Summary
Denne undersøgelse beskriver en imaging-baserede mikro-neutraliseringsanalyse at analysere de antigene relationer mellem vira. Protokollen anvender en flatbed scanner og har fire trin, herunder titrering, titrering kvantificering, neutralisering, og neutralisering kvantificering. Assayet fungerer godt med nuværende cirkulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus.
Introduction
Micro-neutralisering (MN) assays anvendes i virologi til kvantificering af neutraliserende antistoffer og antivirale aktiviteter. Som et alternativ af hæmagglutinationsinhiberings (HI) assays, MN assays kan overvinde ikke-antigene virkninger påvirket af affinitets ændringer i receptor-bindende i influenzavira, som kan komplicere fortolkningen af HI resultater 1,2,3. Indtil for nylig blev de fleste MN assays baseret på cytopatiske virkninger (CPE) eller enzymkoblet immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN assays baseret på reduktion fokus og plak blev udviklet i 1990 6,7,8. Plakanalyser reduktion afhængige tælle synlige plaque at kvantificere infektivitet. Imidlertid visuelle tællinger kun dække store plaques, der er løses ved menneskeøjne, selv om de fleste af plaques er små og usynlige for mange nuværende cirkulerende virus. Denne ufuldstændig dækning kan forårsage betydelig variation blandt eksaminatorer og mellem eksperimenter, der fører til jegncomparable resultater. Det er også umuligt at anvende den metode, når visse vira viser abortiv infektion af enkeltceller eller meget små plaques.
De fattige optælling opløsning kan forbedres ved at indføre en imaging-baseret protokol. Med teknologiske fremskridt, optisk mikroskopi og high-throughput godt plade læsere kan give nøjagtige midler til at tælle de inficerede celler 9. Under en trans-belyst mikroskop, kan inficerede celler tagget med bestemte markører visualiseres ved deres absorption eller fluorescens kontrast i sub-cellulær opløsning. En prøve kan derefter analyseres på en computerskærm.
Desværre, på grund af begrænsningen i synsfeltet, er mere end hundrede flisebelagte billeder forpligtet til at dække en enkelt brønd. Analysere en plade med 96 brønde ville kræve billeddannelse og behandling af omkring ti tusinde billeder. En sådan omstændelig proces er tidskrævende og dyrt, og beslutningen indhøstet er under slægternel unødvendig til rutinemæssig karakterisering af virusinfektioner. Laboratorier med et begrænset budget kan opleve, at den tilgang, bygget op omkring en flatbed scanner giver en omkostningseffektiv, high-throughput alternativ.
I denne artikel beskriver vi en forbedret plakreduktion MN assay, der er egnet til den antigene karakterisering af et stort antal virusser og til kvantitativ måling antivirale aktiviteter og neutralisering antistoffer. Assayet har flere fordele: for det første er et billeddannende assay der er i stand til at måle virusinfektioner på celleniveau, uanset plaquestørrelse. Tælle det samlede inficerede cellepopulation (ICP) i en brønd i høj grad øger påvisningen følsomhed, hvilket gør det muligt at karakterisere de vira med lav infektivitet. For det andet er en mere nøjagtig kvantitativ titrering indført før neutralisering at bestemme mængden af input-virus. Den kvantitative input virus reducerer varia betydeligttion mellem forskellige eksperimenter og gør resultaterne mere sammenlignelige mellem laboratorier. For det tredje kan neutralisationstitere bestemmes direkte ved analyse af billeder, hvilket gør kvantificering hurtig og brugervenlig. Endelig protokol giver en omkostningseffektiv og high-throughput alternativ med den krævede opløsning og nøjagtighed. Kvantificeringen er baseret på en flatbed scanner og fri databehandling software. Hele opsætningen har et lille fodaftryk og er deployerbare i de fleste laboratorier.
Protokollen i dette papir består af fire store skridt, herunder virus titrering, titrering kvantificering, virus neutralisering, og neutralisering kvantificering. Virustitrering er et præparat eksperiment, der bestemmer mængden af input-virus, der skal anvendes i neutralisering. Under en titrering, er et antal af virale koncentrationer anvendes på cellemonolag i en plade med 96 brønde. De inficerede celler derefter kvantificeres i afsnit 2. Den virale Dilution, der producerer 20% -85% ICP er til gengæld anvendes som input virus til den tilsvarende neutralisering i § 3. titre af neutralisering protokollen kvantificeres ved hjælp sektion 4. Eksperimenter, der fulgte de ovennævnte protokoller er præsenteret i de Repræsentative resultater. Assayet er blevet testet grundigt i de sidste to år med de fleste af de nuværende cirkulerende influenzavira, såsom A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus. Resultaterne af influenzavirus karakterisering blev inkluderet i rapporterne for samrådet WHO, der gav anbefalinger om influenzavacciner til brug på den sydlige halvkugle i 2016 og den nordlige halvkugle i 2016-2017.
Protocol
BEMÆRK: biosikkerhed niveau (BSL) for følgende protokol er BSL 2 for sæsonbetingede influenzavirus og BSL 3+ for potentielle pandemiske influenzavirus. Viral titrering er påkrævet på forhånd af en neutralisering eksperiment for at bestemme den virale koncentration af det virale kontrol (VC).
1. Virus Titrering
BEMÆRK: Afhængig af antallet af vira og antallet af dubletter, kan en plade sættes op med følgende fleksibilitet: (1) Den virale fortynding kan arrangeres langs enten rækker eller kolonner (figur 1). Hvert virus bør have en særskilt række / søjle. (2) Den virale fortynding tilvækst er fleksibel, men det bør starte med den højeste virale koncentration i øverste venstre hjørne. (3) Der er ingen begrænsning på antallet af dubletter.
BEMÆRK: Madin Darby hunde nyre (MDCK) og MDCK-SIAT1 (SIAT) celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germange 10. SIAT celler er MDCK-celler stabilt transficeret med den humane CMP-N-acetylneuraminat: P-galactosid α-2,6-sialyltransferase genet til forøget ekspression af sialinsyre (SA) α2-6Gal-terminerede oligosaccharider.
- Alikvote tilstrækkelige MDCK-celler eller MDCK-SIAT celler 8 i 96-brønds plader (200 pi / brønd). Inkuber cellerne ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 eller 3 dage at nå konfluens. Opformere cellerne i DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS) og antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin). Inkuber SIAT celler ved 37 ° C med 5% CO2 og 1 mg / ml G418 sulfat.
BEMÆRK: Fortyndingsfaktoren er afhængig erfaring og cellelinien anvendes. Cellemonolaget skal konfluente (dvs. ingen cellevæg eller synlig skitse for MDCK-celler og en tæt-pakket layout for MDCK-SIAT1 celler) på tidspunktet for virus inokulering. Eksempler på fortyndinger baseret påsubkultur sammenflydende kolber af MDCK eller MDCK-SIAT1 celler er angivet i tabel 1. - Vask cellerne 3 gange med 200 pi af virus-vækstmedium (VGM) pr. Steriliser flerlags pladevasker med 70% EtOH i 30 min, og derefter skylle det i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) eller VGM før vask.
- Aspirer VGM og straks tilsættes 50 pi VGM til hver brønd.
- Tilføj 900 pi VGM til hver af 6 sterile rør (eller færre, afhængigt af antallet af test virus og dubletter). Tilsæt 100 pi virus ind i det første rør, bland godt, og serielt fortynde, ændre tips mellem hver fortynding. Gentag for hver virus, der skal titreres.
BEMÆRK: Dette vil give virus fortyndinger af 10 -1 til 10 -6. - Tilsæt 50 pi af hver virusfortynding, begyndende ved den højeste fortynding (1 x 10 -5 i figur 1), til duplikerede brønde (kolonne 9 og 10 i figur 1) af en 96-brønds plade.
- Pladen anbringes ved 37 ° C i 2-3 timer for at tillade viruset at inficere cellerne.
BEMÆRK: En 2 til 3 timers inkubation er nødvendigt at sikre, at vira i podestoffet har tid nok til at nå monolaget. - Forbered overlay (10 ml / plade)
BEMÆRK: overlejring består af 5 ml 2x DMEM, trypsin (2 pg / ml slutkoncentration), 20 pi 1 mg / ml stamopløsning, og 5 ml af cellulose- bomuldslinter (se Materialer List). - Fjern inokulum.
- Tilsæt overlay (200 pi til hver brønd). Der inkuberes natten over ved 37 ° C, uforstyrret.
BEMÆRK: virus knopskydning finder sted efter ca. 4 timer, så det er vigtigt, at pladen ikke forstyrres efter dette tidspunkt. - Aspirer overlay fra brøndene.
- Tilføj iskold 4% paraformaldehyd i PBS A (200 pi / brønd). Placere dem ved 4 ° C i 30 minutter eller ved stuetemperatur i 20 minutter.
BEMÆRK: PBS A er naturligt-pH phosphatpufret saltvand med 10 gof NaCl, 0,25 g KCI, 1,437 g Na 2 HPO 4, 0,25 g KH 2 PO 4, og 1 I destilleret vand (se Materialer List).
BEMÆRK: Paraformaldehyd er skadeligt ved indånding og kan forårsage forbrændinger ved indtagelse. Der er også begrænset for kræftfremkaldende effekt, og det kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. - Aspirer paraformaldehyd og vaske pladerne to gange med PBS A (200 pi / brønd).
- pladerne i PBS A Opbevar ved 4 ° C til fremtidig brug, eller fortsætte med følgende trin.
- Tilføj permeabilisering puffer (100 pl / brønd). Lade det blive ved stuetemperatur i 30 min.
- Vask pladen to gange med PBS A (200 pi / brønd).
- Der tilsættes 50 pi af det første antistof, muse-MAb mod influenza type A (1: 1.000 i ELISA-buffer), per brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time (eller 4 ° C natten over), med rystning.
- Vask det 3 gange i 100 pi vaskepuffer (0,05% Tween 80 i PBS A, v / v) pare godt. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min mellem vaskene. Alternativt vaske det 3 gange uden inkubation ved hjælp 300 pi per brønd.
- Der tilsættes 50 pi af det andet antistof, ged anti-mus IgG (H + L) HRP-konjugat (1: 1.000 i ELISA-buffer) per brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time med omrystning.
- Vaske det 3 gange som beskrevet i trin 1.17.
- Tilsæt substrat (50 pl / brønd). Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter eller indtil udviklingen af en blå farve er klart synlig.
- At standse reaktionen, vask pladen to gange med 200 pi destilleret vand per brønd, inkubering ved stuetemperatur i 2 -3 min mellem vaskene.
- Air-tørre pladen og opbevar den på et mørkt sted (f.eks pak den ind i alufolie).
2. Titrering Kvantificering
- Placer en plade i scanningsområdet af en flatbed scanner, som vist i figur 2a. Brug det L-formede position grænse forsikre en optimal og gentagelig billeddannelse placering.
BEMÆRK: Det er muligt at afbilde to brønds plader i én scanning. - Scan et billede.
BEMÆRK: Indstillingerne er vist i tabel 2. - Kør "Wellplate Reader" software til at beregne den krævede virus fusion (figur 3).
- Klik på "Load billede" knappen for at indlæse et billede. Skub den røde bjælke i histogrammet af "Global Threshold" fanen for at justere tærsklen prøvetagning. Klik på knappen "Opdater" for at undersøge effekten på billedet.
- Sæt kryds i boksen "Beregn Neutralisering / Titrering". Klik på knappen "Sampling" at kvantificere ICP. Klik på knappen "Gem" for at gemme resultaterne prøveudtagning når du bliver bedt.
BEMÆRK: Efter prøvetagning proces, vises et nyt vindue kaldet "Neutralisation og titrering Calculation" automatisk, hvis boksen "Beregn Neutralisering / Titrering" er markeret. - Load eller indtaste godt plade definition map. Angive tærskel (f.eks, 30%) i "Titrering: Optimal Virus Population (%)". Vælg fanebladet "Titrering processen" at beregne titrering resultater. Kontroller titrering resultater. Klik på "Gem og luk" knappen for at gemme titrering resultater.
BEMÆRK: Se supplerende S1 for mere detaljeret instruktion på software. En kopi af skræddersyet software er til rådighed efter anmodning.
BEMÆRK: Typisk er den bedste virus fortynding for plaque-reduktion assay udbytter omkring 50% (20-85%) ICP af totale celler i hver brønd 11.
3. Virus Neutralisering
BEMÆRK: Beregn antal plader, der kræves til neutralisering assay. Hver plade kan rumme en virus og en række antisera.
BEMÆRK: Afhængigt af antallet af antisera og antallet af dubletter, en plade kan sættes op med the følgende fleksibilitet: (1) serumfortynding kan arrangeres langs enten række eller en kolonne (figur 4). Hvert serum bør have en særskilt række eller kolonne. (2) forøgelse af serumfortynding er fleksibel, men det bør starte med den højeste serumkoncentration i øverste venstre hjørne af en plade. (3) Antallet af dubletter afbalancerer antallet af antisera. Flere dubletter kan bidrage til at udjævne eksperimentelle variationer. (4) Antallet af VC og antallet af cellen kontrol (CC) dubletter er fleksible, men de skal også være i separate rækker eller kolonner. Det forventes, at antallet af VC dubletter er væsentligt større end den af antisera.
- Forbered cellemonolaget, som i trin 1.1-1.3, 2 eller 3 dage i forvejen.
- Der tilsættes 50 pi VGM til hver brønd i pladen.
- Brug Kolonner 11 og 12 for VC og CC, hhv. Der tilsættes 50 pi alikvoter på 1:20 receptor-ødelæggende enzym (RDE) -behandlet serum til den første række (A), i Columns 1-10.
NB: For hver virus og serum kombination, udføres assayet in duplo, så en plade kan for eksempel indeholde én virus testet mod fem antisera. - Udfør 2-gange serielle fortyndinger ved at overføre 50 pi fra række A til række H (Kolonne 1-10 i figur 4) og kassere 50 pi fra række H.
- Der tilsættes 50 pi fortyndingsmiddel til hver brønd af CC kolonne (kolonne 12 i figur 4).
- Der tilsættes 50 pi af virus til hver brønd af pladen, bortset fra CC kolonne (kolonne 1-11, Rækker AH i figur 4).
- Inkuber det ved 37 ° C i 2-3 timer. Fjern inokulum. Tilsæt overlay (200 pi) til hver brønd. Inkuber det natten over ved 37 ° C, uforstyrret. Fix og plette pladerne som for virus titrering (trin 1,11-1,22).
4. Neutralisering Kvantificering
- Placer en plade i scanningsområdet af en flatbed scanner, som vist i Figure 2a. Brug det L-formede position grænse for at sikre en optimal og gentagelig billeddannelse placering.
BEMÆRK: Det er muligt at afbilde to brønds plader i én scanning. - Scan pladen, som beskrevet i trin 2.2.
- Kør "Wellplate Reader" software til at beregne de krævede virale titere (figur 3, trin 2.3).
- Klik på "Load billede" knappen for at indlæse et billede. Skub den røde bar i "Global Threshold" for at justere tærsklen prøvetagning. Klik på knappen "Opdater" for at undersøge effekten.
- Sæt kryds i boksen "Beregn Neutralisering / Titrering". Klik på knappen "Sampling" at kvantificere ICP. Klik på knappen "Gem" for at gemme resultaterne prøveudtagning når du bliver bedt.
BEMÆRK: Efter prøvetagning proces, vises et nyt vindue kaldet "Neutralisation og titrering Calculation" automatisk, hvis boksen "Beregn Neutralisering / Titrering" er markeret. - Load eller indtaste godt psen kort. Angiv tærsklen (f.eks 50%) i "Neutralisering:. Infektion Fradrag (%)"
- Vælg "Neutralisation Process" for at beregne titrene. Kontroller titre og klik på "Gem og luk" knappen for at gemme neutralisering resultater.
BEMÆRK: Neutralisation rapporteres som den reciprokke af den højeste fortynding af serum med den foruddefinerede ICP reduktion (såsom 50% eller 80%) mod VC (middelværdien af kolonne 11 i figur 4). En reduktion på 50% ICP blev brugt i de Repræsentative resultater.
Representative Results
Efter ovennævnte procedurer, præsenterer vi nogle resultater fra de seneste Antigenkarakterisering eksperimenter. Opsætningen titrering designet til at undersøge otte input vira, med dobbelt dubletter for hver fortynding. De virale fortyndinger blev testet mellem 1,0 x 10 -1 og 1,0 x 1,0 -6 at dække variationer mellem vira. Testen vira var fra H3N2 subtype, herunder A / Cameroun / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015 A / Moscow / 103/2015 A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015, og A / Bratislava / 437/2015. Titreringsdataene Resultaterne er illustreret i figur 5. Figur 5d viser faldet i ICP'er med stigningen af virus fortynding. Kurverne blev normaliseret mod ICP'er af samme virus, der har givet anledning til infektioner i alle celler i en brønd 12 (defineret som ICP mætning). Hvis ICP ikke nåede mætning med highest virus koncentrering blev ICP gennemsnit fra tilsvarende dubletter anvendes i stedet (A / Moskva / 103/2015 figur 5d). De virusfortyndingerne der producerede 30% af ICP mætning blev valgt som et input virusfortynding til neutralisering (tabel 3).
Neutralisering formål at have én indgang virus mod fem antisera, med dobbelte dubletter på hver plade. Henvisningen virus viste er H3N2 A / Stockholm / 63/2015. De fem antisera er A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sydafrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / schweiziske 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, og A / hollandsk 525/14 SIAT F23 / 15. Neutraliseringen Resultaterne er illustreret i figur 6. Figur 6d viser fremskridt infektion med stigningen af serum fortynding. Den normaliserede positive population på den lodrette akse repræsenterer forholdet mellem ICP'er fra den tilsvarende antisera respons mod den gennemsnitlige ICPaf referencen virus 12. Baggrunden ICP fra uinficerede celle kontroller blev subtraheret under normalisering. De neutralisationstitere blev bestemt som de reciprokke værdier af antiserum-fortyndinger svarende til 50% ICP reduktion (tabel 4). Lineær interpolation blev anvendt til at estimere titre falder mellem to tilstødende serumfortyndinger.
Figur 1: Eksempel på et godt plade setup i en virus titrering eksperiment. Test vira er tildelt til separate rækker (A til H). Kolonner er designet til forskellige virale fortyndinger (1 til 12). To søjler blev anvendt som dubletter for hver viral fortynding. Scale bar = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skema af en prøve scanning system. (A) En 96-brønds plade på den billeddannende positionen af en flatbed scanner (genudgivet fra Henvisning 11 med tilladelse fra Elsevier BV), og (b) dimensionerne af det L-formede position grænse er vist i (a). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Desktop diagram af "Wellplate Reader" kvantificeringssoftware. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 4: Eksempel på et godt plade setup i en neutralisering eksperiment. Hvert antiserum er tildelt to kolonner med dubletter (1 til 10). Rækker er designet til forskellige serumfortyndinger (A til H). Den virus kontrol tager Kolonne 11, med otte duplikater (A11 til H11). Cellen styring er i kolonne 12, med otte duplikater (A12 til H12). Scale bar = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Resultater af en titrering eksperiment. (A) Den godt plade setup, (b) scannet godt plade billede, (c) illustrationaf farven-kodet, kvantificeret, virusinficerede celle population, og (d) normaliserede virusinficerede cellepopulationer mod virusfortyndingerne. 30% ICP blev anvendt som tærskel. De fejl barer i (d) er standardafvigelser (SD) fra prøven gentagelser (± 1 SD). Scale barer i (b) og (c) = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Resultater af en neutralisering eksperiment. (A) Den godt plade setup, (b) scannet godt plade billede, (c) illustration af kvantificeret, virusinficeret cellepopulation, og (d) normaliseret virusinficerede cellepopulation mod serumfortynding. Input VIrus (VC) er A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP blev anvendt til at beregne titrene. De fejl barer i (d) er standardafvigelser (SD) fra prøven gentagelser (± 1 SD). Scale barer i (b) og (c) = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende S1: Klik her for at downloade denne fil.
| Typisk fortynding | ||
| MDCK-celler | MDCK-SIAT1 celler | |
| 2 dage | 1: 5 (1 + 4) | 1:10 (1 + 9) |
| Tre dage 1:10 (1 + 9) | 1:20 (1 + 19) | |
| Typisk antal celler pr ml | ||
| MDCK-celler | MDCK-SIAT1 celler | |
| 2 dage | 2 x 10 5 | 1 x 10 5 |
| Tre dage | 1 x 10 5 | 5 x 10 4 |
Tabel 1: Typiske fortyndinger på en subkultur af sammenflydende kolber af MDCK eller MDCK-SIAT1 celler.
| Mode | Professional-tilstand |
| Document Type | Film (med Film Area Guide) |
| Auto Exposure Type | Foto |
| imalder Type | 24-bit farve |
| Løsning | 1.200 dpi |
| Gemt billede Format | TIFF |
Tabel 2: Typisk opsætning af en flatbed scanner.
| Række | Virus | Anbefalet fortynding |
| EN | A / Cameron / 15V-3538/2016 | 1,0 x 10 -2 |
| B | A / Vladivostok / 36/2015 | 1,0 x 10 -3 |
| C | A / Moscow / 103/2015 | 1,1 x 10 -1 |
| D | A / Tomsk / 5/2015 | 5,9 x 10 -1 |
| E | A / Moscow / 101/2015 | 8,3 x 10 -1 |
| F | A / Moscow / 100/2015 | 1,4 x 10 -2 |
| G | A / Moscow / 133/2015 | 1,3 x 10 -2 |
| H | A / Bratislava / 437/2015 | 1,3 x 10 -4 |
Tabel 3: Virale fortyndinger beregnet ud fra en befolkning på 30% ICP.
| Kolonne | Antisera | Anbefalet titer |
| 1 - 2 ud | A / HK4801 / 2014 | 110 |
| 3 - 4 | A / HK7295 / 2014 | 213,3 |
| A / Sydafrika / R2665 / 2015 | 2155,8 | |
| 7 - 8 | A / Schweiz / 9715293/2013 | 89,4 |
| 9-10 | A / Holland / 525/2014 | 78,6 |
Tabel 4: Titere på 50% ICP af A / Stockholm / 63/2015 mod antisera.
Discussion
I denne undersøgelse beskrev vi et billeddannende-baserede MN assay til at kvantificere de sande antigene relationer mellem vira. Sammenlignet med andre assays plaque-reduktion, understreger fremgangsmåden måling af ICP af en hel brønd, sikrer fuldstændig dækning af den infektiøse befolkning. Uafhængigheden af plakdannelse udvider også anvendelsen af assayet for virus, der kan danne hovedsageligt usynlige små plaques eller som kun håndtere encellede infektion. Derfor er assayet stand til at undersøge flere vira og virkningerne af en bredere vifte af antistoffer end HI, og det bidrager til mere omfattende afspejle de antigene ligheder eller forskelle mellem vira 12. For eksempel når oseltamivircarboxylat er inkluderet, MN assayet er mindre påvirket af NA-afhængig binding, hvilket afspejler de antigene forskelle mere nøjagtigt. Under udviklingen af assayet blev gjort en stor indsats for at forbedre eksperimentet konsistens, hastighed og detektionfølsomhed, herunder ved at kontrollere input virus gennem kvantificeres titrering, billedbehandling i høj kapacitet med en flatbed scanner, og gennemføre en brugervenlig databehandling platform. Resultaterne har generelt været i overensstemmelse med og bekræftet dem i HI. Især resultaterne afslørede også antigene forskelle mellem antigen drift varianter af nylige type A og B vaccine virus, samt antigene ændringer forårsaget af kultur-udvalgte eller sporadiske ændringer, såsom den G155E substitution i HA1 af visse A (H1N1) pdm09 vira 12.
Protokollen matchede virus type eller undertype med udvælgelsen af cellelinier, der gav den stærkeste infektion, hvilket i høj grad forbedret billeddannelse signal. Eksperimentel variation blev glattet med design af dubletter, som afbalanceret med antallet af testede antisera. Usikkerheder kan også komme fra billedkvaliteten, som hovedsageligt påvirket af imaging enhed. En anstændig farve flatbed scanner kan signideligt forbedre billedets kontrast og reducere støjen. Mængden af input virus i neutralisering skal bestemmes kvantitativt på forhånd fra den tilsvarende titrering, mens vira stadig bevare en lignende status. Under neutralisation, antiserummet reaktion på en infektion er normaliseret mod forskellen mellem reference-virus (VC) og baggrundsniveauet (CC). Nøjagtige målinger af VC og CC er væsentlige for en neutralisering eksperiment. Flere dubletter anbefales (otte dubletter blev brugt i de Repræsentative resultater). Endelig forstå software er afgørende for succes af et eksperiment. Den software er blevet testet til rutinemæssig viruskarakterisering i WHO Influenza Center, UK i mere end to år. Detaljerede instruktioner til håndtering af forskellige situationer findes i den supplerende S1.
Denne MN assay er velegnet til applikationer, hvor prøverne dækker en extremely store synsfelt, men kræver kun moderat imaging opløsning. De lave omkostninger og enkel opsætning gør systemet let tilgængelige for de fleste virologiske laboratorier. Variationen i målinger af den samme prøve var mindre end 3%, hvilket stort set definerer usikkerhed indført under scanningen 11. Sådan reproducerbarhed er tilstrækkelig i mange virologiske undersøgelser og kan reduceres yderligere ved at midle billeder fra flere scanninger.
Afslutningsvis denne undersøgelse viser en robust MN assay, der kan rutinemæssigt anvendes i antigen undersøgelse og støtte HI data i detaljerede analyser af aktuelt cirkulerende influenzavira, især for den halvårlige udvælgelse af virus til optagelse i humaninfluenzavacciner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl 10 g, KCl 0.25 g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g, and Dist. Water 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4 g in 100 ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2x DMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10 ml/plate): | 5 ml 2x DMEM, Trypsin 2 μg/ml final concentration, Avicell 5 ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1,000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
