Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse av Simian Immunodeficiency Virus-spesifikke CD8 Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54881
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Miami

Summary

Her presenterer vi en optimalisert protokoll for opplisting og karakter rhesusape CD8 + T-celler mot AIDS-viruset. Denne artikkelen er nyttig ikke bare til feltet av HIV immunologi, men også til andre områder av biomedisinsk forskning hvor CD8 + -T-celleresponser er kjent for å påvirke sykdomsforløp.

Abstract

Peptid-store histokompatibilitetskompleks klasse I (pMHC-I) tetramerer har vært et uvurderlig verktøy for å studere CD8 + T-celleresponser. Fordi disse reagensene direkte binder seg til T-celle-reseptorer på overflaten av CD8 + T-lymfocytter, fluorokromkonjugerte merket pMHC-I tetramerer muliggjøre nøyaktig deteksjon av antigen (Ag) -spesifikk CD8 + T-celler uten behov for in vitro gjen -stimulering. Dessuten, når det kombineres med flere farge flowcytometri, kan pMHC-I tetramer farging åpenbare nøkkelaspekter ved Ag-spesifikke CD8 + T-celler, innbefattende differensieringstrinn, hukommelse fenotype, og aktiveringsstatusen. Slike analyser er særlig nyttig på området HIV immunologi hvor CD8 + T-celler kan påvirke progresjon til AIDS. Eksperimentell infeksjon av rhesusape med Simian immunsviktvirus (SIV) gir et uvurderlig verktøy for å studere cellulær immunitet mot AIDS-viruset. Som et resultat av betydelig progress har blitt gjort i å definere og karakterisere T-celleresponser i denne dyremodell. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for opplisting SIV spesifikke CD8 + T-celler i rhesusape av pMHC-I tetramer farging. Vår analyse tillater den samtidige kvantifisering og hukommelse fenotyping av to pMHC-I tetramer + CD8 + T-celle-populasjoner per test, som kan være nyttig for sporing av SIV-spesifikke CD8 + T-celle-responser generert ved vaksinering eller SIV-infeksjon. Med tanke på relevansen av ikke-humane primater i biomedisinsk forskning, er denne metodikk anvendbar for å studere CD8 + T-celleresponser i flere sykdoms innstillinger.

Introduction

CD8 + T-celler utgjør en viktig del av det adaptive immunsystemet som de deltar i tumor immunovervåkning og bidra til utryddelse av intracellulære patogener 1. Enkelt sagt, CD8 + T-celler som uttrykker T-celle-reseptorer (TCR) som spesifikt gjenkjenner peptid-store histokompatibilitetskompleks klasse I (pMHC-I) molekyler tilstede på plasmamembranen til vertsceller. Siden disse peptidene er avledet fra proteolyse av endogent syntetiserte proteiner, celleoverflate pMHC-I komplekser tilveiebringe et vindu inn i det intracellulære miljøet. Ved virusinfeksjon, for eksempel, vil infiserte celler viser MHC-I molekyler inneholdende virus-avledede peptider som kan tjene som ligander for TCR uttrykt av patruljerende CD8 + T-celler. I tilfelle en virus-spesifikke CD8 + T-celle møter en infisert celle som presenterer sin pMHC-I-ligand, vil TCR inngrep resultere i CD8 + T-celleaktivering og ultiinstans føre til målet cellelyse. Gitt den kritiske naturen av disse TCR / pMHC-I interaksjoner, bestemme omfanget, spesifisitet, og fenotype reagere CD8 + T-celler kan ofte avdekke viktige ledetråder om menneskelige sykdommer.

Fram til tidlig på 1990-tallet, kvantifisering av Ag-spesifikke CD8 + T-celler er avhengige av teknisk krevende begrensende fortynning analysen (LDA) 2,3. Ikke bare gjorde LDA kreve flere dager å bli ferdig, det også klart å påvise celler som manglet proliferativ potensial. Som et resultat av LDA vesentlig underestimert den faktiske frekvensen av antigen (Ag)-spesifikke CD8 + T-celler som deltar i en immunrespons. Selv om utviklingen av ELISPOT og intracellulære cytokin fargings assays sterkt forbedret evne til å måle cellulær immunitet, disse fremgangsmåtene fremdeles nødvendig in vitro stimulering for kvantifisering av Ag-spesifikke T-celler 4. Det var ikke før 1996 at Altman, Davis, og colleagues publisert deres landemerke artikkelen rapporterer utviklingen av pMHC-I tetramer teknologi 5. Kritisk for å lykkes med denne teknikken ble den multimerization av pMHC-I-molekyler, som forlenget halveringstid på TCR / pMHC-I interaksjoner, for derved å redusere sannsynligheten for pMHC-I tetramerer faller av under vasketrinnene av strømningscytometriske analyser. Den største fordelen med pMHC-I tetramerer enn de ovennevnte analysene er muligheten for nøyaktig bestemmelse av Ag-spesifikke CD8 + T-celler direkte ex vivo uten behov for in vitro re-stimulering. Videre er kombinasjonen av pMHC-I tetramer farving med flere farge flowcytometri har tillatt detaljerte analyser av differensieringstrinnet, hukommelse fenotype, og aktiveringsstatusen til Ag-spesifikke CD8 + T-celler 2-4. I lys av de siste tekniske fremskritt for karakterisering av CD8 + T-celle repertoar av pMHC-I multimer flekker 6, bredden av applikasjoner for denne metoden vil trolig fortsette å utvide.

