Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione e la caratterizzazione di cellule macaco rhesus T CD8 + contro il virus dell'AIDS. Questo articolo è utile non solo al campo della immunologia HIV, ma anche ad altri settori della ricerca biomedica cui sono note le risposte delle cellule T CD8 + influenzare l'esito della malattia.
Abstract
Istocompatibilità di classe complesso Peptide-major I (pMHC-I) tetrameri sono state uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T CD8 +. Poiché questi reagenti si legano direttamente ai recettori delle cellule T sulla superficie delle cellule CD8 + linfociti T, tetrameri fluorocromi marcato pMHC-I consentono il rilevamento accurato di antigene (Ag) + SPECIFICI CD8 T-cellule senza la necessità di re in vitro -stimolazione. Inoltre, se combinato con multicolore citometria a flusso, pMHC-I tetramero colorazione può rivelare aspetti chiave di Ag-specifici CD8 + T-cellule, tra cui fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione. Questi tipi di analisi sono stati particolarmente utile nel campo della immunologia HIV dove CD8 + T-cellule possono influenzare la progressione in AIDS. infezione sperimentale di macachi rhesus con virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) fornisce uno strumento prezioso per studiare l'immunità cellulare contro il virus dell'AIDS. Come risultato, notevole progress è stato fatto nel definire e caratterizzare le risposte delle cellule T in questo modello animale. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione SIV-specifica CD8 + T-cellule in macachi Rhesus di pMHC-I tetramero colorazione. Il nostro test permette la simultanea quantificazione e la memoria fenotipizzazione di due popolazioni CD8 + pMHC-I tetramero + T-cellule per test, che potrebbe essere utile per il monitoraggio SIV-specifiche risposte delle cellule T CD8 + generati dalla vaccinazione o infezione SIV. Considerando la rilevanza di primati non umani nella ricerca biomedica, questa metodologia è applicabile per studiare le risposte delle cellule T CD8 + in più impostazioni di malattia.
Introduction
CD8 + T-cellule comprendono una componente fondamentale del sistema immunitario adattativo, come partecipano tumore sorveglianza immunitaria e contribuire alla eradicazione di patogeni intracellulari 1. In termini semplici, CD8 + T-cellule esprimono i recettori delle cellule T (TCR), che riconoscono specificamente di istocompatibilità di classe complessi peptide-major I (pMHC-I) molecole presenti sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti. Poiché questi peptidi sono derivati dalla proteolisi di proteine sintetizzate endogeno, pMHC-I superficie cellulare complessi forniscono una finestra nell'ambiente intracellulare. Al momento l'infezione da virus, per esempio, le cellule infettate mostrerà molecole MHC-I contenenti peptidi del virus di derivazione che possono servire come leganti per TCR espresse da pattugliamento CD8 + T-cellule. Nel caso in cui un CD8 + cellule T specifiche per il virus incontra una cellula infetta presentando il suo ligando pMHC-I, TCR impegno si tradurrà in attivazione + cellule T CD8 e ultinell'intervallo portare a destinazione la lisi cellulare. Data la natura critica di queste interazioni TCR / pMHC-I, che determina la grandezza, la specificità, e fenotipo di rispondere CD8 + T-cellule possono spesso rivelare importanti indizi circa le malattie umane.
Fino ai primi anni 1990, la quantificazione di Ag-specifici CD8 + T-cellule invocato il saggio tecnicamente impegnativo diluizione limite (LDA) 2,3. Non solo la LDA ha richiesto diversi giorni per essere completato, ma anche omesso di rilevare le cellule che mancava potenziale proliferativo. Come risultato, la LDA notevolmente sottovalutato la frequenza effettiva di antigene (Ag) specifico d'CD8 + T-cellule che partecipano a una risposta immunitaria. Sebbene lo sviluppo di ELISPOT e dosaggi di citochine colorazione intracellulare notevolmente migliorato la capacità di misurare l'immunità cellulare, questi metodi ancora necessari a stimolazione in vitro per la quantificazione Ag-specifiche cellule T 4. Non è stato fino al 1996 che Altman, Davis, e Colleagues pubblicato il loro punto di riferimento articolo segnalato la sviluppo della tecnologia tetramero pMHC-I 5. Fondamentale per il successo di questa tecnica è stata la multimerizzazione delle molecole pMHC-I, che si estendevano l'emivita delle interazioni TCR / pMHC-I, riducendo così la probabilità di tetrameri pMHC-I cadono fuori durante le fasi di lavaggio dei dosaggi di citometria a flusso. Il vantaggio principale di tetrameri pMHC-I sopra i saggi suddetti è la capacità di rilevare con precisione Ag-specifica CD8 + T-cellule direttamente ex vivo senza la necessità di in vitro ri-stimolazione. Inoltre, la combinazione di pMHC-I tetramero colorazione con multicolore citometria a flusso ha consentito analisi dettagliate della fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione di Ag-specifici CD8 + T-cellule 2-4. Alla luce dei recenti progressi tecnici per la caratterizzazione repertori + CD8 T-cellule da pMHC-I Multimer colorazione 6, l'ampiezza di applicazioni FOR questa metodologia è destinata a continuare in espansione.
Poche zone nella ricerca biomedica hanno beneficiato di più dal pMHC-I tetramero colorazione di campo dell'HIV dell'immunologia 7. Anche se CD8 + T-cellule erano state temporalmente associato al controllo iniziale di viremia HIV dal momento della pubblicazione da Altman, Davis, e colleghi hanno 8,9, l'uso di tetrameri pMHC-I, negli anni successivi notevolmente ampliato la nostra comprensione di HIV-specifica CD8 + risposta T-cellulare. Ad esempio, pMHC-I tetramero colorazione aiutato confermare la dimensione robusta di risposte delle cellule T virus-specifici CD8 + nella maggior parte delle persone con infezione da HIV 10-12. Questa metodologia anche facilitato la caratterizzazione di HIV e SIV-specifici + risposte delle cellule T CD8 limitato da molecole MHC-I associate al controllo spontaneo della replicazione virale in assenza di terapia antiretrovirale, un fenomeno noto come "controllo elite"
Sperimentale infezione SIV di macachi Rhesus (Macaca mulatta) rimane il migliore modello animale per la valutazione degli interventi del sistema immunitario contro l'HIV / AIDS 18,19. Negli ultimi 25 anni, sono stati compiuti notevoli progressi nella identificazione e caratterizzazione di SIV-specifica CD8 + T-cellule in questa specie di scimmie, tra cui la scoperta di alleli MHC-I e la definizione di binding peptide motivi 13,20-27 . Come risultato, pMHC-I tetrameri sono stati sviluppati per l'analisi di SIV-specifica CD8 + T-cellulerisposte in questo modello animale 28. La maggior parte di questi reagenti sono realizzati i prodotti genici di quattro macaco rhesus alleli MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. Da segnalare, macachi Rhesus non esprimono un MHC-C locus 29. La stragrande maggioranza dei tetrameri pMHC-ho utilizzato nelle attuali esperimenti sono stati prodotti presso l'impianto di NIH Tetramero core alla Emory University. Tuttavia, alcuni di questi reagenti, compresi Mamu-A1 * 001 tetrameri legati alla immunodominante epitopo Gag CM9, può essere ottenuto solo da fonti commerciali a causa di accordi di licenza. Uso tetrameri pMHC-I dei quattro alleli macaco rhesus elencati sopra abbiamo elencato con successo CD8 + T-cellule contro un totale di 21 epitopi SIV (Tabella 1), che sono stati indotta dalla vaccinazione o infezione primaria SIV 30,31 (Martins et al., osservazioni non pubblicate).
Il presente manoscritto fornisce unaottimizzato protocollo tetramero colorazione pMHC-I per determinare il fenotipo frequenza e la memoria di SIV-specifici CD8 + cellule T nei macachi rhesus. Il test inizia con un elettivo 30 min di incubazione con un inibitore della proteina chinasi (PKI, qui, Dasatinib è utilizzato) al fine di diminuire TCR internalizzazione e quindi migliorare pMHC-I tetramero colorazione 32. Come descritto di seguito, questo trattamento è particolarmente utile quando si utilizza Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Sono inoltre disponibili le istruzioni su come etichettare le cellule con tetrameri pMHC-I coniugato a un fluorocromo e anticorpi monoclonali (MAK, MAB). Questo protocollo include anche un passo permeabilizzazione cella per la rilevazione intracellulare della citolisi associata molecola granzyme B (GZM B). Il mAb contro CD3 viene aggiunto in questa fase anche per migliorare la rilevazione di questa molecola di segnalazione TCR. Come riferimento, vengono elencati tutti i fluorocromi impiegati in questo pannello colorazione.
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Protocol
I campioni periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) utilizzati in questo manoscritto sono stati ottenuti da macachi Rhesus indiani alloggiati presso la Wisconsin Nazionale Primate Research Center. Questi animali sono stati curati secondo la relazione Weatherall sotto un protocollo approvato dalla University of Wisconsin Graduate School cura degli animali e del Comitato Usa 33. Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in anestesia e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il potenziale sofferenza.
1. Il trattamento PKI
NOTA: Questo è opzionale, ma consigliato per Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Vedi i Risultati e discussione sezioni.
- Risospendere PBMC in terreno R10 ad una concentrazione di 1,6 x 10 7 cellule / ml.
- Aggiungere 50 ml di questa sospensione cellulare al corrispondente citometria a flusso tubi. Aggiungere 50 ml di una soluzione 100 nM di PKI in ogni provetta.
- Vortex ogni provetta. Incubare a 37 ° C per 30 min. Alla fine di questopasso, ogni tubo deve avere 100 ml di una sospensione cellulare contenente 8,0 x 10 5 PBMC e 50 Nm di PKI.
- Procedere al passaggio pMHC-I tetramero colorazione.
2. La colorazione con fluorocromo etichettati pMHC-I Tetrameri
- Prima di preparare la pMHC-I tetramero master mix, centrifugare le provette tetramero pMHC-I a 20.000 xg per almeno 15 minuti a 4 ° C. L'obiettivo di questa fase è quello di pellet aggregati proteici nella soluzione tetramero pMHC-I che può aumentare la colorazione di fondo. Terminata la fase di centrifugazione è fatto, evitare di pipettaggio dal fondo del tubo, dove si sono accumulati gli aggregati proteici.
- Preparare abbastanza master mix tetramero pMHC-I a macchiare tutte le provette sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questo master mix per tenere conto di errori pipettaggio.
- Diluire pMHC-I tetrameri nel buffer di macchia (ad esempio, Brilliant Stain Buffer) in modo che 25 ml di pMHC-I tetramero master mix sono Added per ogni test.
- Etichetta PBMC con due tetrameri pMHC-I per test; una coniugata allophycocyanin (APC) e l'altra a Brilliant Violet (BV) 421.
- Aggiungere 8,0 x 10 5 PBMC al corrispondente citometria a flusso tubi in un volume finale di 100 microlitri. Se le cellule sono state sottoposte a trattamento PKI sopra descritto, essi dovrebbero essere già risospese in 100 pl in questa fase.
- Aggiungere 25 ml di pMHC-I tetramero master mix alla corrispondente citometria a flusso tubi. Alla fine di questa fase, il volume finale in ciascun tubo dovrebbe essere 125 microlitri.
- Agitare ogni provetta per omogeneizzare la sospensione cellulare.
- Incubare al buio a temperatura ambiente per 45 min. Preparare il cocktail superficie di colorazione mAb durante questo 45 min di incubazione.
La colorazione 3. Surface
- Preparare abbastanza master mix mAb a macchiare tutte le provette sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale della master mix per spiegareper l'errore pipettaggio.
- Regolare il volume del master mix con tampone macchia in modo che 50 microlitri sono aggiunti per test.
- Per una corretta esclusione dei non-CD8 + T-cellule e la delineazione di sottoinsiemi di memoria, uso titolato quantità di anticorpi monoclonali diretti contro le seguenti molecole del master mix superficie di colorazione.
NOTA: I fluorocromi coniugati a ciascun anticorpi monoclonali sono forniti come riferimento: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7, e CCR7 FITC. Si noti che i anticorpi monoclonali contro CD14, CD16, CD20 e sono coniugati allo stesso fluorocromo (vale a dire, BV 510) dal momento che verranno inclusi nella porta "dump". - Includere un colorante risolvibile per discriminare le cellule morte nel master mix superficie di colorazione [cioè, tintura reattiva ammina (ARD)]. Assicurarsi che il reagente ARD è coniugato ad un fluorocromo con uno spettro di emissione simile a quelli utilizzati nel cancello "dump". In questo caso, utilizzare ARD Aqua.
- Aggiungere 50 ml diil master mix colorazione descritto nella 3,1-3,4 al corrispondente citometria a flusso tubi. Alla fine di questa fase, il volume finale in ciascun tubo dovrebbe essere 175 microlitri.
- Vortex ogni provetta. Incubare al buio a temperatura ambiente per 25 min.
- Lavare le cellule con tampone di lavaggio (soluzione PBS contenente 0,1% di albumina sierica bovina e 0,45 g / L NaN 3).
ATTENZIONE: Sodio azide è una sostanza tossica. L'esposizione a anche piccole quantità può causare sintomi. Maneggiare questa sostanza secondo le linee guida indicate dal salute ambientale e Ufficio Sicurezza (EHS) presso l'istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti. - Tubi centrifugare a 510 xg per 5 min. decantare con attenzione il surnatante in un contenitore dei rifiuti. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
ATTENZIONE: non decantare il tampone di lavaggio surnatante in serbatoi contenenti candeggina in quanto si può reagire con l'azide di sodio presente nel tampone di lavaggio e causare la formazione di un gas tossico 34. Contact l'Ufficio EHS presso l'istituto in cui questi esperimenti sono in corso di esecuzione per le linee guida su come smaltire sodio azide. - Dopo decantazione, vortice le cellule nel liquido rimasto trattenuto in ciascun tubo.
4. cellulare Fixation
- Aggiungere 250 ml di una soluzione al 2% paraformaldeide (PFA) a tutte le provette per fissare le cellule.
ATTENZIONE: PFA è una sostanza tossica. L'esposizione a anche piccole quantità può causare sintomi. Maneggiare questa sostanza secondo le linee guida indicate dall'Ufficio EHS presso l'istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti.- Poiché la soluzione PFA 2% deve essere isotonica alle cellule, utilizzare PBS preparare questa soluzione. Cento millilitri di una soluzione PFA 2% è sufficiente per esperimenti multipli. Accuratamente vortice tutte le provette immediatamente dopo l'aggiunta del 2% PFA per evitare la formazione di aggregati di cellule.
- Incubare al buio a 4 ° C per 20 min.
- Wcellule cenere di ripetendo i passaggi 3,7-3,9. Una volta che questo passaggio è completato, le cellule possono essere conservate al buio a 4 ° C per 24-48 ore. Prima di procedere alla fase di permeabilizzazione, vortice a fondo i tubi.
5. permeabilizzazione delle cellule
- Aggiungere 500 ml di tampone permeabilizzazione. Vortex tutte le provette.
- Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min.
- Lavare le cellule ripetendo i punti 3.7-3.9.
6. intracellulare colorazione
- Preparare abbastanza master mix mAb a macchiare tutte le provette sperimentali.
- Regolare il volume con PBS o buffer di macchia in modo che si aggiungono 50 ml di intracellulare master mix mAb per test.
- Preparare la master mix mAb indicato al paragrafo 6.1 e 6.2 Uso titolata quantità di anticorpi monoclonali diretti contro CD3 e GZM B.
NOTA: l'impegno TCR da tetrameri pMHC-I può provocare CD3 internalizzazione, che possono interferire con il rilevamento di tetramero + CD3 + CD8 +Cellule T se l'anti-CD3 mAb è aggiunto al master mix superficie di colorazione. Per evitare questo, aggiungere l'anti-CD3 mAb, in questa fase, che è, dopo le cellule vengono permeabilizzate. I fluorocromi coniugati ad ogni mAb sono elencati come riferimento: CD3 PerCP Cy5.5 e GZM B PE. - Aggiungere 50 ml di mAb cocktail ai tubi corrispondenti. Incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Lavare le cellule ripetendo i punti 3.7-3.9. I tubi sono pronti per essere acquisita in un citometro a flusso.
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Representative Results
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per determinare l'ampiezza e la memoria fenotipo di vaccino-indotta, Gag CM9-specifiche risposte delle cellule T CD8 + in un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Per questa analisi, un APC-coniugato tetramero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 è stato utilizzato in un pannello colorazione citometria a flusso a 8 colori. Figura 1A - F mostra la strategia di gating utilizzato per analizzare i dati, che dovrebbero essere applicate per entrambi i tetrameri presenti in ciascuna prova. Si noti che il tetramero pMHC-I + CD8 popolazione di cellule T + è ben separata con sfondo minima (figure 1F e G). + Memoria CD8 T-cellule in macachi Rhesus possono essere classificate come tre sottogruppi in base alla superficie espressione di CD28 e CCR7: memoria centrale (T CM; CD28 + CCR7 +), la memoria di transizione (T EM1; CD28 + CCR7-), e effettori memoria (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Questo protocollo include anche un passo permeabilizzazione delle cellule per la rilevazione intracellulare di GZM B e CD3. Figura 1G - mi mostra la delineazione di sottoinsiemi di memoria e GZM B-esprimono CD8 + T-cellule all'interno del tetramero + cancello.
Colorazione di fondo può produrre risultati non ottimali in pMHC-I saggi di etichettatura tetramero. Per evitare questo, si suggerisce alcune precauzioni. Come indicato nella sezione del protocollo, i flaconi contenenti i reagenti tetramero pMHC-I devono essere sempre centrifugati a 20.000 xg per almeno 15 minuti prima della preparazione dei Master Mix. L'obiettivo di questa fase è quello di sedimentare eventuali aggregati proteici che possono essere nella soluzione tetramero pMHC-I. Inoltre, è anche raccomandato titolante ciascun reagente prima dell'uso. Idealmente, le cellule che fanno o non contengono la popolazione Ag-specifica + CD8 T-cellule di interesse deve essere etichettato con il relativo tetramero pMHC-I MHC-I-abbinato. Questo can essere realizzato mediante colorazione crioconservati PBMC da SIV ingenuo (controllo negativo) e SIV-infettati lato (controlli positivi) macachi a fianco con varie quantità di un pMHC-I tetramero appena ottenuto. In figura 2, per esempio, 1,0 ml / test di APC-coniugato Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramero prodotto la migliore separazione tra tetramero CD8 + popolazioni di cellule T positivi e negativi. Infine la scelta del fluorocromo può anche influenzare significativamente i risultati ottenuti da pMHC-I colorazioni tetramero. A questo proposito, pMHC-I tetrameri coniugati dim molecole (ad esempio, fluoresceina) deve essere evitata. Nella nostra esperienza, pMHC-I tetrameri coniugati a fluorocromi luminosi, come il PE, APC, e BV 421, hanno dato i migliori risultati.
Abbiamo notato che Mamu-B * 017: 01 tetrameri tipicamente producono colorazione debole, anche se coniugato con fluorocromi luminosi di cui sopra. Le ragioni di questobassa intensità di fluorescenza non sono del tutto chiare, ma potrebbe includere bassa affinità TCR / Mamu-B * 017: 01 interazioni e rapida internalizzazione TCR dal legame tetramero 36,37. Lungo queste linee, le PKI hanno dimostrato di inibire la TCR internalizzazione sulla superficie CD8 + T-cellule 32. Come risultato, le PKI può migliorare il rilevamento di Ag-specifici + CD8 cellule T di pMHC-I tetramero colorazione. Abbiamo confermato questo effetto nei nostri esperimenti, in cui la qualità di Mamu-B * 017: 01 tetramero colorazioni possono essere notevolmente migliorate mediante pretrattamento PBMC con una PKI (Figura 3). Curiosamente, pre-trattamento con questo PKI non ha migliorato in modo significativo la colorazione di altri tetrameri pMHC-I qui testati (dati non riportati), suggerendo che Mamu-B * 017: 01-ristrette CD8 + T-cellule potrebbero essere unici nel loro sensibilità al trattamento PKI.
Figura 1: strategia di gating e risultati rappresentativi di un successo pMHC-I tetramero colorazione. Abbiamo valutato l'entità e la memoria fenotipo di Gag CM9-specifici CD8 + T-cellule indotti dal vaccino in PBMC da un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Qui, un APC-coniugato tetramero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 è stato utilizzato in un pannello colorazione citometria a flusso a 8 colori. (A - F) strategia di gating per l'analisi di citometria di flusso. In primo luogo, un cancello sul canottiere diagonale cluster è stato creato tracciando avanti altezza scatter (FSC-H) rispetto zona FSC (FSC-A) e quindi altezza laterale scatter (SSC-H) rispetto zona SSC (SSC-A, A e B) . Successivamente, un cancello di tempo è stato creato che comprendeva solo gli eventi che sono stati registrati entro il 5 ° e il 90 ° percentile. Le cellule ottenute sono state poi gate sulla "channel dump" CD3 + cellule negative, (C e D). In questa fase, lapopolazione linfocitaria è stato delineato in base alla sua proprietà SSC-A FSC-A e e le successive analisi sono state condotte all'interno delle cellule CD8 + (E e F). Dopo aver delineato pMHC-I tetramero + cellule (G), l'analisi fenotipizzazione memoria è stata eseguita entro questa porta (H). T-celle di memoria macaco Rhesus possono essere classificati in tre sottogruppi in base alla espressione di CD28 e CCR7: memoria centrale (T CM; CD28 + CCR7 +), la memoria di transizione (T EM1; CD28 + CCR7-), e la memoria effettrici (T EM2 ; CD28-CCR7-). Il presente protocollo include anche un passo permeabilizzazione delle cellule per la valutazione intracellulare di Granzyme B (GZM B) espressione all'interno di cellule T CD8 + (I) tetramero +. L'area ombreggiata nell'istogramma corrisponde a tetramero + CD8 + T-cellule colorato con un mAb controllo isotipico corrispondenza. Anche se il tetramero BV 421-coniugato + popolazione che era presente in questa colorazione ènon mostrato in figura, la stessa strategia di gating deve essere utilizzato per analizzare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I risultati rappresentativi della titolazione di un APC-coniugato Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramero. PBMC da due Mamu-B * 008: 01+ macachi Rhesus sono stati utilizzati per questo esperimento: un animale è stato SIV ingenuo e servito come il controllo negativo, mentre l'altro era SIV-infetti e servito come il controllo positivo. Per determinare la quantità di Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramero che produce la migliore separazione tra tetramero + e tetramer- cellule T CD8 +, PBMC da ogni animale sono stati incubati con gli importi indicati di reagente tetramero pMHC-I. Sulla base di questi risultati, 1,0 ml / test was scelto come la quantità ottimale da utilizzare in saggi futuri. La strategia di gating utilizzata per analizzare i dati è descritto in Figura 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti del trattamento PKI sulla intensità di fluorescenza di Mamu-B * 017: 01 tetrameri. L'inibitore PKI inibisce l'internalizzazione dei complessi TCR e quindi migliora il rilevamento di Ag-specifica + CD8 T-cellule da fluorocromo marcato pMHC-I tetrameri 32. (A - B) PBMC da due Mamu-B * 017: 01+ macachi Rhesus sono stati utilizzati in questo esperimento: una scimmia era SIV ingenuo e servito come il controllo negativo (A), mentre l'altro è stato infettato da SIV e servito comeil controllo positivo (B). PBMC da entrambi gli animali sono state incubate a 37 ° C in presenza di PKI ad una concentrazione di 50 nM per 30 minuti prima della colorazione con un APC-coniugato Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetramero, come descritto nella sezione Protocollo . Come riferimento, un altro set di tubi è stato sottoposto alle stesse condizioni di incubazione e di colorazione, salvo che dimetilsolfossido (DMSO) è stato aggiunto anziché PKI. La strategia di gating utilizzata per analizzare i dati è descritto in Figura 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| proteine SIV | Posizione aminoacidica | Amino Acid Sequence | MHC di classe I della molecola (nuova nomenclatura) | MHC di classe I della molecola (vecchio Nomenclaturae) | Nome epitopi breve |
| Bavaglio | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| Bavaglio | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| Bavaglio | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| Env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Env FW9 |
| Env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Env CL9 |
| Env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Env TL9 |
| Env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Env RY8 |
| Env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Vif WY8 |
| Rev | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tabella 1: Elenco dei pMHC-I tetrameri disponibili per il monitoraggio SIV-specifiche risposte delle cellule T CD8 + nei macachi rhesus.
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Discussion
A pochi passi in questa discussione di merito procedura in quanto sono cruciali per cedere risultati ottimali. Innanzitutto, poiché la qualità dei campioni biologici è un forte predittore del successo di qualsiasi citometria a flusso 38, tutto occorre prestare attenzione a garantire che le cellule sono vitali e in sospensione durante la procedura di colorazione. Questo è particolarmente importante quando si lavora con campioni crioconservati poiché sono più inclini a formazione di grumi e contengono tipicamente un numero maggiore di cellule morte. In questi casi, passando la sospensione cellulare attraverso un filtro cella 70 micron prima della procedura pMHC-I etichettatura tetramero potrebbe migliorare notevolmente i risultati. In secondo luogo, una corretta remunerazione degli fluorocromi impiegati nel test è fondamentale per l'analisi dei dati accurata, soprattutto quando più parametri sono in corso di valutazione nello stesso esperimento. A questo proposito, si raccomanda che i controlli fresca compensazione monocolore essere preparati per ogni pMHC-I tetramero scontenente saggio. Favoriamo l'uso di sfere di compensazione a causa della loro ampia reattività anti-Ig e il fatto che essi forniscano chiare distribuzioni bimodali delle popolazioni positive e negative. Dal momento che queste perle non si legano alle molecole MHC-I, gli anticorpi coniugati agli stessi fluorofori come i tetrameri pMHC-I (ad esempio, APC e BV 421) devono essere utilizzati come controlli di compensazione. Molti di tali sfere di compensazione sono disponibili da fornitori diversi e deve essere utilizzato in base alle istruzioni del produttore. In terzo luogo, dal momento che la strategia di fenotipizzazione qui descritto richiede la delineazione di CD8 + cellule T basati sull'espressione graduata di tre molecole (ad esempio, CD28, CCR7, e GZM B), controlli gating, come la fluorescenza meno uno (FMO) Test o anticorpi isotipo-abbinato, dovrebbero essere utilizzati per facilitare questi tipi di analisi. Nei nostri esperimenti, ad esempio, tubi separati contenenti tetramero pMHC-I + popolazione CD8 + T-cellulare di interesse unre sempre macchiato con anticorpi monoclonali di controllo isotipo coniugati agli stessi fluorocromi come gli anticorpi monoclonali contro CD28, CCR7, e GZM B. È importante sottolineare che, anche se le linee guida di cui sopra potrebbero contribuire a migliorare la qualità complessiva del pMHC-I tetramero colorazioni, non sono le uniche variabili che può influire sulle prestazioni di questo test. Considerando l'unicità di ogni ambiente di laboratorio, l'intero flusso di lavoro qui descritta deve essere eseguita almeno una volta su campioni finto per consentire la pratica e le regolazioni rilevanti.
