumentet och förvärv programvara, Tryck på "Enter" när "datamenyn" tills skärmen visar "output enabled" och tryck sedan på "klar" för att återgå till uppgifter skärm.
      6. Vänta en stabil baslinje spår på skärmen och börja injicera prover och nitrit standarder i reducerande lösning genom septum. Vänta alltid att nå en stabil baslinje akterer toppen. Detta kan ta upp till 2 min. Liquid programvara har en möjlighet att "markera" tider av injektion och kommentera injektionen och det kommer att exportera dessa kommentarer i en separat fil (filename.info) som ett användbart komplement till datafilen (filename.data).
      7. När prover och standarder mäts, välj "stopp" i Liquid programvarumeny - detta kommer att skriva data från en temporär fil till en permanent fil som kallas "filename.data". Genom att trycka "abort" alternativet avsluta mätningen utan att skriva förvärvade data till en permanent fil.
      8. För att avsluta försöket, koppla maskinen från reaktionskärlet genom att stänga kranen på toppen av reaktionskärlet och koppla bort slangen mellan syra fälla och reaktionskärlet (se figur 1). Nu stoppa NOA analysator - tryck på "klar", gå till "analys", sätta maskinen på "standby" och "bekräfta" standby. Om den används regelbundet, denInstrumentet kan vara kvar i standby-läge under flera veckor. Stänga av tillförseln av syre. Spola sedan den reducerande lösningen från reaktionskammaren, koppla ur och stänga Han tanken från reaktionskärl av glas och Avsluta rengöringen reaktionskärl.
    2. Standarder och provinjektioner
      1. Injicera 50 pl 1 pM nitritlösning till reaktionsblandningen med en väl tvättad Hamilton spruta. Vänta minst 1 - 2 min mellan injektionerna för att ge god separation av toppar. Upprepa injektionen av 50 | il för att få dubbletter till varje datapunkt. Tvätta sprutan med avjoniserat vatten efter varje injektion.
      2. Att förvärva full uppsättning av data för standardkurva fortsätter med dubbla injektioner av 100, 150 pl (ytterligare 200 ^ kan behövas om höga koncentrationer av nitrit eller nitrat förväntas) av en iM nitritlösning. I varje fall, vara noga med att vänta tills signalen faller tillbaka till baslinjen och sedan förvärva 1 - 2 min baslinjen för att uppnå god separation av topparna.
        Obs: Nitrit standarder kan mätas när som helst under experiment. Emellertid är det föredraget att förvärva standardkurvan innan data mätning, eftersom det tjänar också som en oberoende kontroll av instrument funktionalitet.
        När data samlas in, mängden prov injiceras bör leda till väl uttalade toppar. Det bör dock hållas i minnet att fotomultiplikatorn är linjär endast upp till ~ 800 mV, så ingen av toppen bör vara högre än ~ 700 mV. Detta kan uppnås antingen genom att minska av mängden injicerad provet eller spädning av provet med avjoniserat vatten. Varje punkt bör mätas minst två gånger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 2 visar representativa resultat som samlats in från standard och fem olika prover. Som visas i denna figur, fotomultiplikator spänningen ökar omedelbart efter nitritinnehållande lösning (standarder eller prover) injiceras i reducerande lösning (injektioner gånger indikeras med röda pilar under kurvan) och återgår till utgångsvärdet när alla nitrit som förekommer i den injicerade lösningen reducerades. Det är också klart från denna figur att noggranna mätningar volym är nödvändiga för att få mycket reproducerbara data. Vi rekommenderar att du använder precisions Hamilton sprutor för att mäta injektionsvolymer. Förlusten av att minska kapaciteten av I 3 (eller askorbinsyra eller VCI3) lösning är en annan vanlig felkälla. Som en allmän regel, när utgångsbredd toppar börjar öka avsevärt, vilket minskar lösning i reaktionskammaren måste ändras. Bredden på toppen beror på gasflödet in i NOEn reaktionskammare (markerad som RC i fig 1), och den något varierar från en experimentell inrättas till en annan. Vi betraktar den normala bredden att vara omkring 1 min för nitritmätningar och upp till 2 min för nitrat mätningar.

I syfte att relatera signalen från fotomultiplikatorn med mängden NO detekteras, en standardkurva konstrueras som ett diagram av arean under toppen och mängden nitrit (i pmol) injicerades som kan ses på figur 3A. För att mäta arean under toppen någon lämplig mjukvara kan användas, såsom Origin, Excel eller liknande. Lutningen av denna kurva, K (markerat med rött i figur 3B), ger mängden pmol NO orsakar ökning med 1 mV av fotomultiplikatorn signal (PM). Fördelen med att använda den lutningen på kurvan, snarare än området under topp, som är relaterad till den fasta mängden NO, är ökad precision. Standardkurvan är uppbyggd av minst tre olikapunkter, var och en av dem som mäts i duplikat och om det finns några kvarvarande nitrit eller nitrat i vattnet som används för att framställa standardlösningen, med användning av K eliminerar behovet av att korrigeringar av denna restmängder. Dessutom, efter våra inledande tester av NOA instrument för sin PM linjäritet, bestämde vi att linjär respons sker upp till 700-800 mV. Därför är vår standardkurva gäller för alla signaler från prover upp till denna PM intervall. Linjäritet Området beror på PM och kan ändras med tiden. Det måste fastställas innan instrumentet användes först och testas som PM åldrar varje par år.

Data som samlats in från prover behandlas på ett liknande sätt som data som samlats in för standardkurva: För det första området under toppen bestäms. Då detta område är delat med lutnings K av standardkurvan, vilket ger antalet pmol NO härstammar från mängden insprutat prov.

figur 3B. Data plottas sedan på samma sätt som exemplet i figur 3B. I exemplet i figur 3B ritas vi resultat från 5 individuella prov som visas i panel A. Här rita medelvärden från 2 injektioner och ge SD att visa reproducerbarheten av de enskilda punktmätningar.

För prover i Figur 3, S1, S2 och S4 är råttblod och S3 och S5 råttlever. Figur 3C visar slutresultaten rita tillsammans med SD och uttrycks i nM (för blod, n = 3) eller pmol / mg vävnad (för lever, n = 2).

Figur 1
Figur 1: Inställning av Sievers NOA Kemiluminiscens Instrument. Reaktionskärlet är fyllt med I 3 (askorbinsyra / ättiksyra eller VCI3) lösning med He bärargas försiktigt bubblande igenom. Provet injiceras med Hamilton spruta genom septum i I3 lösning där ingen relaterade komponenter reduceras till NO-gas och transporteras till NO-analysatorn. Köldfälla, NaOH fyllda fälla, och filter skyddar analysatorn mot ångor luftfuktighet och syra. I reaktionskammaren (RC) NO-gas kombineras med O 3 (alstrad in O 3 generator) från syre bland O 2 tank. Kemiluminescens signal från NO2 * detekteras av fotomultiplikatorrör (PMT) och ytterligare förstärks och bearbetas. Datainsamling och analys utförs på datorn. Vakuumpumpskapade lågt tryck i reaktionskammaren (RC) och evakuerar giftigt NO2 gasen efter kemiluminiscens mätning genom kolfilter (CF). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Representant Rita av några toppar som genereras av CL. Denna graf visar signal fotomultiplikatorn (PMT) som en funktion av tiden. Toppar följden av injektioner av olika mängder av 1 | iM nitritlösning (standarder) och 100 | il av prov (S1 - S5) injicerades i dubbletter och tre exemplar (50 pl nitrit standardlösning). Röda pilarna under kurvan anger tider av injektioner. Klicka här för att se en larger version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Standardkurva (A) och representativa resultat från råttblod och lever (B), slutresultatet Plot (C). Standardkurva (fält A) erhölls genom injicering av 50, 100 och 150 pl 1 pM nitritlösning i vatten, att mäta arean under topparna. Lutningen K (röd nummer) ger nmol av NO som krävs för en 1mV ökning av fotomultiplikator spänning. Original toppar som används för standardkurva är i figur 2 och är markerade som 50, 100 och 150 l. Figur 2 visar också de ursprungliga injektioner för våra prover - S1, S2 och S4 (mörkgrå) från råttblod, S3 och S5 från råttlevervävnad, alla injicerade i duplikat. Area under dessa toppar mättes och efter alla korrigeringar för utspädningar gjordes som beskrivs i del 3.2.1., ResÜLTS som visas i panel B för individuella prov beräknades som mängden av nitrit i pmol / g lever eller i nM för blod. Att uppskatta reproducerbarhet kemiluminiscens metoden, plottade vi genomsnitten och standardavvikelser för varje enskilt prov. Panel C visar den slutliga produkterna nitrit och nitrat i rått blod och lever plottades som medelvärde av tre individuella prover för blod och två för lever tillsammans med standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiska steg i protokollet

Alikvoter av alla lösningar (inklusive vatten) som används för att förbereda, späda ut eller på annat sätt behandla ursprungliga prover måste sparas och kontrolleras för eventuell nitrit eller (oftare) nitratföroreningar. Vi fann att de flesta föroreningar kommer från vatten och många kemikalier som används för att behandla provet (ferricyanid i synnerhet) innehåller också en betydande mängd nitratföroreningar i vissa partier som stör den endogena nitratbestämningen. Vi kontrollerar därför alla våra kemikalier för nitrit och nitrat föroreningar innan vi använder dem i vanliga experiment.

