Summary
Здесь мы представляем оптимизированный протокол для нумерации и характеризующих макаки - резус CD8 + Т - клеток против вируса СПИДа. Эта статья полезна не только к области иммунологии ВИЧ, но и в других областях биомедицинских исследований , где ответы CD8 + Т - клеток , как известно, влияют на исход заболевания.
Abstract
Пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) тетрамеры был бесценным инструментом для изучения ответов CD8 + Т-клеток. Поскольку эти реагенты непосредственно связываются с рецепторами Т-клеток на поверхности CD8 + Т-лимфоцитов, Флуорохром-меченых тетрамеров ПКИКЖ-I позволяют точное обнаружение антигена (Ag) -специфический CD8 + Т-клетки без необходимости повторной ин витро -стимуляция. Кроме того, в сочетании с многоцветной проточной цитометрии, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивание может выявить ключевые аспекты Ag-специфических CD8 + Т-клеток, в том числе стадии дифференцировки, фенотипом памяти, а также состояние активации. Эти виды анализов были особенно полезны в области иммунологии ВИЧ , где CD8 + Т-клетки могут влиять на развитие СПИДа. Экспериментальное заражение макак-резусов с вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО) является бесценным инструментом для изучения клеточного иммунитета против вируса СПИДа. В результате значительная PROGRESS было сделано в определении и характеризующее Т-клеточного ответа в данной животной модели. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для перечисления SIV-специфических CD8 + T-клеток в макак-резусов с помощью окрашивания тетрамера ПКИКЖ-I. Наш анализ позволяет одновременно количественной оценки и памяти Фенотипирование двух популяций ПКИКЖ-I тетрамер + CD8 + T-клеток на тест, что может быть полезно для отслеживания SIV-специфических Т-клеточного ответа CD8 + , сгенерированные с помощью вакцинации или SIV инфекции. Учитывая актуальность приматах в биомедицинских исследованиях, эта методика применима для изучения ответов CD8 + Т-клеток в различных условиях болезни.
Introduction
CD8 + Т-клетки содержат важнейший компонент адаптивной иммунной системы , поскольку они участвуют в опухоли иммунного надзора и способствовать искоренению внутриклеточных патогенов 1. Проще говоря, CD8 + Т-клетки экспрессируют рецепторы Т-клеток (TCR) , которые специфически распознают пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) молекулы , присутствующие на плазматической мембране клеток - хозяев. Так как эти пептиды являются производными от протеолиза эндогенно синтезированных белков, клеточной поверхности ПКИКЖ-I комплексы обеспечивают окно в внутриклеточной среде. При вирусной инфекции, например, инфицированные клетки будут отображать молекулы MHC-I , содержащих вирусные производные пептидов , которые могут служить в качестве лигандов для ТКР , выраженные патрулируя CD8 + Т-клеток. В случае вирус-специфических CD8 + Т-клетка встречается инфицированной клетки представляет свои ПКИКЖ-I - лиганд, ТКР взаимодействие будет приводить к активации + Т-клеток CD8 и ULTIзительно приводят к целевой лизис клеток. Учитывая критический характер этих взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, определение величины, специфичность и фенотип реагирования CD8 + Т-клетки часто могут выявить важные подсказки о заболеваниях человека.
До начала 1990 - х годов, количественное определение Ag-специфических CD8 + Т-клеток не полагались на технически сложных предельного анализа разбавления (LDA) 2,3. Мало того, что LDA требуется несколько дней, чтобы завершить, он также не удалось обнаружить клетки, которые испытывали недостаток пролиферативный потенциал. В результате, ЛДА значительно недооценивают реальную частоту антигена (Ag) -специфические CD8 + Т-клеток , участвующих в иммунной реакции. Хотя развитие ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокина анализов значительно улучшило способность измерить клеточный иммунитет, эти методы все еще требуется в пробирке стимуляции для количественной оценки антиген-специфические Т-клетки 4. Он не был до 1996 года, что Альтман, Дэвис, и сбeagues опубликовал свою основополагающую статью , сообщающее развитие технологии ПКИКЖ-I тетраметра 5. Критическое значение для успеха этого метода была мультимеризация молекул ПКИКЖ-I, что привело к увеличению полураспада взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, тем самым снижая вероятность тетрамеров ПКИКЖ-I падает во время стадии промывки в проточной цитометрии анализов. Главное преимущество тетра- ПКИКЖ- класса над вышеупомянутыми анализов является способность точно обнаружить антиген-специфические CD8 + Т-клетки непосредственно ех естественных условиях без необходимости экстракорпорального повторной стимуляции. Кроме того, сочетание тетрамер окрашивания ПКИКЖ-I с многоцветной проточной цитометрии позволило подробный анализ стадии дифференцировки, фенотип памяти и статус активации Ag-специфических CD8 + Т-клеток 2-4. В свете последних технических достижений для характеристики CD8 + Т-клеток с помощью репертуаров рМНС-I мультимеру окрашивания 6, широту применения Foг эта методология, вероятно, продолжит расширяться.
Мало областей в биомедицинских исследованиях получили пользу больше от тетрамера окрашивания ПКИКЖ-I , чем области ВИЧ иммунологии 7. Хотя CD8 + Т-клетки были временно связаны с начальным контролем виремии ВИЧ к моменту публикации Альтман, Дэвис и его коллеги 8,9, использование тетрамеров ПКИКЖ-I в последующие годы значительно расширили наше понимание ВИЧ-специфических CD8 + Т-клеточный ответ. Например, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания помог подтвердить надежный размер вирус-специфических ответов CD8 + Т-клеток у большинства ВИЧ-инфицированных лиц 10-12. Эта методика также способствовала характеристика ВИЧ и SIV-специфических Т-клеточных реакций CD8 + ограниченное молекулами MHC-I , связанных с самопроизвольным контролем репликации вируса в отсутствие антиретровирусной терапии-явление , известное как "элитный контроль"
Экспериментальная SIV инфекции макак - резусов (Macaca мулатка) остается лучшей животной моделью для оценки иммунного вмешательства против ВИЧ / СПИДа 18,19. За последние 25 лет достигнут значительный прогресс был достигнут в области идентификации и определения характеристик SIV-специфических CD8 + Т-клеток в этой обезьяны видов, в том числе открытие аллели MHC-I и определения пептидсвязывающий мотивов 13,20-27 , В результате, тетрамеры ПКИКЖ-I были разработаны для анализа SIV-специфических CD8 + Т-клетокответы в этой животной модели 28. Большинство из этих реагентов изготовлены из генных продуктов из четырех макак резус аллелями MHC-I: Маму-А1 * 001, Маму-А1 * 002: 01, Маму-B * 008: 01, и Маму-B * 017: 01. Следует отметить, что макак не выражают локус MHC-C 29. Подавляющее большинство из тетрамеров ПКИКЖ-I, используемые в настоящих экспериментах были произведены на NIH тетрамеров основной комплекс в Университете Эмори. Тем не менее, некоторые из этих реагентов, в том числе Маму-A1 * 001 тетрамеров связанных с иммунодоминантном Gag CM9 эпитоп, могут быть получены только из коммерческих источников, из-за лицензионных соглашений. Использование тетрамеры ПКИКЖ-I из четырех макак резус аллелями , перечисленных выше, мы успешно перечислены CD8 + Т-клеток против в общей сложности 21 SIV эпитопов (таблица 1), которые были вызваны вакцинацией или первичной инфекции SIV 30,31 (Мартинс и др и др., неопубликованные данные).
Настоящая рукопись обеспечиваетоптимизированный протокол тетрамер окрашивания ПКИКЖ-я для определения частоты и памяти фенотип ВИО-специфических CD8 + Т-клеток в макак - резусов. Анализ начинается с факультативный 30 мин инкубации с ингибитором протеинкиназы (ИПК, здесь используется Дазатиниб) с целью уменьшения интернализации ТКР и тем самым улучшить ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания 32. Как описано ниже, эта процедура особенно полезна при использовании Маму-B * 017: 01 тетрамеров. Также предоставляются инструкции о том, как маркировать клетки с флуорохромом конъюгированный тетрамеров ПКИКЖ-I и моноклональных антител (мАт). Этот протокол также включает в себя этап проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного обнаружения цитолиза-ассоциированной молекулы гранзимом (GZM B). Моноклональное антитело против CD3 добавляется на этом этапе, а также улучшить обнаружение этой сигнальной молекулы TCR. В качестве ссылки, все флуорохромы, используемые в этом окрашивающим панели перечислены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцы, используемые в этой рукописи были получены из индийских макак хранящаяся в Национальном исследовательском центре приматов Висконсин. Эти животные были воспитывающихся в соответствии с отчетом Weatherall согласно протоколу , утвержденному в Университете штата Висконсин Высшая школа уходу и использованию животных комитета 33. Все процедуры на животных были проведены под наркозом, и все усилия были сделаны, чтобы минимизировать потенциальные страдания.
1. Лечение ИПК
Примечание: Это не является обязательным, но рекомендуется для Маму-B * 017: 01 тетрамеров. См результаты и разделы обсуждения.
- Ресуспендируют РВМС в среде R10 в концентрации 1,6 × 10 7 клеток / мл.
- Добавляют 50 мкл этой клеточной суспензии к соответствующему поточной цитометрии трубок. Добавляют 50 мкл 100 нМ раствор ИПК в каждую пробирку.
- Vortex каждую пробирку. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. К концу этогошаг, каждая труба должна иметь по 100 мкл клеточной суспензии , содержащей 8,0 × 10 5 РВМС и 50 нМ инфраструктуры открытого ключа.
- Перейдите к шагу тетрамер окрашивания ПКИКЖ-I.
2. Окрашивание с Флуорохром меченных ПКИКЖ-I тетрамеров
- Перед приготовлением ПКИКЖ-I тетрамере мастер смеси, центрифугу тетрамере трубы ПКИКЖ-I при 20000 мкг в течение не менее 15 мин при 4 ° С. Цель этого шага заключается в гранулах белковых агрегатов в растворе ПКИКЖ-I тетрамера, что может увеличить фоновое окрашивание. После того, как центрифугирование делается, избегать пипетирования из нижней части трубки, где белковые агрегаты будут накопиться.
- Подготовьте достаточное количество ПКИКЖ-I мастер тетрамер смесь для окрашивания всех экспериментальных труб. Готовят избыток 15% от общего объема этого мастер-смеси для учета пипетирования ошибки.
- Развести тетрамеров ПКИКЖ-I в буфере пятен (например, Brilliant Stain буфера) , так что 25 мкл ПКИКЖ-I тетрамере мастер - микс являются Added для каждого испытания.
- Этикетка РВМС с двумя тетрамеров ПКИКЖ-I на испытание; один конъюгированный с аллофикоцианином (АРС), а другой к Brilliant Violet (BV) 421.
- Добавить 8,0 х 10 5 РВМС к соответствующему поточной цитометрии трубок в конечном объеме 100 мкл. Если клетки были подвергнуты обработке ИПК, описанной выше, они уже должны быть ресуспендировали в 100 мкл на этом шаге.
- Добавьте 25 мкл ПКИКЖ-я тетрамер основной смеси к соответствующему поточной цитометрии трубок. К концу этого шага, чтобы конечный объем в каждой пробирке должна быть 125 мкл.
- Vortex каждую пробирку с целью гомогенизировать суспензии клеток.
- Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 45 мин. Подготовьте поверхность окрашивания MAB коктейль в течение этого 45-минутной инкубации.
3. Поверхность Окрашивание
- Подготовьте достаточное количество MAB мастер смеси для окрашивания всех экспериментальных труб. Готовят избыток 15% от общего объема этого мастер-смеси, чтобы учестьдля пипетирования ошибки.
- Регулировка громкости мастер-смеси с буфером пятен, так что 50 мкл добавляют на тест.
- Для правильного исключения не-CD8 + Т-клеток и разграничением подмножеств памяти, использование титруют количества моноклональных антител , направленных против следующих молекул в основной смеси поверхностного окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: флуорохромы, конъюгированные к каждому мАт предоставляются в качестве справки: CD14 BV 510, BV 510 CD16, CD20 BV 510, BV CD8α 785, CD28 PE Cy7 и CCR7 FITC. Обратите внимание , что моноклональные антитела против CD14, CD16, CD20 конъюгированы с той же флуорохромом (то есть, BV 510) , так как они будут включены в "сваливается" ворота. - Включите поправимо краситель для различения мертвые клетки в основной смеси поверхностного окрашивания [т.е., амин активный краситель (АРД)]. Убедитесь, что реагент ARD конъюгирован с флуорохромом с аналогичным спектром излучения, как те, которые используются в "сваливается" ворот. В этом случае рекомендуется использовать ARD Aqua.
- Добавляют 50 мклмастер окрашивания смесь, описанная в 3,1-3,4 с соответствующим методом проточной цитометрии трубок. К концу этого шага, чтобы конечный объем в каждой пробирке должно быть 175 мкл.
- Vortex каждую пробирку. Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 25 мин.
- Промыть клетки с промывочным буфером (PBS раствора , содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,45 г / л NaN 3).
ВНИМАНИЕ: Азид натрия является токсичным веществом. Воздействие даже незначительных количеств может вызвать симптомы. Handle это вещество в соответствии с руководящими принципами, указанными в гигиене окружающей среды и Управлением по вопросам безопасности (EHS) в учреждении, где ведутся эти эксперименты. - Центрифуга трубки при 510 мкг в течение 5 мин. Супернатант осторожно декантируют в отдельный контейнер для отходов. Будьте уверены, чтобы не мешать гранул.
ВНИМАНИЕ: Не переливать промывочный буфер , надосадочную жидкость в резервуарах , содержащих отбеливатель , как он может вступать в реакцию с азид натрия , присутствующего в буфере для промывки и приводит к образованию токсичного газа 34. Сонтакт в EHS бюро в учреждении, где эти эксперименты выполняются для руководящих принципов о том, как избавиться от азида натрия. - После декантации вихревые клетки в остаточному жидкости, удерживаемого в каждой пробирке.
4. Cell Фиксирование
- Добавьте 250 мкл раствора 2% параформальдегида (PFA) во все пробирки, чтобы зафиксировать клетки.
ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным веществом. Воздействие даже незначительных количеств может вызвать симптомы. Handle это вещество в соответствии с руководящими принципами, указанными в EHS бюро в учреждении, где ведутся эти эксперименты.- Так как 2% -ный раствор ПФА должен быть изотоническим к клеткам, используют PBS для приготовления этого раствора. Сто миллилитров 2% раствора PFA достаточно для нескольких экспериментов. Тщательно мешалке все пробирки сразу после добавления 2% PFA, с тем, чтобы предотвратить образование агрегатов клеток.
- Инкубируют в темноте при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
- Wзольные клетки путем повторения шагов 3,7-3,9. После того, как этот этап завершен, клетки можно хранить в темноте при температуре 4 ° С в течение 24-48 ч. Перед тем как перейти к фазе пермеабилизирующего вихревые трубки тщательно.
5. пермеабилизирующего КЛЕТОК
- Добавить 500 мкл буфера пермеабилизации. Vortex все пробирки.
- Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Вымойте клеток путем повторения шагов 3,7-3,9.
6. Внутриклеточные Окрашивание
- Подготовьте достаточное количество MAB мастер смеси для окрашивания всех экспериментальных труб.
- Отрегулируйте громкость с помощью PBS или окрасить буфер таким образом, чтобы 50 мкл внутриклеточной монАТ основной смеси добавляются на тест.
- Подготовка мастер-микс Mab, описанный в 6.1 и 6.2 с использованием титруют количества моноклональных антител, направленных против CD3 и GZM B.
Примечание: ТКР с помощью тетрамеров ПКИКЖ-I может привести к CD3 интернализации, которые могут помешать обнаружению тетрамера + CD3 + CD8 +Т-клетки, если анти-CD3 моноклональное антитело добавляют к основной смеси поверхностного окрашивания. Чтобы избежать этого, добавьте анти-CD3 мАт на данном этапе, то есть после того, как клетки проницаемыми. Флуорохромов, конъюгированные к каждому мАт перечислены в качестве эталона: CD3 PerCP Cy5.5 и GZM B PE. - Добавляют 50 мкл мАт коктейлем в соответствующие пробирки. Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Вымойте клеток путем повторения шагов 3,7-3,9. Трубки готовы быть приобретены в проточном цитометре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол , описанный здесь , был использован для определения величины и памяти фенотип поствакцинальный, Gag CM9-специфических ответов CD8 + Т-клеток в Маму-A1 * 001 + макаки - резус. Для этого анализа, БТР-конъюгирован Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 тетрамер был использован в 8-цветной проточной цитометрии окрашивания панели. Фигура 1А - F показана стратегия стробирования используется для анализа данных, которые должны быть применены для обоих тетрамеров , присутствующих в каждом тесте. Обратите внимание , что тетрамер ПКИКЖ-I + CD8 + Т-клеточной популяции хорошо отделяется с минимальным фоном (рис 1F и G). Память CD8 + Т-клеток в макак - резусов могут быть классифицированы как три подмножества на основе поверхностной экспрессии CD28 и CCR7: центральное запоминающее устройство (Т СМ; CD28 + CCR7 +), переходную памяти (Т EM1, CD28 - + CCR7-) и эффекторных память (T ЕМ2; CD28-CCR7-) 35.Этот протокол также включает в себя этап проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного обнаружения GZM B и CD3. Рисунок 1G - я показывает обрисовку подмножеств памяти и GZM В-экспрессирующих CD8 + Т-клеток в пределах тетрамера + ворот.
Фоновое окрашивание может дать неоптимальные результаты в ПКИКЖ-I тетрамер маркировки анализов. Чтобы избежать этого, некоторые меры предосторожности предложены. Как указано в разделе протокола, флаконы, содержащие тетрамера реагенты ПКИКЖ-я всегда должен быть центрифугируют при 20000 мкг в течение не менее 15 мин до начала подготовки мастер-смесей. Цель этого шага заключается в гранулах любые белковые агрегаты, которые могут быть в растворе тетраметра ПКИКЖ-I. Кроме того, титрование каждый реагент перед использованием также рекомендуется. В идеале, MHC-I-клетки , которые соответствуют или не содержат Ag-специфических CD8 + Т-клеточной популяции интерес должны быть помечены соответствующим ПКИКЖ-I тетрамера. Это саN быть достигнуто путем окрашивания криосохранить РВМС SIV наивен (отрицательный контроль) и ВИО-инфицированной (положительный контроль), макак, бок о бок с различными количествами только что полученного ПКИКЖ-I тетрамера. На рисунке 2, например, 1,0 мкл / тест БТР-конъюгированного Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 тетрамера дали лучшее разделение между тетрамера положительными и отрицательными популяциями Т-клеток CD8 +. И, наконец, выбор флуорохрома может также существенно повлиять на результаты, полученные от тетрамера окрашиванием ПКИКЖ-I. В связи с этим, тетрамеры ПКИКЖ-I , конъюгированного с тусклым молекулами (например, флуоресцеин) следует избегать. По нашему опыту, тетрамеры ПКИКЖ-I, конъюгированные с яркими флюорохромами, таких как PE, APC, и BV 421, дали лучшие результаты.
Мы заметили, что Маму-B * 017: 01 тетрамеры обычно дает тусклый окрашивание, даже при конъюгации с яркими флюорохромами, упомянутых выше. Причины этогонизкая интенсивность флуоресценции не совсем ясны , но могут включать низкоаффинные TCR / Маму-B * 017: 01 взаимодействия и быстрое интернализации ТКР при тетрамер связывания 36,37. Вдоль этих линий, ИПК было показано, ингибируют интернализации ТКР на поверхности CD8 + Т-клеток 32. В результате, ИПК может улучшить обнаружение АГ-специфических CD8 + Т-клеток с помощью окрашивания тетрамера ПКИКЖ-I. Мы подтвердили этот эффект в наших экспериментах, где качество Mamu-B * 017: 01 тетрамер окрашивание может быть существенно улучшена за счет предварительной обработки РВМС с ПКИ (рисунок 3). Любопытно, что предварительная обработка с этим ПКИ не значительно улучшить окрашивание других тетрамеров ПКИКЖ-я тестировал здесь (данные не показаны), предполагая , что Маму-B * 017: 01-ограниченные CD8 + Т-клетки могут быть уникальными по своей чувствительности к лечению ИПК.
Рисунок 1: стробирования стратегия и репрезентативные результаты успешного окрашивания тетрамера ПКИКЖ-I. Мы оценили величину и памяти фенотип вакцины индуцированных Gag CM9-специфических CD8 + Т-клеток в РВМС от Mamu-A1 * 001 + макаки - резус. Здесь, БТР-конъюгированные Маму-А1 * 001 / Затычка CM9 тетрамер использовался в 8-цветной проточной цитометрии окрашивания панели. (A - F) Стратегия Gating для анализа потока цитометрии. Во- первых, ворота по диагонали сгруппированных синглеты была создана путем построения графика вперед высоты рассеяния (FSC-H) в сравнении с площадью FSC (FSC-A) , а затем по высоте боковое рассеивание (SSC-H) в сравнении с SSC области (SSC-А; А и В) , Затем время ворота был создан , который включал только те события , которые были записаны в течение 5 - й и 90 - й процентили. Полученные клетки затем закрытого типа на "свалке канала" отрицательные, CD3 + клеток (C и D). На данном этапе,лимфоцит население разграничены на основе свойств SSC-A его FSC-А и и последующие анализы были проведены в рамках CD8 + клеток (E и F). После краткого изложения ПКИКЖ-I тетрамер + клеток (G), анализ фенотипирования памяти была выполнена в этих воротах (H). Макаки - резус памяти Т-клетки могут быть подразделены на три подмножества , основанные на экспрессию CD28 и CCR7: центральное запоминающее устройство (Т СМ; CD28 + CCR7 +), переходная памяти (Т EM1, CD28 - + CCR7-), и эффекторные памяти (T ЕМ2 ; CD28-CCR7-). Настоящий Протокол также включает в себя этап проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного оценки гранзимом (GZM B) выражение в пределах тетрамера + CD8 + Т-клеток (I). Заштрихованная область гистограммы соответствует тетрамера + CD8 + Т-клеток , окрашенных с изотипа управления мАт. Хотя BV 421-конъюгированного тетрамер + население, которое присутствовало в этом окрашиванияне показано на рисунке, та же стратегия стробирования должна использоваться для его анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Типичные результаты титрования БТР-сопряженного Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 тетрамера. РВМС от двух Маму-B * 008: 01+ макак были использованы для этого эксперимента: одно животное было SIV наивным и служил в качестве отрицательного контроля , тогда как другой был SIV-инфицированных и служил в качестве положительного контроля. Для того, чтобы определить количество Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 тетрамер , который дает наилучшее разделение между тетрамер + и tetramer- CD8 + Т-клеток, РВМС от каждого животного, инкубировали с указанными количествами реагента тетрамера ПКИКЖ-I. На основании этих результатов, 1,0 мкл / тест ваs выбрано в качестве оптимального количества для использования в будущих анализов. Стратегия стробирования используется для анализа данных описана на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Влияние лечения на ИПК интенсивности флуоресценции Mamu-B * 017: 01 тетрамеров. Ингибитор ИПК ингибирует интернализацию TCR комплексов и тем самым улучшает обнаружение АГ-специфических CD8 + Т-клеток с помощью меченное флуорохромом ПКИКЖ-я тетрамеры 32. (А - В) РВМС от двух Mamu-B * 017: 01+ макак - резус использовали в этом эксперименте: одна обезьяна была ВИО наивным и служил в качестве отрицательного контроля (A), в то время как другой был заражен SIV и служил в качествеположительный контроль (В). РВМС от обоих животных инкубировали при 37 ° С в присутствии ИПК в концентрации 50 нМ в течение 30 мин, а затем окрашивать с АРС-конъюгированного Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 тетрамера, как это описано в разделе Protocol , В качестве эталона, другой набор трубок подвергали тем же инкубационных и красящих условиях, за исключением того, диметилсульфоксид (ДМСО) добавляли вместо ПКИ. Стратегия стробирования используется для анализа данных описана на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| белка SIV | Аминокислотном положении | Аминокислотная последовательность | MHC класса I Молекула (новая номенклатура) | MHC класса I Молекула (старый nomenclaturе) | Эпитопное Краткое название |
| кляп | 181-189 | CTPYDINQM | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Gag CM9 |
| кляп | 254-262 | QNPIPVGNI | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Gag QI9 |
| кляп | 72-79 | GSENLKSLY | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Gag GY9 |
| Env | 830-838 | FHEAVQAVW | Маму-B * 017: 01 | Маму-B * 17 | Env FW9 |
| Env | 233-241 | CAPPGYALL | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Env CL9 |
| Env | 620-628 | TVPWPNASL | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Env TL9 |
| Env | 788-795 | RTLLSRVY | Маму-A1 * 002: 01 | Маму-A * 02 | Env RY8 |
| Env | 296-304 | RTIISLNKY | Маму-A1 * 002: 01 | Маму-A * 02 | Env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Маму-B * 008: 01 | Маму-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Маму-B * 008: 01 | Маму-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Маму-B * 017: 01 | Маму-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Vif ВЛ10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Маму-A1 * 002: 01 | Маму-A * 02 | Vif WY8 |
| оборот | 13-22 | KRLRLIHLL | Маму-B * 008: 01 | Маму-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Маму-A1 * 001 | Маму-A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Маму-B * 008: 01 | Маму-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Маму-B * 008: 01 | Маму-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Маму-B * 008: 01 | Маму-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Маму-B * 017: 01 | Маму-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Маму-B * 017: 01 | Маму-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <TD> Маму-A1 * 002: 01Маму-A * 02 | Nef YY9 |
Таблица 1: Список тетрамеров ПКИКЖ-I доступных для мониторинга SIV-конкретные ответы CD8 + Т-клеток в макак - резусов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько шагов в этой процедуре заслуживают обсуждения, поскольку они имеют решающее значение для приносит оптимальные результаты. Во- первых, поскольку качество биологических образцов является сильным прогностическим фактором успеха любого потока цитометрии анализа 38, все необходимо соблюдать осторожность , чтобы гарантировать , что клетки жизнеспособны и в суспензии во время процедуры окрашивания. Это особенно актуально при работе с криоконсервированных образцов, так как они более склонны к слипания и обычно содержат более высокие количества мертвых клеток. В этих случаях, проходя суспензии клеток через клеточный фильтр 70 мкм до процедуры тетрамер маркировки ПКИКЖ-I, возможно, значительно улучшить результаты. Во-вторых, надлежащая компенсация люминофоры, используемых в анализе является критическим для точного анализа данных, особенно при наличии нескольких параметров оцениваемого в том же самом эксперименте. В связи с этим, рекомендуется контроль свежей компенсации одноцветной быть готовым к каждой ПКИКЖ-I тетраметра ссодержащих анализ. Мы предпочитаем использовать компенсационные бусин из-за их широкой анти-Ig реакционной способности и тот факт, что они дают четкие бимодальные распределения положительных и отрицательных популяций. Так как эти шарики не связываются с молекулами MHC-I, антитела , конъюгированного с теми же флуорофоров , как тетрамеров ПКИКЖ-I (например, APC и BV 421) должны быть использованы в качестве контроля компенсации. Некоторые из таких компенсационных шариков доступны от нескольких поставщиков и должны использоваться в соответствии с инструкциями изготовителя. В- третьих, так как стратегия фенотипирования описанная здесь требует разграничения подмножеств Т-клеток CD8 + на основе градуированного экспрессии трех молекул (то есть, CD28, CCR7 и GZM B), воротные управления, такие как флуоресценции минус один (FMO) тесты или изотипа антитела, должны быть использованы для облегчения этих типов анализов. В наших экспериментах, например, отдельные пробирки , содержащие тетрамера ПКИКЖ-I + популяции CD8 + Т-клеток интересомповторно всегда окрашивали с контрольными изотип моноклональных антител, конъюгированных с теми же флюорохромами как моноклональные антитела против CD28, CCR7 и GZM B. Важно отметить, что хотя вышеупомянутые принципы могли бы помочь улучшить общее качество рМНС-я тетрамере окрашивании, они не являются единственными переменными, которые может повлиять на работу данного анализа. Учитывая уникальность каждого лабораторных условиях, весь рабочий процесс, описанный здесь следует проводить не реже одного раза на фиктивных образцов для обеспечения практики и соответствующих корректировок.
Любопытно, что ПКИКЖ-I тетрамере положительные CD8 + Т-клетки изредка наблюдаются в РВМС от SIV наивных (неинфицированных и непривитых) макак - резусов. Эти случаи не по всей видимости, является результатом фонового окрашивания на основе визуального осмотра данных. Скорее всего , они могут отражать взаимодействия между молекулами ПКИКЖ-I и убойной иммуноглобулин-подобные рецепторы (Кирс) экспрессируется на поверхности макаки - резус NK и CD8 + Т-клеток , 39,40. Действительно, Маму-А1 * 002: 01 тетрамеры сложенными с пептидами , соответствующими эпитопами Затычка GY9 и конв RY8 было показано, связываются с Mamu-KIRDL05 39. Вдоль этих линий, Маму-A1 * 002: 01 / Gag GY9 и Маму-A1 * 002: 01 / Env RY8 более склонны к выставления Ag-независимого ПКИКЖ-I тетрамерное окрашивания, описанный выше. Учитывая это явление, важно контролировать для этой базовой реакционной способности в экспериментах на обезьянах , включающих продольные оценки ВИО-специфических CD8 + ответы Т-клеток после инфекции или вакцинации. Для достижения этой цели целесообразно выполнить тетрамерное окрашивание ПКИКЖ-I на образцах, полученных в первый день лечения. Она также может иметь отношение к замораживанию PBMC в нескольких аликвоты малого размера в этих начальных моментов времени в случае сравнения с исходными образцы необходимы в будущих экспериментах.
Одно ограничение тетрамер окрашивания ПКИКЖ-I в том , что только CD8 + Т-клетки , известной специфичности и MHC-I рестрикционного Cизучаться этим подходом. Это особенно актуально в макак-резусов учитывая сложную организацию их MHC локусов. В самом деле, один макак резус гаплотип может иметь множество генов MHC-I, не все из которых кодируют молекулы , которые стабильно экспрессируются на поверхности клетки 29. В результате, это может быть трудно определить набор функциональных молекул MHC-I, выраженные данного животного. Тем не менее, это предостережение может быть преодолена путем разработки экспериментов , которые включают обезьян , которые являются положительными для известных аллелями MHC-I, такие как Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Маму-B * 008: 01, и Mamu- B * 017: 01.
В заключение, эта рукопись представляет собой оптимизированную ПКИКЖ-I протокол тетрамер Окрашивание для определения частоты и памяти фенотип ВИО-специфических CD8 + Т-клеток у макак - резусов. Так как ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания является более чувствительным, чем IFN-gamma ELISPOT и ICS анализов для обнаружения Ag-специфических CD8+ Т-клетки и не требует экстракорпорального Ag стимуляции, методология , представленная здесь особенно полезен для изучения влияния реакций CD8 + Т-клеток в исходе вируса иммунодефицита инфекции. Практическое знания , полученные от освоения этой техники также может быть полезным для обогащения Ag-специфических CD8 + Т-клеток как часть функциональных исследований и мониторинга CD8 + ответов Т-клеток в различных условиях болезни 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Уоткинса за поддержку экспериментов, которые позволили оптимизировать существующей методологии. В исследовании, опубликованном в данной публикации, была частично поддержана пилотным гранта, предоставленного Майами Центром исследований в области СПИДа Национальных институтов здравоохранения под номером награду P30AI073961. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