Curiosamente, pMHC-I tetramero positive CD8 + T-cellule sono occasionalmente osservate in PBMC da ingenuo SIV macachi Rhesus (non infetti e non vaccinati). Questi casi non sembrano essere il risultato di colorazione di fondo basato su ispezione visiva dei dati. Piuttosto, essi potrebbero riflettere le interazioni tra le molecole pMHC-I e recettori immunoglobuline-like Killer (Kirs) espressi sulla superficie di macaco rhesus NK e CD8 + T-cellule 39,40. Infatti, Mamu-A1 * 002: 01 tetrameri piegate con peptidi corrispondenti alle epitopi Gag GY9 e Env RY8 hanno dimostrato di legarsi a Mamu-KIRDL05 39. Lungo queste linee, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 e Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 sono più inclini a esporre la colorazione tetramero pMHC-I Ag-indipendente sopra descritta. Dato questo fenomeno, è importante controllare per questo la reattività al basale in esperimenti sulle scimmie che coinvolgono valutazioni longitudinali di SIV-specifici + risposte delle cellule T CD8 dopo l'infezione o la vaccinazione. Per ottenere questo, è consigliabile eseguire pMHC-I tetramero colorazione su campioni ottenuti nel primo giorno di trattamento. Potrebbe anche essere pertinenti per congelare PBMC in diverse aliquote di piccole dimensioni in questi punti temporali iniziali nel caso in cui il confronto con i campioni di base sono necessari in esperimenti futuri.
Una limitazione di pMHC-I tetramero colorazione è che solo + CD8 T-cellule di specificità conosciuto e MHC-I restrizione cun essere studiato da questo approccio. Ciò è particolarmente rilevante nei macachi rhesus data la complessa organizzazione del loro loci MHC. Infatti, un singolo macaco rhesus aplotipo può avere decine di geni MHC-I, non tutti codificare molecole che sono stabilmente espressi sulla superficie cellulare 29. Come risultato, può essere difficile determinare l'insieme di molecole funzionali MHC-I espresse da un determinato animale. Tuttavia, questo avvertimento può essere superato progettando esperimenti che includono scimmie che sono positivi per noti alleli MHC-I, come Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu- B * 017: 01.
In conclusione, questo manoscritto fornisce una ottimizzata protocollo tetramero colorazione pMHC-I per determinare il fenotipo frequenza e la memoria di SIV-specifici CD8 + cellule T nei macachi rhesus. Dal momento che pMHC-I tetramero colorazione è più sensibile di IFN-γ ELISPOT e saggi ICS per la rilevazione di CD8 Ag-specifica+ T-cellule e non richiede la stimolazione in vitro Ag, la metodologia qui presentata è particolarmente utile per studiare l'impatto delle risposte delle cellule T CD8 + nel risultato di infezione da virus dell'immunodeficienza. La conoscenza pratica acquisita da padroneggiare questa tecnica potrebbe anche essere utile per arricchire Ag-specifici + CD8 T-cellule come parte di studi funzionali e per il monitoraggio dei CD8 + risposte delle cellule T in varie impostazioni della malattia 6.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare David Watkins per supportare gli esperimenti che hanno permesso l'ottimizzazione del presente metodologia. La ricerca riportato nella presente pubblicazione è stato sostenuto in parte da una sovvenzione pilota fornito dal Miami Center for AIDS Research del National Institutes of Health con il numero premio P30AI073961. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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