Eftersom proverna kan utsättas för betydande späd flera gånger under behandlingar, alla prov manipulationer måste dokumenteras för slutliga beräkningarna koncentrations. De flesta misstag görs i denna del av protokollet.

Vid hantering av prover för nitritmätningar, snabb överföring initrit bevara lösning är av avgörande betydelse, speciellt när heme-innehållande proteiner, såsom hemoglobin, som reagerar med nitrit och oxiderar den till nitrat, är närvarande. När stabiliserats, kan proverna frysas för långvarig lagring före analyser.

Mängder av flera NO metaboliter i biologiska prover (särskilt RX-NO) är mycket låga, ibland nivåerna genererade NO är på bakgrundsbrusnivån i NOA analysatorn. Det är alltid att föredra att framställa prover med så lite utspädning som möjligt om sådana föreningar är som skall mätas.

Begränsningar av tekniken

Med noggrann provberedning och injektioner, är den låga gränsen för känslighet nära 20 nM NO-addukt närvarande i fullt beredda provet. De vanliga biologiska halter av nitrit och nitrat gör överskrida dessa koncentrationer, men R- (X) -NO belopp kan falla nära detta område.

CL: s höga sensitivity kräver noggrann provberedning och noggranna mätningar volym.

Betydelsen av CL i förhållande till alternativa metoder för inga metaboliter Mätningar

Kemiluminiscens (CL) är en mycket känslig metod för att upptäcka NO, nitrit, nitrat och RX-NO. För närvarande är CL ansett guldnormen i bestämningen av NO och dess metaboliter.

Andra vanliga alternativ för att bestämma nitrit är Griess reaktion (GR). GR är ett bekvämt och billigt kolorimetrisk metod baserad på diazoteringsreaktion beskrivs av Peter Griess i 1879. Analys av nitrat kräver förhands kemisk eller enzymatisk reduktion av nitrat till nitrit. Bästa kända kommersiellt tillgängliga kit har känslighet cirka 100 nM för nitrit, känslighet för de flesta kit som gör det möjligt att bestämma nitrat och nitrat är lågt iM intervall. Vid användning av GR för att bestämma nitrit och nitrat i provet, är två steg som krävs; första, bestämma nitrit amount i första alikvot av provet, sedan använda andra portion för att minska nitrat till nitrit och mäta total nitrit och nitrat (ibland kallad NOx) innehåll i provet. Sann nitratvärdet är skillnaden mellan de båda mätningarna. Bättre alternativ till detta två steg protokoll är tidigare separation av nitrit och nitrat genom kromatografi. Men detta avsevärt minskar känsligheten och ökar analystiden.

framtida tillämpningar

Med växande bevis om betydelsen av NO väg i biologiskt system, ser vi mer frekvent användning av nitrit eller nitrat eller andra NO metaboliter som biomarkörer för kardiovaskulär hälsa. Ökad bevis tyder också på att dessa molekyler kan vara viktiga i tränings medicin och deras nivåer kan ändras hos personer med diabetes, fetma och metabola syndromet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Alan Schechter är listad som en meduppfinnare på flera patent utfärdade National Institutes of Health för användning av nitrit salter för behandling av hjärt- och kärlsjukdomar. Han erhåller royalties baserade på NIH licensiering av dessa patent för klinisk utveckling, men ingen annan ersättning.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna kritiska bidrag Dr A. Dejam och MM Pelletier i att utveckla användningen av nitrit bevara lösning för nitritmätningar i blodet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385
sulfanilamide; AS  Sigma S9251
HCl Sigma H1758
acetic acid, glacial Sigma A9967
ascorbic acid  Sigma A7506
potassium iodide; KI Sigma 60399
iodine; I2 Sigma 207772 light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2 Sigma 563218
vanadium(III) chloride; VCl3 Sigma 208272 ligt sensitive, toxic
GentleMac Miltenyi
Sievers NOA 280i GE
CLD 88Y  Ecophysics 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
  2. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
  3. Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
  4. Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
  5. Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
  6. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
  7. Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
  8. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
  9. Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104, (5), 538-543 (1997).
  10. Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
  11. Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
Mätning nitrit och nitrat, metaboliter i kväveoxid Pathway, i biologiskt material med hjälp av kemiluminescens metod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).More

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter