Summary
여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.
Abstract
펩타이드 - 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I) 테트라는 CD8 + T 세포 반응을 연구하는 귀중한 도구가되고있다. 이러한 시약 직접 CD8 + T 림프구의 표면 상에 T 세포 수용체에 결합하므로, 형광 표지 pMHC-I의 테트라 항원의 정확한 검출은 (Ag) 시험관을 다시 할 필요없이 특이 적 CD8 + T 세포를 활성화 -자극. 유동 세포 계측법 멀티 컬러와 결합 될 때 또한, pMHC-I 테트라 머 염색은 분화 단계, 메모리 표현형 및 활성화 상태를 포함 AG-특정 CD8 + T 세포의 주요 측면을 공개 할 수 있습니다. CD8 + T 세포는 AIDS까지의 진행에 영향을 미칠 수있는 이런 종류의 분석은 HIV 면역학 분야에서 특히 유용왔다. 유인원 면역 결핍 바이러스와 붉은 털의 원숭이 (SIV)의 실험 감염은 에이즈 바이러스에 대한 세포 성 면역을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다. 그 결과, 상당한 PROGRESS는이 동물 모델에서 T 세포 반응을 정의 및 특징을했다. 여기에서 우리는 pMHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 SIV 특정 CD8 + T 세포를 열거하기위한 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 우리의 분석은 예방 접종 또는 SIV 감염에 의해 발생 SIV 특정 CD8 + T 세포 반응을 추적하는 데 유용 할 수 있습니다 테스트 당이 pMHC-I 사량 + CD8 + T 세포 인구의 동시 정량 및 메모리 표현형을 허용합니다. 생물 의학 연구 비인간 영장류의 관련성을 고려하여, 본 방법은 다수의 질병 설정에서 CD8 + T 세포 반응을 연구에 적용 할 수있다.
Introduction
그들은 종양 면역 감시에 참여하고 세포 내 병원균 1의 퇴치에 기여으로 CD8 + T 세포는 적응 면역 체계의 중요한 구성 요소를 포함한다. 간단히 말해서, CD8 + T 세포는 숙주 세포의 세포막에 존재하는 T 세포의 특이 적 펩티드 - 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I)를 인식 수용체 (TCR도) 분자를 표현한다. 이러한 펩티드는 내생 적으로 합성 된 단백질의 단백질 분해로부터 유도되기 때문에, 세포 표면 pMHC-I 복합체는 세포 내 환경에 창을 제공한다. 바이러스에 감염되면, 예를 들어, 감염된 세포는 CD8 + T 세포를 순찰로 표현 TCR도에 대한 리간드 역할을 할 수 있습니다 바이러스 유래 펩타이드를 포함하는 MHC-I 분자를 표시합니다. 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포가 pMHC-I 리간드를 제시 감염된 세포를 발견 한 경우, TCR 결합은 CD8 + T 세포 활성화 및 발생한다 ULTI후면부로 세포 용해를 대상으로지도한다. CD8 + T 세포 응답의 크기, 특이도, 표현형을 결정,이 TCR / pMHC-I 상호 작용의 중요한 특성을 감안할 때 종종 인간의 질병에 대한 중요한 단서를 공개 할 수 있습니다.
1990 년대 초까지),은 (Ag 관련 CD8 + T 세포의 정량은 기술적으로 까다로운 제한 희석 분석 (LDA) 2,3에 의존했다. LDA 수일 필요 않았다 완료해야 할뿐 아니라 증식 가능성 부족 셀을 검출하지 못했다. 그 결과, LDA는 크게 면역 반응에 참여하는 항원은 (Ag) 특이 적 CD8 + T 세포의 실제 주파수를 낮게. ELISPOT 세포 내 사이토 카인 염색 분석법의 개발이 크게 세포 면역을 측정 할 수있는 능력이 향상되지만, 이러한 방법은 여전히 AG-특정 T 세포 (4)를 정량화 시험 관내 자극 필요. 그것은 1996 알트만 데이비스, 그리고 콜까지되지 않았습니다eagues는 pMHC-I의 테트라 기술 (5)의 개발을보고 자신의 랜드 마크 기사를 발표했다. 이 기술의 성공에 중요하여 유세포 분석법 세척 단계에서 탈락 pMHC-I의 테트라 머의 확률을 감소 TCR / pMHC-I의 상호 작용의 반감기를 연장 pMHC-I 분자의 멀티 머화 하였다. 상기 분석을 통해 pMHC-I의 테트라 머의 주요 장점은 정확하게 관내 재 자극 없이도 직접 생체 AG-특정 CD8 + T 세포를 검출 할 수있는 능력이다. 또한, 멀티 - 컬러 pMHC-I 테트라 머 염색의 조합 계측법 분화 단계, 기억 표현형 및 AG-특정 CD8 + T 세포 2-4의 활성화 상태의 상세한 분석을 허용 한 흐름. 에 의해 CD8 + T 세포 레퍼토리의 특성에 대한 최근의 기술 발전에 비추어 pMHC-I는 응용 프로그램의 폭 FO 6 염색 다량 체R이 방법은 지속적으로 확대 할 전망이다.
생물 의학 연구에서 몇몇 지역은 HIV의 면역학 (7)의 필드보다 pMHC-I 테트라 머 염색에서 더 많은 혜택을. CD8 + T 세포가 일시적으로 알트만 데이비스, 동료 8,9에 의해 게시의 시간에 의해 HIV 바이러스 혈증의 초기 제어와 관련이 있었지만, 계속되는 년 pMHC-I의 사량의 사용은 크게 우리의 이해를 확장 CD8 + T 세포 반응 에이즈 관련. 예를 들어, I-pMHC 테트라 머 염색은 대부분의 HIV 감염자 10-12에서 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 강력한 크기를 확인 도왔다. 이 방법은 "엘리트 제어"로 알려진 항 레트로 바이러스 요법 - 현상의 부재하에 바이러스 복제의 자발적인 제어와 관련된 MHC-I 분자에 의해 제한 HIV- 및 SIV 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 특성을 용이
붉은 털 원숭이 원숭이 (Macaca의 mulatta)의 실험 SIV 감염은 HIV / AIDS (18, 19)에 대해 면역 개입을 평가하는 가장 좋은 동물 모델 남아있다. 지난 25 년 동안 상당한 진보는 MHC-I 대립 유전자의 발견과 펩티드 결합 모티프 13,20-27를 정의를 포함하여,이 원숭이 종의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 식별 및 특성 이루어진 것으로 . 그 결과, pMHC-I의 사량은 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 분석을 위해 개발되어왔다이 동물 모델 (28)에 응답. Mamu-A1 * 002, Mamu-A1 * 001 : 01, Mamu-B의 * 008 :이 시약의 대부분은 네 개의 붉은 털 원숭이 MHC-I 대립 유전자의 유전자 산물 만들어진 01, 및 Mamu-B * 017 : 01. 참고로, 붉은 털 원숭이는 MHC-C의 궤적 (29)을 표현하지 않습니다. 본 실험에 사용 된 pMHC-I의 사량의 대부분은에 모리 대학에서 NIH 테트라 머 핵심 시설에서 생산되었다. 그럼에도 불구하고, 면역 개그 CM9 에피토프에 결합 Mamu-A1 * 001 사량을 포함하여 이러한 시약 중 일부는, 오직 인해 라이선스 계약에 상용 소스에서 얻을 수 있습니다. 네 개의 붉은 털 원숭이의 대립 유전자의 사용 pMHC-I의 테트라 우리는 성공적으로 예방 접종 또는 기본 SIV 감염 30, 31 (마틴 등등에 의해 유도 된 21 SIV 항원 결정기 (표 1)의 총에 CD8 + T 세포를 열거 한 위 알., 게시되지 않은 관찰).
본 원고는 제공붉은 털 원숭이의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 빈도 및 메모리 표현형을 결정하기위한 최적화 pMHC-I 테트라 머 염색 프로토콜. TCR 내재화를 감소시켜 pMHC I-32 염색 테트라을 향상시키기 위해 상기 분석은 단백질 키나아제 억제제 (여기서, 프라이 셀이 사용되는 PKI)와 선택적인 30 분 동안 배양으로 시작한다. 사량 01 : 후술하는 바와 같이 Mamu-B의 *를 017을 사용할 때,이 처리에 특히 유용하다. Fluorochrome과 접합 pMHC-I의 사량과 단일 클론 항체 (단클론 항체)와 세포를 레이블하는 방법에 대한 지침도 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 세포 용해 - 관련 분자 그랜 자임 B (GZM B)의 세포 검출 용 셀 permeabilization 단계를 포함한다. CD3에 대한 단클론 항체는이 TCR 신호 전달 분자의 검출을 향상시킬뿐만 아니라,이 단계에서 첨가된다. 참고로,이 염색 패널에 사용 된 모든 형광 색소가 나열됩니다.
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Protocol
이 논문에 사용되는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플 위스콘신 국립 영장류 연구 센터 수납 인도 붉은 털 원숭이로부터 수득 하였다. 이 동물은 위스콘신 대학원 동물 관리 및 사용위원회 (33)의 대학에 의해 승인 된 프로토콜에서 Weatherall 보고서에 따라 마음에 든다고했다. 모든 동물 절차는 마취하에 수행 된 모든 활동은 전위의 고통을 최소화 하였다.
1. PKI 치료
참고 : 01 사량 :이 선택하지만, Mamu-B의 * 017을 권장합니다. 결과 및 토론 섹션을 참조하십시오.
- 1.6 X 107 세포 / ml의 농도에서 R10 배지에서 재현 탁 PBMC.
- 튜브 세포 계측법에 대응하는 흐름이 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. 각 튜브에 PKI의 100 nm의 용액 50 μl를 추가합니다.
- 각 튜브를 소용돌이. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 이 말까지단계는, 각각의 튜브는 8.0 × 105 PBMC와 50 nM의 PKI를 함유하는 세포 현탁액 100 μl를가한다.
- pMHC-I 사량 염색 단계로 진행합니다.
형광 색소 표지 pMHC-I 테트라 2. 염색
- 준비하기 전에 pMHC-I 마스터 믹스, 원심 분리기 4 ° C에서 적어도 15 분 동안 20,000 XG에서 pMHC-I의 사량 관을 사량. 이 단계의 목적은 백그라운드 염색을 높일 수 pMHC-I 테트라 용액에서 단백질 응집체 펠렛이다. 원심 분리 공정이 완료되면, 단백질 응집이 축적된다 튜브의 바닥으로부터 피펫을 피한다.
- 모든 실험 튜브를 염색하기에 충분한 pMHC-I 사량 마스터 믹스를 준비합니다. 오류 검체 계정이 마스터 믹스의 전체 부피의 15 % 초과를 준비한다.
- pMHC-I는 사량 마스터 믹스 25 μL가 adde이라는 것을 얼룩 버퍼 (예를 들어, 화려한 얼룩 버퍼)에 pMHC-I의 사량을하도록 희석각 테스트에 라.
- 시험 당이 pMHC-I의 테트라 레이블 PBMC; 알로 피코에 접합 한 (APC)와 화려한 바이올렛 (BV) (421)에 다른.
- 100 μL의 최종 부피에 튜브 세포 계측법 해당 흐름에 8.0 × 10 5 PBMC를 추가합니다. 세포를 전술 한 PKI 처리가 실시 된 경우, 이들은 이미 단계 100 μL에 재현 탁한다.
- 25 μl를 추가 pMHC-I는 튜브 세포 계측법 해당 흐름에 마스터 믹스를 사량. 이 단계의 마지막으로 각 튜브의 최종 부피는 125 ㎕를해야한다.
- 세포 현탁액을 균질화하기 위해 각 튜브 소용돌이.
- 45 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어. 이 45 분 배양하는 동안 표면 염색 단클론 항체 칵테일을 준비합니다.
3. 표면 얼룩
- 모든 실험 튜브를 염색하기에 충분한 단클론 항체 마스터 믹스를 준비합니다. 계정이 마스터 믹스의 전체 부피의 15 % 초과를 준비오류를 피펫 팅합니다.
- 50 μl의 시험에 따라 추가 그래서 얼룩 버퍼 마스터 믹스의 볼륨을 조절합니다.
- 적절한 비 CD8 + T 세포의 배제 및 메모리 서브 세트의 묘사를 들어, 사용하는 표면 염색 마스터 믹스의 다음 분자 대항 모노클로 날 항체의 양을 적정한다.
참고 : CD14 BV (510), CD16 BV (510), CD20 BV (510), CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 및 CCR7 FITC 각 모노클로 날 항체에 결합 된 형광 색소는 참고 자료로 제공됩니다. CD14, CD16 및 CD20에 대한 단클론 항체는 그들이 "덤프"게이트에 포함되기 때문에 같은 형광 색소 (즉, BV 510)에 결합되어 있습니다. - 표면 얼룩 마스터 믹스에 죽은 세포를 구별하기위한 고칠 수 염료를 포함 [즉, 아민 반응성 염료 (ARD)]. ARD 시약은 "덤프"게이트에 사용 된 것과 유사한 발광 스펙트럼을 가진 형광 색소에 접합되어 있는지 확인합니다. 이 경우, ARD 아쿠아를 사용합니다.
- 50 μl를 추가염색 마스터 믹스 튜브 세포 계측법 해당 흐름에 3.1-3.4에 설명. 이 단계의 마지막으로 각 튜브의 최종 부피는 175 ㎕를해야한다.
- 각 튜브를 소용돌이. 25 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어.
- 세척 완충액으로 세포 (소 혈청 알부민, 0.1 % 및 0.45 g / L NaN3가 함유 PBS 용액)을 씻는다.
주의 : 아 지드 화 나트륨은 독성 물질이다. 미세한 양에 노출되면 증상이 발생할 수 있습니다. 이 실험이 수행되고있는 기관에서 환경 보건 안전 (EHS) 사무실로 지정된 지침에 따라이 물질을 처리합니다. - 5 분 510 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 별도의 폐기물 용기에 뜨는을 가만히 따르다. 펠렛을 방해하지 않도록해야합니다.
주의 :이 세척 완충액에 아 지드 화 나트륨의 존재에 반응하여 유해 가스 (34)의 형성을 초래할 수있는 표백제를 함유 공기통로 세척 완충액 상등액 캔트되지 않는다. 기음이 실험은 아 지드 화 나트륨을 처리하는 방법에 대한 지침은 수행되고있는 기관에서 EHS 사무소 콘택트에. - 경사 분리 후에, 각 튜브에 유지 된 액체에 남아있는 세포를 소용돌이.
4. 셀 고정
- 세포를 해결하기 위해 모든 튜브에 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 250 μl를 추가합니다.
주의 : PFA는 독성 물질이다. 미세한 양에 노출되면 증상이 발생할 수 있습니다. 이 실험이 수행되고있는 기관에서 EHS 사무소에 의해 지정된 지침에 따라이 물질을 처리합니다.- 2 % PFA 용액을 세포에 등장되어야하기 때문에,이 용액을 제조 PBS를 사용한다. 2 % PFA 용액 백 밀리리터 여러 실험에 충분하다. 철저히 즉시 세포 응집체의 형성을 방지하기 위해서 2 % PFA의 첨가 후 모든 튜브 소용돌이.
- 20 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에 품어.
- W3.7-3.9 단계를 반복하여 재 셀. 이 단계가 완료되면, 세포를 24-48 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. Permeabilization 단계로 진행하기 전에 철저하게 튜브를 소용돌이.
세포의 5 Permeabilization
- permeabilization 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 소용돌이 모든 튜브.
- 10 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어.
- 단계 3.7-3.9를 반복하여 세포를 씻으십시오.
6. 세포 내 염색
- 모든 실험 튜브를 염색하기에 충분한 단클론 항체 마스터 믹스를 준비합니다.
- PBS를 가진 볼륨 또는 세포 내 단클론 항체 마스터 믹스 50 μL가 테스트에 따라 추가되도록 얼룩 버퍼를 조정합니다.
- 6.1 및 6.2에서 설명하는 단클론 항체 마스터 믹스를 준비하면 CD3 및 GZM B. 모노클로 날 항체에 대해 지시 된 양의 적정 사용
참고 : pMHC-I의 사량에 의해 TCR 참여는 테트라 + CD3 + CD8의 검출을 방해 할 수 CD3의 국제화, + 발생할 수 있습니다T 세포가 항 CD3 단클론 표면 염색 마스터 믹스에 추가되는 경우. 세포가 투과성이 후이 문제를 방지하려면이며,이 단계에서 항 CD3 단클론 항체를 추가합니다. CD3를 PerCP Cy5.5 및 GZM B PE : 각 단클론 항체에 결합 된 형광 색소를 기준으로 나열되어 있습니다. - 해당 튜브에 단클론 항체 칵테일의 50 μl를 추가합니다. 30 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어.
- 단계 3.7-3.9를 반복하여 세포를 씻으십시오. 튜브는 유세포에서 획득 할 준비가되어있다.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜은 Mamu-A1 * 001 + 붉은 털 원숭이에서 백신 유도 개그 CM9 특정 CD8 + T 세포 반응의 크기와 메모리 표현형을 결정하는 데 사용되었다. 이 분석 들어, APC 공역 Mamu-A1 * 001 / 개그 CM9 량체는 8 색 유세포 염색 패널에 사용 하였다. 도 1a는 - F는 각 시험에서 본 양 사량 적용되어야하는 데이터를 분석하는 데 사용 게이팅 전략을 보여준다. pMHC-I 테트라 + CD8 + T 세포 인구가 아니라 최소한의 배경 (그림 1 층과 G)로 구분되어 있습니다. (; CD28 + CCR7 + T CM), 전이 메모리 (T EM1; CD28 + CCR7-) 및 효과기 중앙 메모리 : 붉은 털 원숭이 메모리 CD8 + T 세포는 CD28 및 CCR7의 표면 발현에 기초하여 세 개의 서브 세트들로 분류 될 수있다 메모리 (T EM2, CD28-CCR7-) 35.이 프로토콜은 또한 GZM B 및 CD3 세포의 검출을위한 세포 permeabilization 단계를 포함한다. 그림 1G는 - 나는 테트라 + 게이트 내에서 메모리 서브 세트와 GZM B-표현 CD8 + T 세포의 묘사를 보여줍니다.
배경 염색 pMHC-I 사량 라벨링 분석에서 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면 몇 가지주의 사항을 제안한다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이, I-pMHC 테트라 시약을 함유하는 바이알 항상 마스터 믹스의 제조하기 전에 적어도 15 분 동안 20,000 × g으로 원심 분리한다. 이 단계의 목적은 pMHC-I 테트라 용액 중에있을 수있는 단백질 응집체 펠렛이다. 또한, 사용하기 전에 각 시약을 적정하는도 추천합니다. 이상적으로, 수행 또는 관심있는 AG-특정 CD8 + T 세포 인구 관련 pMHC-I의 사량으로 표시해야합니다 포함되지 않은 세포를 MHC-I는 일치. 이 캘리포니아n은 새로 얻은 pMHC-I의 사량의 다양한 양 옆에 SIV의 순진한 (음성 대조군) 및 SIV 감염 (양성 대조군) 원숭이 측에서 냉동 보존 PBMC를 염색하여 수행 될 수있다. 도 2에서, 예를 들어, 1.0 μL / APC에서 공역 Mamu-B * 008의 시험 : 01 / 네프 RL10 테트라은 테트라 양 및 음의 CD8 + T 세포 집단의 최적 간격을 수득 하였다. 마지막으로, 형광의 선택은 상당히 pMHC-I 테트라 머 염색에 얻은 결과에 영향을 미칠 수있다. 이와 관련하여, pMHC-I의 테트라 피해야한다 분자 (예를 들어, 형광)을 어둡게 공액. 우리의 경험에서, 이러한 PE, APC 및 BV 421 밝은 형광 색소, 접합 pMHC-I의 사량은 최상의 결과를 산출했다.
위에서 언급 한 밝은 형광 색소를 결합 할 때 01 사량 일반적으로도, 희미한 얼룩을 얻을 : 우리는 Mamu-B의 * 017는 것으로 나타났습니다. 그 이유낮은 형광 강도는 완전히 명확하지 않지만 낮은 선호도 TCR / Mamu-B * 017 포함될 수 : 01 상호 작용과 사량은 (36, 37)를 결합시 신속한 TCR의 국제화를. 이러한 라인을 따라, PKI에은 CD8 + T 세포 (32)의 표면에 TCR 내재화를 억제하는 것으로 나타났다. 결과적으로, PKI를 pMHC-I는 테트라 머 염색으로 AG-특정 CD8 + T 세포의 검출을 향상시킬 수있다. 우리는 우리의 실험에서이 효과를 확인한 경우 Mamu-B의 품질 * 017 : 착색을 실질적으로 전처리 PKI를 함께 PBMC (그림 3)에 의해 개선 될 수있다 01 사량. 01 제한 CD8 + T 세포 그들의 감도 고유 있습니다 호기심이 PKI와 전처리 크게 017이 Mamu-B의 * 것을 제안, (데이터가 도시하지 않음) 여기에 테스트 다른 pMHC-I의 사량의 오염을 개선하지 않았다 PKI 처리합니다.
그림 1 : 게이팅 전략과 성공 pMHC-I 테트라 머 염색의 대표적인 결과. 우리는 * 001 + 붉은 털 원숭이 Mamu-A1에서 PBMC에서 백신에 의한 개그 CM9 특정 CD8 + T 세포의 크기와 메모리 표현형을 평가 하였다. 여기서, APC 공역 Mamu-A1 * 001 / 개그 CM9 량체는 8 색 유세포 염색 패널에 사용 하였다. (A - F) 유세포 분석을위한 게이팅 전략. 첫째, 대각선 클러스터 단봉에 게이트가 SSC 지역에 비해 다음 FSC 영역 (FSC-A) 및 측면 산란 높이 (SSC-H) 대 앞으로 분산 높이 (FSC-H)를 플롯에 의해 만들어진 (SSC-A, A와 B) . 다음으로, 한 번 게이트는 5 일 90 번째 백분위 수에서 기록 된 이벤트 만 포함 만들었습니다. 그 결과 세포를 "덤프 채널"음, CD3가 + 세포 (C와 D)에 문이 있었다. 이 단계에서,림프구 인구는 자사의 FSC-A와 SSC-A의 속성을 기반으로 묘사하고, 이후의 분석은 CD8 + 세포 (E와 F) 내에서 실시 하였다. pMHC-I 테트라 머 + 세포 (G)를 개설 한 후에, 상기 메모리 표현형 분석은이 게이트 (H) 내에서 수행 하였다. (; CD28 + CCR7 + T CM), 전환 메모리 (T EM1, CD28 + CCR7-), 및 이펙터 메모리 (T EM2 중앙 메모리 : 붉은 털 원숭이 메모리 T 세포는 CD28과 CCR7의 발현에 따라 세 부분 집합으로 분류 될 수있다 , CD28-CCR7-). 본 프로토콜은 그랜 자임 B (GZM B) 테트라 + CD8 + T 세포 (I) 내에서 표현의 세포 내 평가를위한 세포 permeabilization 단계를 포함한다. 히스토그램의 음영 처리 된 영역은 이소 일치 제어 단클론 항체로 염색 사량 + CD8 + T 세포에 해당합니다. 이 염색에 존재했던 BV (421) - 복합 테트라 + 인구는하지만도면에 도시되지 않은, 동일한 게이트 전략을 분석하기 위해 사용되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 01 / 네프 RL10의 사량 : APC에서 접합 Mamu-B * 008의 적정의 대표 결과. PBMC는 두 개의 Mamu-B의 * 008에서 : 01+ 붉은 털 원숭이는이 실험을 위해 사용되었다 : 하나의 동물이 SIV는 순진이었고, 다른 하나는 SIV에 감염된이고 긍정적 인 제어 역할을하는 반면 부정적인 제어 역임했다. Mamu-B의 양을 결정하기 위해 * 008 : 테트라 머 + 및 tetramer- CD8 + T 세포의 최적 거리를 산출 01 / 네프 RL10 테트라은 각 동물로부터 PBMC는 pMHC-I 테트라 시약 표시된 양으로 배양 하였다. 이러한 결과에 기초하여, 1.0 μL / 테스트 WA최적 량으로서 선택의 미래 분석에 사용한다. 데이터를 분석하는 데에 이용 게이팅 전략은도 1에 설명된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 01 사량 : Mamu-B * 017의 형광 강도에 PKI 치료의 효과. PKI를 억제제 TCR 단지의 국제화를 억제함으로써, 형광 표지 pMHC-I (32) 테트라에 의해 AG-특정 CD8 + T 세포의 검출을 향상시킨다. (A - B) 두 개의 Mamu-B에서 PBMC * 017 : 01+ 붉은 털 원숭이는이 실험에 사용했다 : 다른이 SIV에 감염을 역임하는 동안 한 원숭이, SIV 순진한이었고, 음성 대조군 (A)을 역임양성 대조군 (B). 프로토콜 절에 설명 된 바와 같이, 01 / 네프 IW9 량체 : 모두 동물로부터 PBMC는 APC 공역 Mamu-B * 017으로 염색하기 전에 30 분 동안 50 nM의 농도의 PKI의 존재하에 37 ℃에서 배양시켰다 . 참고로, 튜브의 또 다른 세트는 그 디메틸 술폭 시드 제외한 동일한 배양 조건 및 염색 하였다 (DMSO)는 대신에 PKI 첨가 하였다. 데이터를 분석하는 데에 이용 게이팅 전략은도 1에 설명된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| SIV 단백질 | 아미노산 위치 | 아미노산 서열 | MHC 클래스 I 분자 (새 명칭) | MHC 클래스 I 분자 (이전 명명법이자형) | 에피토프 짧은 이름 |
| 개그 | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | 개그 CM9 |
| 개그 | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | 개그 QI9 |
| 개그 | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | 개그 GY9 |
| 봉투 | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017 : 01 | Mamu-B * 17 | 봉투 FW9 |
| 봉투 | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | 봉투 CL9 |
| 봉투 | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | 봉투 TL9 |
| 봉투 | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002 : 01 | Mamu-A * 02 | 봉투 RY8 |
| 봉투 | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002 : 01 | Mamu-A * 02 | 봉투 RY9 |
| VIF | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008 : 01 | Mamu-B * 08 | VIF RL9 |
| VIF | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008 : 01 | Mamu-B * 08 | VIF RL8 |
| VIF | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017 : 01 | Mamu-B * 17 | VIF HW8 |
| VIF | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | VIF VL10 |
| VIF | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002 : 01 | Mamu-A * 02 | VIF WY8 |
| 회전 | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008 : 01 | Mamu-B * 08 | 레브 KL9 |
| 싸구려 | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | 문신 SL8 |
| 네프 | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008 : 01 | Mamu-B * 08 | 네프 RL10 |
| 네프 | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008 : 01 | Mamu-B * 08 | 네프 RL9b |
| 네프 | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008 : 01 | Mamu-B * 08 | 네프 RL9a |
| 네프 | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017 : 01 | Mamu-B * 17 | 네프 IW9 |
| 네프 | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017 : 01 | Mamu-B * 17 | 네프 MW9 |
| 네프 | 159-167 | YTSGPGIRY | <TD> Mamu-A1 * 002 : 01Mamu-A * 02 | 네프의 YY9 |
표 1 : 붉은 털 원숭이의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포 반응을 모니터링 할 수 pMHC-I의 테트라 목록.
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Discussion
이 절차 매력 토론에서 몇 단계는 최적의 결과를 산출하기위한 중요하다있다. 생물학적 시료의 품질이 어떤 유세포 분석 (38)의 성공 강한 예측이기 때문에 먼저 모든 치료는 세포의 염색 과정 중에 생존 및 정지되도록주의해야한다. 그들은 응집하는 경향이며, 일반적으로 죽은 세포의 높은 숫자를 포함하기 때문에 냉동 보관 샘플로 작업 할 때 특히 관련이있다. 이러한 경우, 이전 pMHC-I 테트라 라벨링 과정에 70 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 통과하여 실질적으로 결과를 개선 할 수있다. 둘째, 상기 분석에 사용되는 형광 색소의 적절한 보상 여러 매개 변수가 동일한 실험으로 평가되고, 특히, 정확한 데이터 분석을 위해 중요하다. 이러한 점에서, 새로운 단일 색 보정 제어마다 pMHC-I의 테트라 머 (S)를 준비 할 것을 권장분석을 이닝. 우리는 그들의 광범위한 항 IG 반응성들은 양 및 음의 인구 분명 쌍봉 분포를 얻을 수 있다는 사실을 보상 비드의 사용을 선호. 이들 비즈는 MHC-I 분자에 결합하지 않기 때문에 항체를 보상 대조군으로 사용되어야 pMHC-I의 테트라 머 (예를 들어, APC (421) 및 BV)와 같은 형광 접합. 이러한 보상 비드의 일부는 다양한 벤더 가능하고 제조자의 지시에 따라 사용한다. 셋째, 여기에 설명 된 표현형 전략 세 분자 (즉, CD28, CCR7 및 GZM B) 형광 물질을 뺀 것과 게이팅 컨트롤 (FMO) 시험의 채점 식에 기초하여 CD8 + T 세포의 서브 세트의 묘사를 필요로하기 때문에 또는 이소 타입 매치 항체는 이런 종류의 분석을 용이하게하기 위해 사용되어야한다. 실험에있어서, 관심 (A)의 I-pMHC 테트라 머 + CD8 + T 세포 집단을 포함하는 예를 들어, 별도의 튜브상기 가이드 라인의 전반적인 품질 향상시킬 수도 있지만 재 항상 중요한 CD28, CCR7 및 GZM B.에 대한 단클론 항체와 같은 형광 색소에 접합 된 이소 제어 모노클로 날 항체로 염색 pMHC을-I는 염색과를 사량, 그들은 유일한 변수는되지 않습니다 이 분석의 성능에 영향을 미칠 수있다. 모든 실험실 환경의 특수성을 고려, 여기에 설명 된 전체 워크 플로는 연습과 관련 조정할 수 있도록 모의 샘플에 한 번 이상 수행해야합니다.
호기심, pMHC는-I는 긍정적 인 CD8 + T 세포가 가끔 SIV 순진한 (감염되지 않은 및 예방 접종을받지 않은) 붉은 털 원숭이에서 PBMC에서 관찰된다 사량. 이 경우는 데이터의 육안 검사에 기초하여 배경 염색 결과로 나타나지 않는다. 오히려, 그들은 pMHC-I 분자 및 킬러 면역 글로불린과 같은 수용체 (KIRs) 사이의 상호 작용을 반영 할 수 붉은 털 원숭이 NK 및 CD8 + T 세포 (3)의 표면에 발현9,40. 실제로, Mamu-A1 * 002 : 개그 GY9 및 봉투 RY8 에피토프에 해당하는 펩티드 접혀 01 사량은 Mamu-KIRDL05 (39)에 결합하는 것으로 나타났다. 이러한 맥락에서, Mamu-A1 * 002 : 01 / 개그 GY9 및 Mamu-A1 * 002 : 01 / 봉투 RY8 위에서 설명한 AG-독립 pMHC-I 테트라 머 염색을 전시하는 경향이다. 이 현상을 감안할 때, 그것은 감염이나 예방 접종 다음 SIV 특정 CD8 + T 세포 반응의 길이 방향의 평가를 포함하는 원숭이 실험에서이 기준 반응성를 통제하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 치료의 첫째 날 얻어진 샘플에 pMHC-I 테트라 머 염색을 수행하는 것이 바람직하다. 또한 기준 샘플을 미래 실험에 필요한 경우와 비교 이러한 초기 시점에서 여러 소형 분량 씩 PBMC 동결 관련된 될 수있다.
pMHC-I의 테트라 머 염색 한 제한은 것으로 알려져 특이성 및 MHC-I 제한 C의 CD8 + T 세포는이 방법에 의해 연구 될 수있다. 이것은 자신의 MHC 유전자 좌의 복잡한 조직 주어진 붉은 털 원숭이에 특히 적합하다. 실제로, 하나의 붉은 털 원숭이의 일배 체형은 MHC-I 유전자 수십 가질 수없는 모두 안정적으로 세포 표면에 발현되어 29 분자를 인코딩한다. 그 결과, 특정 동물에 의해 표현 기능 MHC-I 분자의 세트를 결정하기 어려울 수있다. 01, Mamu-B * 008 : 01, 및 Mamu- 그럼에도 불구하고,이 경고는 002 등 Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 *로 알려진 MHC-I 대립 유전자에 대한 긍정적 인 원숭이를 포함 실험을 설계함으로써 극복 할 수있다 B * 017 : 01.
결론적으로,이 원고는 붉은 털 원숭이의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 빈도 및 메모리 표현형을 결정하는 최적 pMHC-I 테트라 머 염색 프로토콜을 제공한다. pMHC-I 테트라 머 염색 AG-특정 CD8 감응 IFN-γ와 ICS ELISPOT 분석법보다 더 민감하기 때문에+ T 세포와 시험 관내의 Ag 자극을 필요로하지 않으며, 여기에서 제시된 방법은 면역 결핍 바이러스 감염의 결과에서 CD8 + T 세포 반응의 효과를 연구하는데 유용하다. 이 기술을 마스터로부터 취득한 실제 지식은 기능 연구의 일부로서 특정 AG-CD8 + T 세포 농축 및 다양한 질병 설정 6에서 CD8 + T 세포 반응을 모니터링하는 데 유용하다.
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Acknowledgments
우리는 본 방법의 최적화를 활성화 실험을 지원하기 위해 데이비드 왓킨스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30AI073961에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 AIDS 연구를위한 마이애미 센터에서 제공하는 파일럿 부여에 의해 부분적으로 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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