Få områder i biomedisinsk forskning har dratt nytte mer fra pMHC-I tetramer flekker enn innen hiv immunologi 7. Selv om CD8 + T-celler var blitt temporalt forbundet med den første kontrollen av HIV-viremi ved tidspunktet for den publikasjon av Altman, Davis og medarbeidere 8,9, bruk av pMHC-I tetramerer i de påfølgende år utvidet vår forståelse av betydelig HIV-spesifikke CD8 + T-cellerespons. For eksempel, pMHC-I tetramer farging bidratt til å bekrefte den sterke størrelsen av virus-spesifikke CD8 + T-celle-responser i de fleste HIV-infiserte individer 10-12. Denne metodikken også til rette for karakterisering av HIV- og SIV-spesifikke CD8 + T-celle-responser begrenses av MHC-I molekyler forbundet med spontan kontroll av viral replikasjon i fravær av antiretroviral behandling-et fenomen kjent som "elite kontroll" + T-celler i ukontrollert kronisk infeksjon 16,17. Sammen er disse studier underanvendeligheten av pMHC-I tetramerer for overvåkning av CD8 + T-celle responser mot AIDS-virus.

Eksperimentell SIV infeksjon av rhesusape (Macaca Mulatta) er fortsatt den beste dyremodell for å vurdere immun intervensjoner mot HIV / AIDS 18,19. I de siste 25 årene har store fremskritt er gjort i identifisering og karakterisering av SIV spesifikke CD8 + T-celler i denne apearter, inkludert oppdagelsen av MHC-I alleler og definisjonen av peptid binding motiver 13,20-27 . Som et resultat, har pMHC-I-tetramerer er utviklet for analyse av SIV-spesifikke CD8 + T-cellesvarene i denne dyremodell 28. De fleste av disse reagenser er laget av genprodukter av fire rhesusape MHC-I-alleler: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, og Mamu-B * 017: 01. Av notatet, rhesusape ikke uttrykke en MHC-C locus 29. De aller fleste av de pMHC-I tetramers som brukes i dagens eksperimenter ble produsert ved NIH Tetramer Kjerne Facility ved Emory University. Likevel, noen av disse reagenser, inkludert Mamu-A1 * 001 tetramers bundet til immunodominant Gag CM9 epitop, kan kun fås fra kommersielle kilder på grunn av lisensavtaler. Bruke pMHC-I tetramers av de fire rhesusape alleler som er nevnt ovenfor, har vi lykkes nummerert CD8 + T-celler mot totalt 21 SIV epitoper (tabell 1), som ble utløst av vaksinasjon eller primær SIV infeksjon 30,31 (Martins et al., upubliserte observasjoner).

Den nåværende manuskriptet gir enoptimalisert pMHC-I tetramer farging protokoll for å bestemme frekvensen og hukommelse fenotype av SIV-spesifikke CD8 + T-celler i rhesusape. Analysen starter med et valg 30 min inkubering med en protein kinase inhibitor (PKI, her blir Dasatinibs anvendes) for å redusere TCR internalisering og derved forbedre pMHC-I tetramer farging 32. Som beskrevet nedenfor, er denne behandlingen spesielt nyttig når du bruker Mamu-B * 017: 01 tetramers. Instruksjoner om hvordan du merke celler med fluorokromkonjugerte konjugert pMHC-I tetramers og monoklonale antistoffer (mAbs) tilbys også. Denne protokollen innbefatter også en celle permeabiliseringen trinn for den intracellulære påvisning av cytolyse-assosiert molekyl granzyme B (Gzm B). MAb mot CD3 tilsettes ved dette trinnet i tillegg til å forbedre deteksjon av denne TCR signalmolekyl. Som en referanse, er alle fluorokromer anvendes i denne fargingen panel oppført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De perifert blod mononukleære celle (PBMC) prøver benyttes i dette manuskriptet ble hentet fra indiske rhesusape plassert på Wisconsin National Primate Research Center. Disse dyrene var ivaretatt i samsvar med Weatherall Rapporter under en protokoll godkjent av University of Wisconsin Graduate School Animal Care og bruk komité 33. Alle dyr prosedyrer ble utført under anestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimere potensiell lidelse.

1. PKI Treatment

MERK: Dette er valgfritt, men anbefales for Mamu-B * 017: 01 tetramers. Se Diskusjons §§ Resultater og.

  1. Resuspender PBMC i R10 medium ved en konsentrasjon på 1,6 x 10 7 celler / ml.
  2. Tilsett 50 ul av denne cellesuspensjon til det tilsvarende flowcytometri rør. Tilsett 50 ul av en 100 nM løsning av PKI til hvert rør.
  3. Vortex hvert rør. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter. Ved slutten av dennetrinn, bør hvert rør har 100 ul av en cellesuspensjon inneholdende 8,0 x 10 5 PBMC og 50 nM for PKI.
  4. Fortsett til pMHC-I tetramer farging trinn.

2. Farging med fluorokromkonjugerte merket pMHC-I tetramers

  1. Før forberede pMHC-I tetramerfritt mester mix, sentrifuger pMHC-I tetramer rør på 20 000 xg i minst 15 min ved 4 ° C. Målet med dette trinnet er å pellet protein aggregater i pMHC-I tetramer løsning som kan øke bakgrunnsfarging. Når sentrifugeringstrinn er ferdig, unngå pipettering fra bunnen av røret hvor proteinaggregater kan ha samlet seg.
  2. Forbered nok pMHC-I tetramer mester mix å farge alle eksperimentelle rør. Fremstille et overskudd på 15% av det totale volum av denne masterblanding til konto for pipettering feil.
  3. Fortynnet pMHC-I tetramers i flekken buffer (f.eks Brilliant Stain Buffer), slik at 25 mL av pMHC-I tetramer mester mix er Added til hver test.
    1. Etikett PBMC med to pMHC-I tetramers per test; en konjugert til allofykocyanin (APC) og den andre til Brilliant Violet (BV) 421.
  4. Legg 8,0 x 10 5 PBMC til den tilsvarende flowcytometri rør i et sluttvolum på 100 ul. Hvis cellene ble utsatt for PKI-behandling som er beskrevet ovenfor, bør de allerede resuspenderes i 100 pl på dette trinnet.
  5. Legg 25 ul av pMHC-I tetramer konsentrat-blanding med den tilsvarende flowcytometri rør. Ved slutten av dette trinn, bør det endelige volum i hver enkelt rør være 125 ul.
  6. Vortex hvert rør for å homogenisere cellesuspensjonen.
  7. Inkuber i mørke ved romtemperatur i 45 min. Forberede overflaten flekker mAb cocktail i løpet av denne 45 min inkubasjon.

3. Surface Farging

  1. Forbered nok mAb mester mix å farge alle eksperimentelle rør. Fremstille et overskudd på 15% av det totale volum av denne masterblanding til å gjøre redefor pipettering feil.
  2. Juster volumet av master mix med flekk buffer slik at 50 fil legges per test.
  3. For riktig utelukkelse av ikke-CD8 + T-celler og avgrensning av hukommelses undergrupper, bruk titrert mengder av mAbs rettet mot disse molekylene i overflatefarging konsentrat-blanding.
    MERK: fluorokromer konjugert til hver mAbs er gitt som en referanse: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7, og CCR7 FITC. Legg merke til at mAb'er mot CD14, CD16, CD20 og er konjugert til det samme fluorkrom (dvs. BV 510), siden de vil bli inkludert i "dump" gate.
  4. Ta med en fixable fargestoff for å skille døde celler i overflaten flekker mester mix [dvs. amin reaktive fargestoff (ARD)]. Kontroller at ARD reagens konjugert til et fluorokromkonjugerte med en tilsvarende emisjonsspekteret som de som brukes i "dumpe" gate. I dette tilfellet bruker ARD Aqua.
  5. Tilsett 50 ulfargings konsentrat-blanding som er beskrevet i 3,1-3,4 til den tilsvarende flowcytometri rør. Ved slutten av dette trinn, bør det endelige volum i hver enkelt rør være 175 ul.
  6. Vortex hvert rør. Inkuber i mørke ved romtemperatur i 25 min.
  7. Vask cellene med vaskebuffer (PBS-løsning inneholdende 0,1% bovint serumalbumin og 0,45 g / l NaN3).
    FORSIKTIG: Natriumazid er et giftig stoff. Eksponering for selv små mengder kan forårsake symptomer. Håndtere dette stoffet i henhold til retningslinjene fastsatt av Environmental Health og sikkerhet (HMS) Kontoret ved institusjonen hvor disse eksperimentene blir utført.
  8. Sentrifugerør ved 510 xg i 5 min. dekanter supernatanten forsiktig inn en egen avfallsbeholder. Pass på ikke å forstyrre pelleten.
    FORSIKTIG: Ikke dekanter vaskebuffer supernatanten i reservoarer som inneholder blekemiddel som det kan reagere med natriumazid stede i vaskebuffer og resultere i dannelsen av en giftig gass 34. Contakt HMS Kontoret ved institusjonen hvor disse eksperimentene blir utført for retningslinjer for hvordan du skal kvitte natriumazid.
  9. Etter dekantering, vortex cellene i leftover væske beholdes i hvert rør.

4. Cell Fixation

  1. Tilsett 250 ul av en 2% paraformaldehyd (PFA) løsning for alle rør for å fiksere cellene.
    FORSIKTIG: PFA er et giftig stoff. Eksponering for selv små mengder kan forårsake symptomer. Håndtere dette stoffet i henhold til de retningslinjer som er angitt av EHS Kontoret ved institusjonen hvor disse eksperimentene blir utført.
    1. Siden 2% PFA oppløsning må være isoton til cellene ved å bruke PBS for å fremstille denne oppløsning. Ett hundre milliliter av en 2% PFA løsning er nok for flere eksperimenter. Grundig vortex alle rørene umiddelbart etter tilsetningen av 2% PFA for å forhindre dannelsen av celleaggregater.
  2. Inkuber i mørke ved 4 ° C i 20 min.
  3. Waske celler ved å gjenta trinn 3,7-3,9. Når dette trinnet er fullført, kan cellene bli lagret i mørke ved 4 ° C i 24-48 timer. Før du går videre til Permeabilization fase, vortex rør grundig.

5. Permeabilization Celler

  1. Legg 500 mL av permeabiliseringsbuffer. Vortex alle rør.
  2. Inkuber i mørke ved romtemperatur i 10 min.
  3. Vask cellene ved å gjenta trinn 3,7-3,9.

6. Intracellulær Farging

  1. Forbered nok mAb mester mix å farge alle eksperimentelle rør.
  2. Juster volumet med PBS eller beis buffer slik at 50 pl av den intracellulære mAb konsentrat-blanding blir tilsatt per test.
  3. Klargjør mAb mester mix beskrevet i 6.1 og 6.2 Bruk titreres mengder mAbs rettet mot CD3 og Gzm B.
    MERK: TCR inngrep med pMHC-I-tetramerer kan resultere i CD3 internalisering, som kan interferere med deteksjonen av tetramer + CD3 + CD8 +T-celler hvis den anti-CD3 mAb tilsatt til overflatefarging konsentrat-blanding. For å unngå dette, legg den anti-CD3 mAb på dette stadiet, det vil si etter at cellene er permeabilized. De fluorokromer konjugert til hvert mAb er oppført som en referanse: CD3 PerCP Cy5.5 og Gzm B PE.
  4. Tilsett 50 mL av mAb cocktail til de tilsvarende rør. Inkuber i mørke ved romtemperatur i 30 min.
  5. Vask cellene ved å gjenta trinn 3,7-3,9. Rørene er klar til å bli kjøpt opp i et strømningscytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen er beskrevet her har blitt brukt for å bestemme størrelsen og hukommelse fenotype av vaksineinduserte, Gag CM9-spesifikke CD8 + T-celleresponser i et Mamu-A1 * 001 + rhesusape. For denne analysen ble en APC-konjugert Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer brukes i en 8-farge flowcytometrisk flekker panel. Figur 1A - F viser gating strategien brukes for å analysere dataene som skal brukes for både tetramers stede i hver test. Legg merke til at pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellepopulasjonen er godt adskilt med minimal bakgrunns (figur 1F og G). Hukommelse CD8 + T-celler i rhesusape kan bli klassifisert som tre undergrupper basert på overflaten ekspresjon av CD28 og CCR7: sentral hukommelse (T CM; CD28 + CCR7 +), overgangs hukommelse (T EM1; CD28 + CCR7-), og effektor minne (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Denne protokollen innbefatter også en celle permeabiliseringen skritt for intracellulær påvisning av Gzm B og CD3. Figur 1G - I viser avgrensningen av hukommelses undergrupper og Gzm B-uttrykkende CD8 + T-celler i tetramer + porten.

Bakgrunnsfarging kan gi suboptimale resultater i pMHC-I tetramer merking analyser. For å unngå dette, er noen forholdsregler foreslått. Som det fremgår av protokollen delen skal ampuller inneholdende de pMHC-I-tetramer reagenser alltid sentrifugeres ved 20.000 x g i minst 15 minutter før fremstilling av master mikser. Målet med dette trinnet er å pellet proteinaggregater som kan være i pMHC-I tetramer løsning. I tillegg titrere hver reagens før bruk er også anbefalt. Ideelt sett MHC-I-matchet celler som gjør eller ikke inneholder Ag spesifikke CD8 + T-cellepopulasjonen av interesse bør være merket med relevant pMHC-I tetramer. dette can oppnås ved farging kryopreservert PBMC fra SIV naive (negativ kontroll) og SIV-infeksjon (positiv kontroll) makaker ved siden av hverandre med forskjellige mengder av en nylig oppnådd pMHC-I tetramer. På figur 2, for eksempel 1,0 mL / test av en APC-konjugert Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer ga den beste separasjonen mellom tetramer positive og negative CD8 + T-celle-populasjoner. Endelig valg av fluorochrome kan også ha betydelig innvirkning på resultatene fra pMHC-I tetramer stainings. I denne forbindelse, pMHC-I tetramerer konjugert til dim-molekyler (for eksempel fluorescein) bør unngås. I vår erfaring, pMHC-I tetramers konjugert til lyse fluorokromer, slik som PE, APC, og BV 421, har gitt de beste resultatene.

Vi har lagt merke til at Mamu-B * 017: 01 tetramers gir vanligvis dim flekker, selv når konjugert til de lyse fluorokromer nevnt ovenfor. Årsakene til dennelav fluorescens intensitet er ikke helt klart, men kan inkludere lav affinitet TCR / Mamu-B * 017: 01 interaksjoner og rask TCR intern på tetramer bindende 36,37. Langs disse linjer, har PKIs blitt vist å inhibere internalisering TCR på overflaten av CD8 + T-celler 32. Som et resultat, kan PKIs forbedre deteksjon av Ag-spesifikke CD8 + T-celler etter pMHC-I tetramer farging. Vi har bekreftet denne effekten i våre eksperimenter, der kvaliteten på Mamu-B * 017: 01 tetramer stainings kan bli vesentlig forbedret ved å forhåndsbehandle PBMC med en PKI (figur 3). Merkelig, forbehandling med dette PKI ikke signifikant bedre farging av andre pMHC-I tetramers testet her (data ikke vist), noe som tyder på at Mamu-B * 017: 01-begrenset CD8 + T-celler kan være unik i sin følsomhet til PKI behandling.

Figur 1
Figur 1: Avblending strategi og representative resultatene av en vellykket pMHC-I tetramer farging. Vi evaluerte størrelsen og minne fenotype av vaksineinduserte Gag CM9 spesifikke CD8 + T-celler i PBMC fra et Mamu-A1 * 001 + rhesusape. Her ble det en APC-konjugert Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer brukes i en 8-farge flowcytometrisk flekker panel. (A - F) gating strategi for flowcytometrisk analyse. Først ble en port på diagonalt gruppert singletter laget ved å plotte forover spredning høyde (FSC-H) versus FSC område (FSC-A) og deretter sidespredningshøyden (SSC-H) versus SSC område (SSC-A; A og B) . Deretter ble en gang gate opprettet som inkluderte bare de hendelsene som ble spilt inn i løpet av de 5 th og 90 th persentiler. De resulterende celler ble deretter separert på "dump kanal" negative, CD3 + celler (C og D). På dette stadiet,lymfocyttpopulasjon ble avgrenset basert på sin FSC-A og SSC-A-egenskaper og senere analyser ble utført i løpet av CD8 + celler (E og F). Etter skisserte pMHC-I tetramer + celler (G), ble utført på minne fenotyping analyse innenfor denne port (H). Rhesusape minne T-celler kan klassifiseres i tre undergrupper basert på ekspresjon av CD28 og CCR7: sentral hukommelse (T CM; CD28 + CCR7 +), overgangs hukommelse (T EM1; CD28 + CCR7-), og effektor hukommelse (T EM2 ; CD28-CCR7-). Denne protokoll omfatter også en celle permeabiliseringen trinn for den intracellulære evaluering av granzyme B (Gzm B) ekspresjon i tetramer + CD8 + T-celler (I). Det skraverte området i histogrammet tilsvarer tetramer + CD8 + T-celler farget med en isotype-matchet kontrollgruppe mAb. Selv om BV 421-konjugert tetramer + populasjonen som var til stede i denne farging erikke er vist på figuren, skal det samme portstyringsstrategien brukes til å analysere den. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Representative resultatene av titrering av en APC-konjugert Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer. PBMC fra to Mamu-B * 008: 01+ rhesusape ble anvendt for dette forsøk: ett dyr ble SIV naive og tjente som den negative kontroll, mens den andre var SIV-infeksjon og tjente som positiv kontroll. For å bestemme mengden av Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer som gir den beste separasjonen mellom tetramer + og tetramer- CD8 + T-celler, PBMC fra hvert dyr ble inkubert med de angitte mengder av de pMHC-I tetramer reagens. Basert på disse resultatene, 1,0 mL / test was valgt som den optimale mengde som skal anvendes i fremtidige analyser. Portstyringsstrategi anvendt for å analysere dataene er beskrevet i figur 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Effekt av PKI-behandling på fluorescensintensiteten av Mamu-B * 017: 01 tetramers. PKI-inhibitor inhiberer internalisering av TCR-komplekser og derved forbedrer deteksjon av Ag-spesifikke CD8 + T-celler av fluorkrom-merket pMHC-I tetramers 32. (A - B) PBMC fra to-B Mamu * 017: 01+ rhesusape ble brukt i dette eksperimentet: en ape var SIV naive og tjente som negativ kontroll (A), mens den andre ble infisert med SIV og fungerte somden positive kontroll (B). PBMC fra begge dyr ble inkubert ved 37 ° C i nærvær av PKI ved en konsentrasjon på 50 nM i 30 minutter før farging med en APC-konjugert Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetramer, som beskrevet i protokollen seksjon . Som en referanse, ble et annet sett med rør utsatt for de samme inkuberingsbetingelser og fargingsbetingelser, bortsett fra at dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt i stedet for PKI. Portstyringsstrategi anvendt for å analysere dataene er beskrevet i figur 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td> Mamu-A1 * 002: 01
SIV protein Aminosyreposisjon Amino Acid Sequence MHC klasse I Molecule (ny nomenklatur) MHC klasse I Molecule (gammel nomenklature) Epitop Short Name
Brekke seg 181-189 CTPYDINQM Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 Gag CM9
Brekke seg 254-262 QNPIPVGNI Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 Gag QI9
Brekke seg 72-79 GSENLKSLY Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 Gag GY9
env 830-838 FHEAVQAVW Mamu-B * 017: 01 Mamu-B * 17 env FW9
env 233-241 CAPPGYALL Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 env CL9
env 620-628 TVPWPNASL Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 env TL9
env 788-795 RTLLSRVY Mamu-A1 * 002: 01 Mamu-A * 02 env RY8
env 296-304 RTIISLNKY Mamu-A1 * 002: 01 Mamu-A * 02 env RY9
Vif 123-131 RRAIRGEQL Mamu-B * 008: 01 Mamu-B * 08 Vif RL9
Vif 173-181 RRDNRRGL Mamu-B * 008: 01 Mamu-B * 08 Vif RL8
Vif 66-73 HLEVQGYW Mamu-B * 017: 01 Mamu-B * 17 Vif HW8
Vif 100-109 VTPNYADILL Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 Vif VL10
Vif 97-104 WTDVTPNY Mamu-A1 * 002: 01 Mamu-A * 02 Vif WY8
Rev 13-22 KRLRLIHLL Mamu-B * 008: 01 Mamu-B * 08 Rev KL9
tat 28-35 STPESAML Mamu-A1 * 001 Mamu-A * 01 tat SL8
Nef 137-146 RRHRILDIYL Mamu-B * 008: 01 Mamu-B * 08 Nef RL10
Nef 246-254 RRLTARGLL Mamu-B * 008: 01 Mamu-B * 08 Nef RL9b
Nef 8-16 RRSRPSGDL Mamu-B * 008: 01 Mamu-B * 08 Nef RL9a
Nef 165-173 IRYPKTFGW Mamu-B * 017: 01 Mamu-B * 17 Nef IW9
Nef 195-203 MHPAQTSQW Mamu-B * 017: 01 Mamu-B * 17 Nef MW9
Nef 159-167 YTSGPGIRY Mamu-A * 02 Nef YY9

Tabell 1: Liste over pMHC-I-tetramerer er tilgjengelige for overvåkning av SIV-spesifikke CD8 + T-celleresponser i rhesusape.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Noen få skritt i denne prosedyren fortjeneste diskusjonen som de er avgjørende for ettergivende optimale resultater. Først, siden kvaliteten av de biologiske prøver er en sterk prediktor for suksess for enhver flowcytometrisk analyse 38, alt forsiktighet må utvises for å sikre at cellene er levedyktige og i suspensjon i løpet av fargeprosedyre. Dette er særlig aktuelt når man arbeider med cryopreserved prøvene siden de er mer tilbøyelig til klumpdannelse og inneholder typisk høyere antall døde celler. I disse tilfellene, passerer cellesuspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil før den pMHC-I tetramer merkningsmetode kan vesentlig forbedre resultatene. For det andre er riktig kompensasjon av fluorokromer som anvendes i analysen kritisk for nøyaktig analyse av dataene, særlig når flere parametre blir evaluert i det samme eksperiment. I dette henseende, er det anbefalt at frisk ensfarget kompensasjons kontroller fremstilles for hver pMHC-I tetramer sholde analysen. Vi foretrekker bruken av kompensasjons kuler på grunn av deres brede anti-Ig-reaktivitet og det faktum at de gir klare bimodale fordelinger av positive og negative populasjoner. Siden disse perlene ikke bindes til MHC-I-molekyler, antistoffer konjugert til de samme fluorophores som de pMHC-I tetramers (f.eks APC og BV 421) bør brukes som kompensasjon kontroller. Flere av slike kompensasjons perler er tilgjengelige fra flere leverandører, og bør brukes i henhold til produsentens instruksjoner. For det tredje, siden fenotyping strategien som er beskrevet her krever avgrensning av CD8 + T-celleundermengder basert på den graderte ekspresjon av tre molekyler (dvs. CD28, CCR7, og Gzm B), gating kontroller, slik som fluorescens minus en (FMO) tester eller isotype-matchet antistoffer, bør anvendes for å lette slike analyser. I våre forsøk, for eksempel, separate rør inneholdende pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellepopulasjonen av interesse enre alltid farget med isotype kontroll mAbs konjugert til samme fluorokromer som de mAbs mot CD28, CCR7, og Gzm B. Viktigere, selv om de nevnte retningslinjene kan bidra til å forbedre den generelle kvaliteten på pMHC-I tetramerfritt stainings, de er ikke de eneste variablene som kan påvirke ytelsen til denne analysen. Tatt i betraktning det unike i hvert laboratorium setting, bør hele arbeidsflyten beskrevet her utføres minst en gang om modellprøver for å tillate praksis og relevante justeringer.

Merkelig, pMHC-I tetramer positive CD8 + T-celler er tidvis observert i PBMC fra SIV naive (friske og uvaksinerte) rhesusape. Disse tilfellene ser ikke ut til å være et resultat av bakgrunnsfarging basert på visuell inspeksjon av dataene. I stedet kan de gjenspeile interaksjoner mellom pMHC-I-molekyler og spekk immunoglobulin-lignende reseptorer (kirs) uttrykt på overflaten av rhesusape NK og CD8 + T-cellene 39,40. Faktisk Mamu-A1 * 002: 01 tetramerer foldede med peptider som svarer til de Gag GY9 og Env RY8 epitoper har blitt vist å binde seg til Mamu-KIRDL05 39. Langs disse linjene, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 og Mamu-A1 * 002: 01 / konvolutt RY8 er mer tilbøyelige til å stille den Ag-uavhengig pMHC-I tetramer farging beskrevet ovenfor. Gitt dette fenomenet, er det viktig å kontrollere for dette referanse reaktivitet i ape forsøk med langsgående vurderinger av SIV-spesifikke CD8 + T-celle-responser etter infeksjon eller vaksinasjon. For å oppnå dette, er det tilrådelig å utføre pMHC-I tetramer flekker på prøver tatt på den første dagen av behandlingen. Det kan også være aktuelt å fryse PBMC i flere små-size porsjoner på disse innledende tidspunkter i tilfelle sammenligninger med baseline prøvene er nødvendig i fremtidige eksperimenter.

En begrensning av pMHC-I tetramer farging er at det bare er CD8 + T-celler av kjent spesifisitet og MHC-I-restriksjons cen studeres på denne måte. Dette er spesielt relevant i rhesusape gitt den komplekse organiseringen av deres MHC loci. Faktisk kan en enkelt rhesusape haplotype har mange av MHC-I gener, ikke alle som koder for molekyler som er stabilt uttrykt på celleoverflaten 29. Som et resultat, kan det være vanskelig å bestemme settet av funksjonelle MHC-I molekyler uttrykt ved et gitt dyr. Likevel kan dette forbeholdet overvinnes ved å designe eksperimenter som omfatter aper som er positive for kjente MHC-I alleler, slik som Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, og Mamu- B * 017: 01.

Som konklusjon, gir dette manuskriptet en optimalisert pMHC-I tetramer farging protokoll for å bestemme frekvensen og hukommelse fenotype av SIV-spesifikke CD8 + T-celler i rhesusape. Siden pMHC-I tetramer farging er mer følsom enn IFN-γ ELISPOT og ICS-assays for påvisning av Ag-spesifikke CD8+ T-celler og ikke krever in vitro stimulering Ag, metodikken som presenteres her er spesielt nyttige for å studere virkningen av CD8 + T-celleresponser i utfallet av immunsviktvirusinfeksjon. Den praktiske kunnskapen fra å mestre denne teknikken kan også være nyttig for berikende Ag-spesifikke CD8 + T-celler som en del av funksjonelle studier og for overvåking av CD8 + T-celle responser i ulike sykdoms innstillinger 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke David Watkins for å støtte forsøkene som gjorde det mulig optimalisering av dagens metodikk. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet delvis av en pilot stipend gitt av Miami Senter for AIDS forskning av National Institutes of Health i henhold award nummer P30AI073961. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dasatinib Axon medchem Axon 1392 Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C
RPMI w/ Glutamax gibco/ Life Technologies 61870-036 Must be stored at 4 °C 
Heat Inactivated FBS gibco/ Life Technologies 10082-147 Must be stored at 4 °C 
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B Lonza 17-745E Must be stored at 4 °C 
DMSO, Anhydrous Life Technologies D12345 Store at room temperature.
5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes VWR 60819-728
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers NIH Tetramer Core or MBL, Inc. Must be stored and maintained at  4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.
Fluorochrome-conjugated mAbs Various companies Must be stored and maintained at  4 °C. Do not freeze.
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies l34957 Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use.
Brilliant Stain Buffer BD Biosciences 563794 Must be stored at  4 °C 
Phosphate Buffered Saline VWR 97064-158 Store at room temperature
Albumine Bovine VWR 700011-230 Must be stored at  4 °C 
Sodium Azide VWR 97064-646 Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.
Bleach VWR 89501-620 Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care
Polysorbate 20 (Tween-20) Alfa Aesar L15029 Store at room temperature
Permeabilization Solution 2  BD Biosciences 340973 Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top VWR 72.692.005
2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes Eppendorf 22431048 The use of Sterile microtubes is preffered 
Vortex mixer To discretion of scientist
Biosafety Cabinet  To discretion of scientist
Milli Q Intergral Water Purification system EMD Millipore ZRXQ010WW Molecular Biology grade water from any provider may be used
Microcentrifuge To discretion of scientist
Centrifuge To discretion of scientist
4 °C  refrigerator To discretion of scientist
BD LSR II BD Biosciences Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Deionized water
Aluminum Foil VWR SCIENTIFIC INC. 89068-738
Incubator Must be able to maintain 37 °C  internal temperature
FACS Diva software BD Biosciences
Flowjo software version 9.6 Flowjo Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software
Micropippette tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
  4. Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
  5. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  7. Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  8. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
  9. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
  10. Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
  11. Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
  12. Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
  13. Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
  14. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
  15. Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
  16. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
  17. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
  18. Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
  19. Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
  20. Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
  21. Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
  22. Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
  23. Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
  24. Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
  25. Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
  26. Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
  27. Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
  28. Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
  29. Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
  30. Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
  31. Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
  32. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  33. Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
  34. Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
  35. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  36. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  37. Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  38. Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
  39. Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
  40. Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).

Tags

Immunologi MHC tetramer vaksine SIV rhesus macaque
Analyse av Simian Immunodeficiency Virus-spesifikke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i rhesusape av Peptide-MHC-I Tetramer Farging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A.,… More

Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A., Ricciardi, M., Gutman, M. J., Maxwell, H. S., Pedreño-Lopez, N., Bailey, V., Magnani, D. M., Martins, M. A. Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining. J. Vis. Exp. (118), e54881, doi:10.3791/54881 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter