Summary
Här presenterar vi en optimerad protokoll för att räkna och karakterisera Rhesusapa CD8 + T-celler mot AIDS-viruset. Den här artikeln är användbar inte bara till området för HIV immunologi, men även till andra delar av biomedicinsk forskning där CD8 + T-cellssvar är kända för att påverka sjukdoms resultatet.
Abstract
Peptid-MHC klass I (pMHC-I) tetramerer har varit ett ovärderligt verktyg för att studera CD8 + T-cellsvar. Eftersom dessa reagens direkt binda till T-cellreceptorer på ytan av CD8 + T-lymfocyter, fluorokrommärkta pMHC-I tetramerer möjliggöra noggrann detektering av antigen (Ag) -specifika CD8 + T-celler utan behovet av in vitro re -stimulering. Dessutom i kombination med flera färger flödescytometri kan pMHC-I tetramer färgning avslöja viktiga aspekter av Ag-specifika CD8 + T-celler, inklusive differentiering skede minne fenotyp och aktiveringsstatus. Dessa typer av analyser har varit särskilt användbar när det gäller HIV immunologi där CD8 + T-celler kan påverka utvecklingen till aids. Experimentell infektion av rhesusmakaker med simian immunbristvirus (SIV) ger ett ovärderligt verktyg för att studera cellulär immunitet mot AIDS-viruset. Som ett resultat, avse progress har gjorts när det gäller att definiera och karakterisera T-cellsvar i denna djurmodell. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att räkna upp SIV-specifika CD8 + T-celler i rhesusmakaker efter pMHC-I tetramer-färgning. Vår analys medger samtidig kvantifiering och minne fenotypning av två pMHC-I-tetramer + CD8 + T-cellpopulationer per test, vilket kan vara användbart för att spåra SIV-specifika CD8 + T-cellsvar som genereras av vaccination eller SIV-infektion. Med tanke på betydelsen av icke-mänskliga primater i biomedicinsk forskning, är denna metod tillämpas för att studera CD8 + T-cellsvar i miljöer flera sjukdomar.
Introduction
CD8 + T-celler innefattar en viktig del av det adaptiva immunsystemet som de deltar i tumörimmun övervakning och bidra till utrotningen av intracellulära patogener 1. I enkla termer, CD8 + T-celler uttrycker T-cellreceptorer (TCR) som specifikt känner igen peptid-MHC-klass I (pMHC-I) molekyler som är närvarande på plasmamembranet av värdceller. Eftersom dessa peptider härleds från proteolys av endogent syntetiserade proteiner på cellytan pMHC-I-komplex ge ett fönster in den intracellulära miljön. Vid virusinfektion, till exempel, kommer infekterade celler uppvisar MHC-I-molekyler som innehåller virushärledda peptider som kan fungera som ligander för TCR som uttrycks av patruller CD8 + -T-celler. I händelse av ett virus-specifika CD8 + T-cells påträffar en infekterad cell som presenterar dess pMHC-I-ligand, kommer TCR ingrepp resultera i CD8 + T-cellaktivering och ultiändan leda till målcellslys. Med tanke på den kritiska naturen av dessa TCR / pMHC-I-interaktioner, bestämma storleken, specificitet, och fenotyp att svara CD8 + T-celler kan ofta avslöja viktiga ledtrådar om mänskliga sjukdomar.
Fram till början av 1990-talet, kvantifiering av Ag-specifika CD8 + T-celler förlitat sig på den tekniskt krävande begränsande utspädning analys (LDA) 2,3. Inte bara LDA kräver flera dagar för att vara klar, det också misslyckats med att detektera celler som saknade proliferativ potential. Som ett resultat, LDA skattas vastly den verkliga frekvensen av antigen (Ag) -specifika CD8 + -T-celler som deltar i en immunrespons. Även om utvecklingen av ELISPOT och intracellulära cytokin färgnings analyser förbättrats kraftigt förmågan att mäta cellulär immunitet, dessa metoder fortfarande krävs stimulering in vitro för kvantifiering av Ag-specifika T-celler 4. Det var inte förrän 1996 som Altman, Davis, och colleagues publicerade sin milstolpe artikel rapporterar utvecklingen av pMHC-I tetramer teknik 5. Avgörande för framgången med denna teknik var multimerise av pMHC-I-molekyler, som förlängde halveringstiden för TCR / pMHC-I-interaktioner, vilket minskar sannolikheten för pMHC-I tetramerer faller bort under tvättningsstegen av flödescytometriska analyser. Den största fördelen med pMHC-I tetramerer över de tidigare nämnda analyser är förmågan att noggrant detektera Ag-specifika CD8 + T-celler direkt ex vivo utan att det behövs in vitro re-stimulering. Dessutom flöde kombinationen av pMHC-I tetramer färgning med flerfärgade cytometri har gjort detaljerade analyser av differentiering scenen, minne fenotyp och aktiveringsstatus av Ag-specifika CD8 + T-celler 2-4. Mot bakgrund av de senaste tekniska framstegen för karakterisering CD8 + T-cells repertoar pMHC-I multimer färgning 6, bredden av ansökningar for denna metod kommer sannolikt att fortsätta att expandera.
Få områden inom biomedicinsk forskning har gynnats mer från pMHC-I tetramer färgning än inom HIV immunologi 7. Även CD8 + T-celler hade tidsmässigt samband med den ursprungliga kontrollen av HIV viremi vid tidpunkten för offentliggörande av Altman, Davis och kollegor 8,9, användning av pMHC-I tetramerer i de följande åren väsentligt ökat vår förståelse av HIV-specifika CD8 + T-cellssvar. Till exempel, hjälpte pMHC-I tetramer färgning bekräftar den robusta storleken på virusspecifika CD8 + T-cellsvar i de flesta HIV-infekterade individer 10-12. Denna metod användes också för karakterisering av HIV och SIV-specifika CD8 + T-cellsvar begränsas av MHC-I-molekyler i samband med spontan kontroll av virusreplikation i frånvaro av antiretroviral terapi, ett fenomen som kallas "elit kontroll"
Experimentell SIV-infektion av rhesusmacaques (Macaca mulatta) är det bästa djurmodell för utvärdering av immun insatser mot hiv / aids 18,19. Under de senaste 25 åren har betydande framsteg gjorts när det gäller identifiering och karakterisering av SIV-specifika CD8 + T-celler i denna apa arter, däribland upptäckten av MHC-I-alleler och definitionen av peptidbindningsmotiv 13,20-27 . Som ett resultat har pMHC-I tetramerer utvecklats för analys av SIV-specifika CD8 + T-cellsvar i denna djurmodell 28. De flesta av dessa reagens är tillverkade av de genprodukter av fyra Rhesusapa MHC-I-alleler: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, och Mamu-B * 017: 01. Notera behöver rhesusmacaques inte uttrycka en MHC-C locus 29. De allra flesta av de pMHC-I tetramerer som används i de aktuella experimenten producerades vid NIH Tetramer Core Facility vid Emory University. Vissa av dessa reagens, inklusive Mamu-A1 * 001 tetramerer bundna till immun Gag CM9 epitop, kan endast erhållas från kommersiella källor på grund av licensavtal. Använda pMHC-I tetramerer av de fyra Rhesusapa alleler som anges ovan, har vi framgångsrikt uppräknade CD8 + T-celler mot totalt 21 SIV epitoper (tabell 1), som inducerades genom vaccination eller primär SIV-infektion 30,31 (Martins et al., opublicerade observationer).
Föreliggande manuskript tillhandahåller enoptimerad pMHC-I tetramer färgningsprotokollet för bestämning av frekvens och minnes fenotypen av SIV-specifika CD8 + -T-celler i rhesusmacaques. Analysen börjar med en valbar 30 min inkubation med en proteinkinashämmare (PKI, här, är Dasatinib används) för att minska TCR internalisering och därmed förbättra pMHC-I tetramer färgning 32. Som beskrivs nedan, är denna behandling särskilt användbart när man använder Mamu-B * 017: 01 tetramerer. Instruktioner om hur du märka cellerna med fluorokromkonjugerade pMHC-I tetramerer och monoklonala antikroppar (mAb) finns också. Detta protokoll omfattar även en cell permeabilization steg för den intracellulära detektering av cytolys associerade molekylen granzym B (GZM B). MAb mot CD3 tillsätts vid detta steg samt att förbättra upptäckten av denna TCR signalmolekyl. Som referens, alla fluorokromer som används i denna färgning panel i listan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifert blod mononukleära celler (PBMC) prover som används i detta manuskript erhölls från indiska rhesusmakaker inrymt i Wisconsin National Primate Research Center. Dessa djur vårdas i enlighet med den Weatherall rapport enligt ett protokoll som godkänts av University of Wisconsin Graduate School Animal Care och användning kommittén 33. Alla djurförsök utfördes under narkos och alla ansträngningar gjordes för att minimera potentiella lidande.
1. PKI Behandling
OBS: Detta är valfritt, men rekommenderas för Mamu-B * 017: 01 tetramerer. Se RESULTAT OCH DISKUSSION avsnitt.
- Återsuspendera PBMC i R10-medium vid en koncentration av 1,6 x 10 7 celler / ml.
- Tillsätt 50 pl av denna cellsuspension till motsvarande flödescytometri rör. Tillsätt 50 ul av en 100 nM lösning av PKI till varje rör.
- Vortexblanda varje rör. Inkubera vid 37 ° C under 30 min. I slutet av dettasteg bör varje rör ha 100 pl av en cellsuspension innehållande 8,0 x 10 5 PBMC och 50 nM av PKI.
- Fortsätt till pMHC-I tetramer färgning steg.
2. Färgning med fluorokrommärkta pMHC-I Tetramers
- Innan du förbereder pMHC-I tetramer Master Mix, centrifugera pMHC-I tetramer rör vid 20.000 xg under åtminstone 15 minuter vid 4 ° C. Målet med detta steg är att pelletera proteinaggregat i pMHC-I tetramer lösning som kan öka bakgrundsfärgning. När centrifugeringssteget är gjort, undvika pipettering från botten av röret, där proteinaggregaten kommer att ha ackumulerats.
- Förbered tillräckligt pMHC-I tetramer Master Mix för att färga alla experimentella rör. Förbereda ett överskott av 15% av den totala volymen av denna huvudblandning för att svara för pipettering fel.
- Späd pMHC-I tetramerer i fläck buffert (t.ex. Brilliant Stain Buffer), så att 25 pl av pMHC-I tetramer masterblandning är added till varje test.
- Etikett PBMC med två pMHC-I tetramerer per test; en konjugerad till allofykocyanin (APC) och den andra till Brilliant Violet (BV) 421.
- Lägg 8,0 x 10 5 PBMC till motsvarande flödescytometri rör i en slutlig volym av 100 | il. Om cellerna utsattes för PKI behandling som beskrivits ovan, bör de redan vara återsuspenderades i 100 | il i detta steg.
- Tillsätt 25 pl pMHC-I tetramer Master Mix till motsvarande flödescytometri rör. I slutet av detta steg, bör den slutliga volymen i varje rör vara 125 l.
- Vortex varje rör i syfte att homogenisera cellsuspension.
- Inkubera i mörker vid rumstemperatur under 45 minuter. Förbered ytan färgning mAb cocktail under 45 min inkubation.
3. ytfärgning
- Förbered tillräckligt mAb Master Mix för att färga alla experimentella rör. Förbereda ett överskott av 15% av den totala volymen av denna masterblandning till svarsför pipettering fel.
- Justera volymen Master Mix med fläck buffert så att 50 pl tillsätts per test.
- För korrekt uteslutning av icke-CD8 + T-celler och avgränsning av minnesgrupper, användning titreras mängder mAbs riktade mot följande molekylerna i ytfärgning Master Mix.
OBS! Fluorokromer konjugerade till varje mAb tillhandahålls som en referens: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 och CCR7 FITC. Notera att mAbs mot CD14, CD16 och CD20 är konjugerade till samma fluorokrom (dvs BV 510), eftersom de kommer att ingå i "dumpa" grind. - Inkludera en fastställbara färgämne för att skilja döda celler i ytan färgning Master Mix [dvs aminreaktiva färgämne (ARD)]. Kontrollera att ARD reagenset är konjugerad till en fluorokrom med en liknande emissionsspektrum som de som användes i "dumpa" grind. I det här fallet använder ARD Aqua.
- Tillsätt 50 pl avfärgnings Master Mix som beskrivs i 3,1-3,4 till motsvarande flödescytometri rör. Vid slutet av detta steg, bör den slutliga volymen i varje rör vara 175 | j, l.
- Vortexblanda varje rör. Inkubera i mörker vid rumstemperatur under 25 minuter.
- Tvätta cellerna med tvättbuffert (PBS-lösning innehållande 0,1% bovint serumalbumin och 0,45 g / L NaN3).
VARNING: Natriumazid är ett giftigt ämne. Exponering för även mycket små mängder kan orsaka symptom. Hantera detta ämne i enlighet med de riktlinjer som anges av Environmental Health and Safety (EHS) kontor i den institution där dessa experiment utförs. - Centrifugera rören vid 510 xg under 5 min. Dekantera försiktigt supernatanten i en separat avfallsbehållare. Var noga med att inte störa pelleten.
VARNING: Inte dekantera tvättbuffert supernatanten i reservoarer som innehåller blekmedel eftersom det kan reagera med natriumazid närvarande i tvättbuffert och resultera i bildandet av en giftig gas 34. Contakta EHS kontoret vid den institution där dessa experiment utförs för riktlinjer för hur man gör med natriumazid. - Efter dekantering, virvel cellerna i kvarvarande vätska kvar i varje rör.
4. Cell Fixering
- Tillsätt 250 | il av en 2% paraformaldehyd (PFA) lösning till alla rören för att fixera cellerna.
VARNING: PFA är ett giftigt ämne. Exponering för även mycket små mängder kan orsaka symptom. Hantera detta ämne i enlighet med de riktlinjer som anges av EHS kontoret vid den institution där dessa experiment utförs.- Sedan 2% PFA lösning måste vara isoton till cellerna använder PBS för att förbereda denna lösning. Etthundra milliliter av en 2% PFA lösning räcker för flera experiment. Grundligt virvel alla rör omedelbart efter tillsatsen av 2% PFA, för att förhindra bildandet av cellaggregat.
- Inkubera i mörker vid 4 ° C under 20 minuter.
- Waska celler genom att upprepa steg från 3,7 till 3,9. När detta steg är slutfört, kan cellerna lagras i mörker vid 4 ° C under 24-48 h. Innan vi går vidare till Permeabilization fasen, virvel rören noggrant.
5. Permeabilization av celler
- Tillsätt 500 l av permeabilization buffert. Vortex alla rör.
- Inkubera i mörker vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Tvätta cellerna genom steg 3,7-3,9 upprepas.
6. intracellulär färgning
- Förbered tillräckligt mAb Master Mix för att färga alla experimentella rör.
- Justera volymen med PBS eller bets buffert så att 50 pl av den intracellulära mAb Master Mix tillsätts per test.
- Förbered mAb Master Mix som beskrivs i 6.1 och 6.2 Använda titreras mängder mAbs riktade mot CD3 och GZM B.
OBS: TCR ingrepp med pMHC-I tetramerer kan resultera i CD3 intemalisering, som kan störa detekteringen av tetramer + CD3 + CD8 +T-celler om den anti-CD3-mAb tillsätts till ytan färgning Master Mix. För att undvika detta genom att lägga till anti-CD3 mAb i detta skede, det vill säga efter det att cellerna permeabiliseras. Fluorokromerna konjugerade till varje mAb listas som en referens: CD3 PerCP Cy5.5 och GZM B PE. - Tillsätt 50 pl av mAb cocktail till motsvarande rören. Inkubera i mörker vid rumstemperatur under 30 minuter.
- Tvätta cellerna genom steg 3,7-3,9 upprepas. Är rören klara att förvärvas i en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här har använts för att bestämma storleken och minnes fenotypen av vaccininducerade, Gag CM9-specifika CD8 + T-cellsvar i ett Mamu-A1 * 001 + rhesus macaque. För denna analys var en APC-konjugerat Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer används i en 8-färg flödescytometrisk färgning panel. Figur 1A - F visar grind strategi som används för att analysera data, som skall tillämpas för båda tetramerer som finns i varje test. Notera att pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellspopulation är väl separerade med minimal bakgrund (figur 1F och G). Memory CD8 + T-celler i rhesusmacaques kan klassificeras som tre undergrupper baserade på ytan uttryck av CD28 och CCR7: central minne (T CM, CD28 + CCR7 +), övergångs minne (T EM1, CD28 + CCR7-) och effektor minne (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Detta protokoll omfattar även en cell permeabilization steg för intracellulär detektion av GZM B och CD3. Figur 1G - Jag visar avgränsningen av minnesgrupper och GZM B-uttryck CD8 + T-celler i tetramer + grinden.
Bakgrundsfärgning kan ge suboptimala resultat i pMHC-I tetramer märknings analyser. För att undvika detta, är några försiktighetsåtgärder som föreslås. Som framgår av protokollet avsnittet bör ampullerna innehåller pMHC-I tetramer reagenser alltid centrifugeras vid 20.000 xg under åtminstone 15 minuter före beredning av masterblandningar. Målet med detta steg är att pellets några proteinaggregat som kan vara i pMHC-I tetramer lösning. Dessutom, titrering varje reagens före användning rekommenderas också. Helst MHC-I-matchade celler som gör eller inte innehåller Ag-specifika CD8 + T-cellpopulationen intresse bör märkas med relevant pMHC-I tetramer. denna CAn åstadkommas genom färgning frysförvarade PBMC från SIV naiva (negativ kontroll) och SIV-infekterade (positiv kontroll) makaker sida vid sida med olika mängder av en nyligen erhållna pMHC-I tetramer. I figur 2, till exempel, 1,0 | il / test av en APC-konjugerad Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrameren gav den bästa separationen mellan tetramer positiva och negativa CD8 + T-cellpopulationer. Slutligen valet av fluorokrom kan också avsevärt påverka resultaten från pMHC-I tetramer färgningar. I detta avseende pMHC-I tetramerer konjugerad till dim molekyler (t.ex., fluorescein) bör undvikas. I vår erfarenhet, har gett de bästa resultaten pMHC-I tetramerer konjugerade till ljusa fluorokromer, såsom PE, APC, och BV 421.
Vi har märkt att Mamu-B * 017: 01 tetramerer ger vanligtvis dim färgning, även när de är konjugerade till de ljusa fluorokromer som nämns ovan. Orsakerna till dettalåg fluorescensintensitet är inte helt klart, men kan omfatta låg affinitet TCR / Mamu-B * 017: 01 interaktioner och snabb TCR interna på tetramer bindning 36,37. Längs dessa linjer har PKIs visats hämma TCR interna på ytan av CD8 + T-celler 32. Som ett resultat kan PKIs förbättra detektion av Ag-specifika CD8 + T-celler genom pMHC-I tetramer-färgning. Vi har bekräftat detta i våra experiment, där kvaliteten på Mamu-B * 017: 01 tetramer färgningar kan förbättras väsentligt genom förbehandling PBMC med en PKI (Figur 3). Märkligt nog gjorde förbehandling med denna PKI inte att förbättra färgningen av andra pMHC-I tetramerer som testats här (data ej visade), vilket antyder att Mamu-B * 017: 01-begränsade CD8 + -T-celler kan vara unikt i sin känslighet till PKI behandling.
Figur 1: grind strategi och representativa resultat av en lyckad pMHC-I tetramer färgning. Vi utvärderade storleken och minnes fenotypen av vaccininducerade Gag CM9-specifika CD8 + -T-celler i PBMC från en Mamu-A1 * 001 + rhesus macaque. Här, var en APC-konjugerad Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer används i en 8-färg flödescytometrisk färgning panel. (A - F) gating strategi för flödescytometrisk analys. Först framställdes en grind på diagonalt klustrade sing skapas genom att plotta framåtspridning höjd (FSC-H) som funktion av FSC område (FSC-A) och därefter sidospridning höjd (SSC-H) kontra SSC område (SSC-A; A och B) . Därefter en gång grind skapas som ingår endast de händelser som registrerats inom 5: e och 90: e percentilen. De resulterande cellerna var sedan gated on "dump kanal" negativa, CD3 + celler (C och D). I detta skede, denLymfocytpopulationen var avgränsad baserat på dess FSC-A och SSC-A egenskaper och efterföljande analyser utfördes inom CD8 + celler (E och F). Efter beskriver pMHC-I tetramer + celler (G), var minnes fenotypning analysen utförs inom denna port (H). Rhesusapa minnes T-celler kan delas in i tre undergrupper baserat på uttrycket av CD28 och CCR7: central minne (T CM, CD28 + CCR7 +), övergångs minne (T EM1, CD28 + CCR7-) och effektor minne (T EM2 ; CD28-CCR7-). Det nuvarande protokollet innefattar också en cell permeabilization steg för den intracellulära utvärdering av Granzyme B (GZM B) uttryck inom tetramer + CD8 + T-celler (I). Det skuggade området i histogrammet motsvarar tetramer + CD8 + -T-celler färgades med en isotyp-matchad kontroll-mAb. Även om BV 421-konjugerad tetramer + befolkning som fanns i denna färgning ärej visad i figuren, bör samma grindningsstrategi användas för att analysera den. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat av titrering av en APC-konjugerat Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer. PBMC från två Mamu-B * 008: 01+ rhesusmacaques användes för detta experiment: ett djur var SIV naiv och tjänade som negativ kontroll, medan den andra var SIV-infekterade och tjänade som positiv kontroll. För att bestämma mängden av Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer som ger det bästa separationen mellan tetramer + och tetramer- CD8 + T-celler, PBMC från varje djur inkuberades med de indikerade mängderna av pMHC-I tetramer reagens. Baserat på dessa resultat, 1,0 l / prov was väljs som den optimala mängden som skall användas i framtida analyser. Grind strategi används för att analysera data beskrivs i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekter av PKI-behandling på fluorescensintensiteten för Mamu-B * 017: 01 tetramerer. PKI-inhibitorn inhiberar internalisering av TCR-komplex och därigenom förbättrar detektion av Ag-specifika CD8 + T-celler genom fluorokrommärkta pMHC-I-tetramerer 32. (A - B) PBMC från två Mamu-B * 017: 01+ rhesusmacaques användes i detta experiment: en apa var SIV naiv och tjänade som den negativa kontrollen (A), medan den andra var infekterade med SIV och tjänstgjorde somden positiva kontrollen (B). PBMC från båda djuren odlades vid 37 ° C i närvaro av PKI vid en koncentration av 50 nM för 30 minuter före färgning med en APC-konjugerat Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetramer, som beskrivs i protokollet sektionen . Som referens, var en annan uppsättning rör utsattes för samma inkubationsbetingelser och färgningsbetingelser, med undantag för att dimetylsulfoxid (DMSO) tillsattes i stället för PKI. Grind strategi används för att analysera data beskrivs i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| SIV-proteinet | Aminosyraposition | Aminosyrasekvens | MHC klass I-molekyl (ny nomenklatur) | MHC klass I-molekyl (gammal nomenklature) | Epitop Kortnamn |
| Gag | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| Gag | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| Gag | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY9 |
| vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | vif RL9 |
| vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | vif RL8 |
| vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | vif HW8 |
| vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | vif VL10 |
| vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | vif WY8 |
| Varv | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tabell 1: Förteckning över pMHC-I tetramerer tillgängliga för att övervaka SIV-specifika CD8 + T-cellsvar i rhesusmacaques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Några steg i denna procedur merit diskussion eftersom de är av avgörande betydelse för framställning av optimala resultat. Först, eftersom kvaliteten på de biologiska prover är en stark prediktor för framgång för varje flödescytometrisk analys 38, all vård måste vidtas för att säkerställa att cellerna är livskraftiga och i suspension under färgningsproceduren. Detta är särskilt relevant när man arbetar med kryokonserverade prover eftersom de är mer benägna att klumpar och innehåller typiskt högre antal döda celler. I dessa fall, passerar cellsuspensionen genom en 70 ìm cell sil innan pMHC-I tetramer märkningsförfarandet skulle avsevärt förbättra resultaten. För det andra, är kritisk för exakt dataanalys skälig ersättning av fluorokromerna som används i analysen, särskilt när flera parametrar utvärderas i samma experiment. I detta avseende är det rekommenderat att kontrollerna färska enfärgade kompensations vara beredd på varje pMHC-I tetramer slande analys. Vi gynnar användningen av kompensations pärlor på grund av deras breda anti-Ig-reaktivitet och det faktum att de ger tydliga bimodala fördelningar av positiva och negativa populationer. Eftersom dessa pärlor inte binder till MHC-I-molekyler, antikroppar konjugerade till samma fluoroforer som de pMHC-I tetramerer (t.ex., APC och BV 421) bör användas som kontroller för ersättning. Flera sådana kompensations pärlor är tillgängliga från flera leverantörer och bör användas i enlighet med tillverkarens instruktioner. För det tredje, eftersom fenotypning strategi som beskrivs här kräver avgränsningen av CD8 + T-cellundergrupper baserade på den graderade uttrycket av tre molekyler (dvs. CD28, CCR7 och GZM B), grind kontroller, såsom fluorescens minus ett (FMO) test eller isotyp-matchade antikroppar, bör användas för att underlätta dessa typer av analyser. I våra experiment, till exempel, separata rör innehållande pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellspopulation intresse enre alltid färgas med isotyp kontroll mAbs konjugerade till samma fluorokromer som de mAbs mot CD28, CCR7 och GZM B. Viktigt, även om ovanstående riktlinjer kan bidra till att förbättra den övergripande kvaliteten på pMHC-I tetramer färgningar, är de inte de enda variabler som kan påverka prestanda för denna analys. Med tanke på det unika i varje laboratoriemiljö, bör utföras hela arbetsflödet som beskrivs här minst en gång på mock prov för att möjliggöra praktik och relevanta justeringar.
Märkligt nog pMHC-I tetramer positiva CD8 + T-celler ibland observeras i PBMC från SIV naiva (oinfekterade och ovaccinerade) rhesusmacaques. Dessa fall verkar inte vara ett resultat av bakgrundsfärgning baserat på visuell inspektion av data. Snarare kan de återspeglar interaktioner mellan pMHC-I-molekyler och mördar immunoglobulinliknande receptorer (KIRs) uttrycks på ytan av Rhesusapa NK- och CD8 + T-celler 39,40. Faktiskt, Mamu-A1 * 002: 01 tetramerer vikta med peptider som motsvarar de Gag GY9 och Env RY8 epitoper har visat sig binda till Mamu-KIRDL05 39. Längs dessa linjer, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 och Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 är mer benägna att uppvisa Ag-oberoende pMHC-I tetramer färgning som beskrivs ovan. Med tanke på detta fenomen, är det viktigt att kontrollera för denna baslinje reaktivitet i apa försök med längsgående bedömningar av SIV-specifika CD8 + T-cellsvar efter infektion eller vaccination. För att uppnå detta är det lämpligt att utföra pMHC-I tetramer färgning på prover som erhållits på den första behandlingsdagen. Det kan också vara relevant att frysa PBMC i flera mindre storlek portioner på dessa inledande tidpunkter i fall jämförelser med baslinjeprover behövs i framtida experiment.
En begränsning med pMHC-I tetramer-färgning är att endast CD8 + T-celler med känd specificitet och MHC-I-restriktions cen studeras genom denna metod. Detta är särskilt relevant i rhesusmacaques tanke på den komplexa organisationen av deras MHC loci. I själva verket kan en enda Rhesusapa haplotyp har dussintals MHC-I-gener, inte alla som kodar molekyler som stabilt uttrycks på cellytan 29. Som ett resultat kan det vara svårt att bestämma den uppsättning av funktionella MHC-I-molekyler uttryckta av ett givet djur. Icke desto mindre kan detta förbehåll övervinnas genom att utforma experiment som inkluderar apor som är positiva för kända MHC-I-alleler, såsom Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, och Mamu- B * 017: 01.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta manuskript en optimerad pMHC-I tetramer färgningsprotokollet för bestämning av frekvens och minnes fenotypen av SIV-specifika CD8 + -T-celler i rhesusmacaques. Sedan pMHC-I tetramer-färgning är känsligare än IFN-γ ELISPOT och ICS-analyser för detektion av Ag-specifika CD8+ T-celler och kräver inte in vitro Ag stimulering är särskilt användbar för att studera effekterna av CD8 + T-cellsvar i resultatet av immunbristvirus infektion metod som presenteras här. Den praktiska kunskaper från behärska denna teknik kan även vara användbar för att berika Ag-specifika CD8 + T-celler som en del av funktionella studier och för övervakning av CD8 + T-cellsvar i olika miljöer sjukdoms 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka David Watkins för att stödja de experiment som gjorde det möjligt för optimering av den nuvarande metoden. Research rapporterade i denna publikation stöddes delvis av en pilotbidrag från Miami Centrum för AIDS-forskning av National Institutes of Health i tilldelning nummer P30AI073961. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
