Summary
Este estudo descreve uma -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.
Introduction
Micro-neutralização (Mn) Os ensaios são usados em virologia para a quantificação de anticorpos neutralizantes e de actividades antivirais. Como uma alternativa de inibição da hemaglutinação (Hl) ensaios, ensaios de MN pode superar os efeitos não-antigénicos influenciadas pelas mudanças de afinidade de receptor de ligação ao vírus da gripe, em que podem complicar a interpretação dos resultados 1,2,3 HI. Até recentemente, a maioria dos ensaios de MN foram baseados em efeitos citopáticos (CPE) ou ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA) de 4,5. Ensaios MN com base na redução de foco e placas foram desenvolvidas em 1990 6,7,8. Ensaios de redução de placas confiar em contar placas visíveis para quantificar a infecciosidade. No entanto, contagens visuais só cobrir grandes placas que são resolvido pelo olho humano, mesmo que a maioria das placas são pequenos e invisível para muitos vírus corrente circulante. Esta cobertura incompleta pode causar uma variação significativa entre os examinadores e entre experimentos, levando a iresultados ncomparable. É também possível usar o método em que alguns vírus mostrar infecção abortiva de células individuais ou muito pequenas placas.
A resolução de contagem pobre pode ser melhorada através da introdução de um protocolo baseado em imagiologia. Com os avanços da tecnologia, microscopia óptica e de alto rendimento leitores bem-placa pode fornecer meio preciso para contar as células infectadas 9. Sob um microscópio trans-iluminado, as células infectadas marcadas com certos marcadores podem ser visualizados por sua absorção ou fluorescência contraste na resolução de sub-celular. Uma amostra pode, então, ser analisadas num ecrã de computador.
Infelizmente, devido à limitação no campo de vista, mais do que uma centena de imagens em azulejo são necessários para cobrir um único poço. Analisando uma placa com 96 poços exigiria a criação de imagens e processamento de cerca de dez mil imagens. Tal processo é trabalhoso e demorado, caro, e a resolução obtida é em génerosl desnecessária para a caracterização de rotina de infecções virais. Laboratórios com um orçamento limitado pode achar que a abordagem construído em torno de um scanner de mesa oferece uma alternativa de alto rendimento rentável.
Neste artigo, descreve-se um ensaio de redução de placas MN melhorada que é adequado para a caracterização antigénica de um grande número de vírus e para medir quantitativamente as actividades antivirais e anticorpos de neutralização. O ensaio tem várias vantagens: em primeiro lugar, é um ensaio à base de imagens, que é capaz de medir a infecções por vírus a nível celular, independentemente do tamanho da placa. Contando da população total de células infectadas (ICP) dentro de um bem aumenta grandemente a sensibilidade de detecção, que permitem caracterizar os vírus com baixa infectividade. Em segundo lugar, uma titulação quantitativa mais preciso é introduzido antes da neutralização para determinar a quantidade de vírus de entrada. O vírus de entrada quantitativa reduz significativamente o Variação entre as diferentes experiências e torna os resultados mais comparáveis entre laboratórios. Em terceiro lugar, os títulos de neutralização pode ser determinada directamente através da análise de imagens, tornando a quantificação rápida e fácil de usar. Finalmente, o protocolo fornece uma alternativa de baixo custo e de alto rendimento com a resolução e precisão necessária. A quantificação é baseada em um scanner de mesa e software de processamento de dados livre. Toda a configuração tem uma pegada pequena e pode ser implantado na maioria dos laboratórios.
O protocolo apresentado neste documento consiste em quatro etapas principais, incluindo titulação do vírus, a quantificação de titulação, a neutralização do vírus, e quantificação de neutralização. titulação do vírus é um experimento de preparação que determina a quantidade de vírus de entrada a serem usados na neutralização. Durante a titulação, uma série de concentrações virais são aplicados às monocamadas de células numa placa de 96 poços. As células infectadas são então quantificados na seção 2. O Dilu viralção, que produz 20% -85% ICP é, por sua vez aplicada como vírus de entrada para a neutralização correspondente no Seção 3. Os títulos do protocolo de neutralização são quantificados usando seção 4. As experiências que se seguiram os protocolos acima são apresentados nos resultados representativos. O ensaio foi testado exaustivamente durante os últimos dois anos, com a maior parte das correntes que circulam os vírus da gripe, tais como A (H1N1) pdm09, A (H3N2), e B vírus. Os resultados da caracterização do vírus da gripe foram incluídos nos relatórios para a reunião de consulta da OMS, que deu recomendações sobre vacinas contra a gripe para uso no Hemisfério Sul em 2016 e do Hemisfério Norte em 2016-2017.
Protocol
NOTA: O nível de biossegurança (BSL) para o seguinte protocolo é BSL 2 para vírus da gripe sazonal e BSL 3+ para possíveis vírus de gripe pandêmica. titulação virai é necessária antes de uma experiência de neutralização para decidir a concentração viral do controlo viral (VC).
Titulação 1. Vírus
NOTA: Dependendo do número de vírus e o número de duplicações, uma placa bem pode ser configurado com as seguintes flexibilidades: (1) A diluição virai podem ser dispostos ao longo de qualquer das filas ou das colunas (Figura 1). Cada vírus deve ocupar uma linha / coluna separada. (2) O aumento de diluição virai é flexível, mas deve começar com a maior concentração viral no canto superior esquerdo. (3) Não há nenhuma restrição sobre o número de duplicatas.
NOTA: Madin Darby de rim canino (MDCK) e MDCK-SIAT1 células (SIAT) foram gentilmente cedidas pelo Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germuitos 10. SIAT células são células MDCK transfectadas estavelmente com o CMP-N-acetilneuraminato humano: gene da p-galactósido α-2,6-sialiltransferase para a expressão aumentada de ácido siálico (SA) oligossacáridos α2-6Gal-terminados.
- Células alíquotas suficientes MDCK ou células MDCK-SIAT 8 em placas de 96 poços (200 ul / poço). Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 ou 3 dias para atingir confluência. Propagar as células em DMEM suplementado com soro inactivado pelo calor 10% de vitelo fetal (FCS) e antibióticos (penicilina 100 U / ml e 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar as células a 37 SIAT ° C com 5% de CO 2 e 1 mg / ml de sulfato de G418.
NOTA: O factor de diluição é dependente de experiência e a linha celular utilizada. A monocamada de células confluentes deve ser (ou seja, sem parede celular ou esboço visível para as células MDCK e um esquema bem-embalados para as células MDCK-SIAT1) no momento da inoculação com o vírus. Exemplos de diluições com base ema subcultura de frascos confluentes de células MDCK ou células MDCK-SIAT1 são dadas na Tabela 1. - Lavam-se as células 3 vezes com 200 ul de meio de crescimento do vírus (VGM) por poço. Esteriliza-se o lavador de placas de multicamadas com 70% de EtOH durante 30 minutos, e, em seguida, lave-o em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) ou VGM antes da lavagem.
- Aspirar o VGM e imediatamente adicionar 50 ul de VGM a cada poço.
- Adicionar 900 ul de VGM para cada um dos 6 tubos estéreis (ou menos, dependendo do número de vírus de teste e duplicados). Pipete 100 pi de vírus para o primeiro tubo, misturar bem, e diluir em série, mudando as pontas entre cada diluição. Repita para cada vírus para ser titulada.
NOTA: Isto vai dar diluições de vírus de 10 -1 a 10 -6. - Adicionar 50 ul de cada diluição do vírus, a partir da mais alta diluição (1 x 10 -5 na Figura 1), para poços duplicados (colunas 9 e 10 na Figura 1) de uma 9placa de 6 poços.
- Colocar a placa a 37 ° C durante 2-3 horas para permitir que o vírus para infectar as células.
NOTA: uma incubação de 2 a 3 horas é necessário para assegurar que os vírus no inoculo ter tempo suficiente para alcançar a monocamada. - Prepare a sobreposição (10 ml / placa)
NOTA: A sobreposição é composta por 5 ml de 2x DMEM, tripsina (2 ug / ml concentração final), 20 ul de 1 mg / ml e 5 ml de fibras de algodão de celulose (ver a Lista de Materiais). - Remover o inoculo.
- Adicionar a sobreposição (200 ul a cada poço). Incubar durante a noite a 37 ° C, sem ser perturbado.
NOTA: O brotamento vírus ocorre após cerca de 4 horas, por isso, é importante que a placa não é perturbada após esse tempo. - Aspirar a sobreposição dos poços.
- Adicionar gelada 4% de paraformaldeído em PBS A (200 ul / poço). Colocá-los a 4 ° C durante 30 min ou a temperatura ambiente durante 20 min.
NOTA: PBS Um é natural do pH de solução salina tamponada com fosfato com 10 Gof NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na 2 HPO 4, 0,25 g de KH 2 PO 4, e 1 L de água destilada (consulte a lista de materiais).
NOTA: O paraformaldeído é prejudicial quando inalado e pode causar queimaduras por ingestão. Há também uma evidência limitada de um efeito cancerígeno e pode causar sensibilização após contato com a pele. - Aspirar o paraformaldeído e lavar as placas duas vezes com PBS A (200 ul / poço).
- Armazenar as placas em PBS A a 4 ° C para uso futuro, ou continuar com os seguintes passos.
- Adicionar tampão de permeabilização (100 ul / poço). Deixe-o em temperatura ambiente por 30 min.
- Lavar a placa duas vezes com PBS A (200 ul / poço).
- Adicionar 50 ul de o primeiro anticorpo, o MAb de rato contra a influenza do tipo A (1: 1000 em tampão de ELISA), por cavidade. Incubar-la à temperatura ambiente durante 1 h (ou durante a noite a 4 ° C), com agitação.
- Lavar 3 vezes em 100 ul de tampão de lavagem (0,05% de Tween 80 em PBS Um, v / v) PER bem. Incubar-la à temperatura ambiente durante 5 min entre as lavagens. Como alternativa, lave-o 3 vezes sem incubação com 300 ul por poço.
- Adicionar 50 ul do segundo anticorpo, anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (H + L) conjugado com HRP (1: 1000 em tampão de ELISA), por cavidade. Incubar-la à temperatura ambiente durante 1 h, com agitação.
- Lavar 3 vezes tal como descrito no passo 1.17.
- Adicionar o substrato (50 ^ l / poço). Incubar-la à temperatura ambiente durante 30 min ou até que o desenvolvimento de uma cor azul é claramente visível.
- Para parar a reacção, lava-se a placa duas vezes com 200 ul de água destilada por poço, incubando à temperatura ambiente durante 2 -3 min entre as lavagens.
- Ar seco a placa e armazená-lo em um local escuro (por exemplo, envolvê-la em papel de alumínio).
2. Titulação quantificação
- Colocar uma placa bem na área de digitalização de um digitalizador de mesa, como mostrado na Figura 2a. Use o limite em forma de L posição deassegurar uma localização óptima e repetível imagiologia.
NOTA: É possível imagem Duas placas de poços em uma varredura. - Digitalizar uma imagem.
NOTA: As definições são apresentadas na Tabela 2. - Executar o software "Wellplate Reader" para calcular a concentração de vírus necessária (Figura 3).
- Clique no botão "Carregar imagem" para carregar uma imagem. Deslize a barra vermelha no histograma da guia "Threshold global" para ajustar o limite de amostragem. Clique no botão "Update" para examinar o efeito na imagem.
- Marque a caixa "Calcular Neutralização / titulação". Clique no botão "Sampling" para quantificar o ICP. Clique no botão "Save" para salvar os resultados de amostragem quando solicitado.
NOTA: Após o processo de amostragem, uma nova janela chamada "neutralização e titulação de cálculo" aparece automaticamente se a caixa "Calcular Neutralização / Titulação" é assinalada. - De carga ou de entrada do mapa definição bem-placa. Indicam o limite (por exemplo, 30%) em "Titulação: população de vírus óptima (%)". Selecione a aba "processo de titulação" para calcular os resultados da titulação. Confira os resultados da titulação. Clique no botão "Save & Close" para salvar os resultados da titulação.
NOTA: Consulte Suplementar S1 para a instrução mais detalhada sobre o software. Uma cópia do software sob medida está disponível mediante solicitação.
NOTA: Normalmente, a melhor diluição do vírus para os rendimentos de ensaio de redução de placa cerca de 50% (20-85%) ICP do total de células dentro de cada poço 11.
Neutralização 3. Virus
NOTA: Calcular o número de placas necessárias para o ensaio de neutralização. Cada placa pode acomodar um vírus e uma série de anti-soros.
NOTA: Dependendo do número de anti-soros e o número de duplicações, uma placa bem pode ser configurado com the flexibilidades seguinte: (1) A diluição do soro podem ser dispostos ao longo de cada linha ou uma coluna (Figura 4). Cada soro deve ocupar uma linha ou coluna separada. (2) O aumento da diluição do soro é flexível, mas deve começar com a concentração mais alta de soro, no canto superior esquerdo de uma placa. (3) O número de duplicados equilibra o número de anti-soros. Mais duplicados pode ajudar a suavizar as variações experimentais. (4) O número de VC e o número de células de controlo (CC) duplicados são flexíveis, mas também deve ser em linhas ou colunas separadas. Espera-se que o número de repetições de VC é significativamente maior do que o dos anti-soros.
- Preparar a monocamada de células, tal como nos passos 1,1-1,3, 2 ou 3 dias de antecedência.
- Adicionar 50 ul de VGM a cada poço da placa.
- Use Colunas 11 e 12 para VC e CC, respectivamente. Adicionar 50 ul de aliquotas de 1:20 enzima destruidora de receptor (RDE) tenha sido tratada com soro para a primeira linha (A) de Columns 1-10.
NOTA: Para cada combinação de vírus e soro, o ensaio é realizado em duplicado, de modo que uma placa pode, por exemplo, conter um vírus testados contra cinco soros. - Executar dois diluições em série por transferência de 50 uL da linha A para a linha H (colunas 1-10 na Figura 4) e descartando 50 ul da linha H.
- Adicionar 50 ul de diluente para cada poço da coluna CC (coluna 12 na Figura 4).
- Adicionar 50 ul do vírus a cada poço da placa, excepto para a coluna CC (colunas 1-11, linhas AH na Figura 4).
- Incubar-lo a 37 ° C durante 2-3 h. Remover o inoculo. Adicionar a sobreposição (200 ul) a cada poço. Incubar durante a noite a 37 ° C, sem ser perturbado. Fix e manchar as placas como para a titulação do vírus (passos 1,11-1,22).
4. Neutralização Quantificação
- Colocar uma placa bem na área de digitalização de um scanner de mesa, como mostrado na Figure 2a. Use o limite em forma de L posição para garantir uma localização óptima e repetível de imagem.
NOTA: É possível imagem Duas placas de poços em uma varredura. - Digitalizar a placa, tal como descrito na etapa 2.2.
- Executar o software "Wellplate Reader" para calcular os títulos virais requeridas (Figura 3, passo 2.3).
- Clique no botão "Carregar imagem" para carregar uma imagem. Deslize a barra vermelha no "Threshold global" para ajustar o limite de amostragem. Clique no botão "Update" para examinar o efeito.
- Marque a caixa "Calcular Neutralização / titulação". Clique no botão "Sampling" para quantificar o ICP. Clique no botão "Save" para salvar os resultados de amostragem quando solicitado.
NOTA: Após o processo de amostragem, uma nova janela chamada "neutralização e titulação de cálculo" aparece automaticamente se a caixa "Calcular Neutralização / Titulação" é assinalada. - De carga ou de entrada o bem-pmapa final. Indicam o limite (por exemplo, 50%) em "Neutralização: dedução Infecção (%)."
- Seleccionar "processo de neutralização" para calcular os títulos. Confira os títulos e clique no botão "Save & Close" para salvar os resultados de neutralização.
NOTA: A neutralização é relatada como o recíproco da diluição mais elevada do soro pré-definido, com a redução ICP (tal como 50% ou 80%) contra o VC (a média da coluna 11 na Figura 4). Uma redução ICP 50% foi usado nos resultados representativos.
Representative Results
Seguindo os procedimentos acima, apresentamos alguns resultados de experimentos recentes caracterização antigênica. A configuração titulação foi concebido para analisar oito vírus de entrada, com duplicatas duplos para cada diluição. As diluições virais foram testados entre 1,0 x 10 -1 e 1,0 x 1,0 -6-se a cobrir as variações entre os vírus. Os vírus de teste eram do subtipo H3N2, incluindo A / Camarões / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moscow / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015, e A / Bratislava / 437/2015. Os resultados da titulação são ilustradas na Figura 5. A Figura 5D mostra a diminuição de PIC com o aumento da diluição do vírus. As curvas foram normalizados contra os ICPs dos mesmos vírus que produziram infecções em todas as células dentro de um poço 12 (definido como a saturação de ICP). Se o ICP não atingir a saturação com a oighest concentração de vírus, a média ICP de duplicatas correspondentes foi usado em vez (A / Moscow / 103/2015, em Figura 5d). As diluições de vírus que produziram 30% de saturação de ICP foram escolhidos como a diluição do vírus de entrada para a neutralização (Tabela 3).
Neutralização destinada a ter uma entrada de vírus contra cinco soros, com duplicatas duplas em cada placa. O vírus de referência mostrado é H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Os cinco anti-soros são A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / África R2665 / 15 South SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, e A / Holandês 525/14 SIAT F23 / 15. Os resultados de neutralização estão ilustradas na Figura 6. A Figura 6d mostra o andamento da infecção com o aumento da diluição do soro. A população positiva normalizada sobre o eixo vertical representa a relação dos ICPs a partir da resposta anti-soros contra o correspondente média ICPdo vírus de referência 12. O ICP fundo de células de controlo não infectadas foi subtraída durante a normalização. Os títulos de neutralização foram determinados como os recíprocos das diluições de anti-soro correspondente a uma redução de 50% ICP (Tabela 4). interpolação linear foi utilizada para estimar os títulos caem entre dois diluições de soro adjacentes.
Figura 1: Exemplo de uma configuração bem-placa numa experiência de titulação de vírus. vírus de teste são atribuídos a linhas separadas (A a H). As colunas são concebidos para diferentes diluições virais (1 a 12). Duas colunas foram usadas como duplicadas para cada diluição virai. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de um sistema de digitalização de amostra. (A) Uma placa de 96 poços na posição de imagem de um digitalizador de mesa (republicado de de Referência 11 com a permissão de Elsevier), e (b) dimensões do limite da posição em forma de L mostrados em (a). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Desktop diagrama do software quantificação "Wellplate Reader". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 4: Exemplo de uma configuração bem-placa numa experiência de neutralização. Cada antisoro é atribuído a duas colunas com duplicados (1 a 10). As linhas são projetados para diferentes diluições de soro (A a H). O controle de vírus leva Coluna 11, com oito repetições (A11 para H11). O controlo de células é na coluna 12, com oito duplicados (A12 a H12). Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: resultados de uma experiência de titulação. (A) A configuração bem-plate, (b) digitalizada bem placa de imagem, (c) Ilustraçãodo, quantificados, codificados população de células-cor infectadas com vírus, e (d) as populações de células infectadas com vírus normalizados contra diluições de vírus. 30% ICP foi usado como o limiar. As barras de erro em (d) são os desvios padrão (SD) das duplicações de amostra (± 1 SD). As barras de escala em (b) e (c) = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: resultados de uma experiência de neutralização. (A) A configuração bem-placa, (b) imagem digitalizada bem-placa, (c) a ilustração do, população de células infectada com vírus quantificada, e (d) população de células infectadas com vírus normalizada contra a diluição de soro. O vi de entradarus (VC) é A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP foi usada para calcular os títulos. As barras de erro em (d) são os desvios padrão (SD) das duplicações de amostra (± 1 SD). As barras de escala em (b) e (c) = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
S1 Suplementar: Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.
| diluição típica | ||
| células MDCK | Células MDCK-SIAT1 | |
| 2 dias | 1: 5 (1 + 4) | 1:10 (1 + 9) |
| 3 dias 1:10 (1 + 9) | 1:20 (1 + 19) | |
| Número típico de células por ml | ||
| células MDCK | Células MDCK-SIAT1 | |
| 2 dias | 2 x 10 5 | 1 x 10 5 |
| 3 dias | 1 x 10 5 | 5 x 10 4 |
Tabela 1: diluições típicas sobre uma subcultura de frascos confluentes de células MDCK ou células MDCK-SIAT1.
| Modo | Modo profissional |
| tipo de documento | Film (com o Guia Area Film) |
| Tipo Auto Exposição | foto |
| Eu estouTipo idade | 24-bit Cor |
| Resolução | 1.200 dpi |
| Formato de imagem salva | TIFF |
Tabela 2: Configuração típica de um scanner de mesa.
| Linha | Vírus | diluição recomendada |
| UMA | A / Cameron / 15V-3538/2016 | 1,0 x 10 -2 |
| B | A / Vladivostok / 36/2015 | 1,0 x 10 -3 |
| C | A / Moscow / 103/2015 | 1,1 x 10 -1 |
| D | A / Tomsk / 5/2015 | 5,9 x 10 -1 |
| E | A / Moscow / 101/2015 | 8,3 x 10 -1 |
| F | A / Moscow / 100/2015 | 1,4 x 10 -2 |
| G | A / Moscow / 133/2015 | 1,3 x 10 -2 |
| H | A / Bratislava / 437/2015 | 1,3 x 10 -4 |
Tabela 3: diluições virais calculados a partir de uma população de 30% ICP.
| Coluna | Os anti-soros | título recomendado |
| 1 - 2 | A / HK4801 / 2014 | 110 |
| 3-4 | A / HK7295 / 2014 | 213,3 |
| A / África do Sul / R2665 / 2015 | 2155,8 | |
| 7-8 | A / Suíça / 9715293/2013 | 89,4 |
| 9-10 | A / Holanda / 525/2014 | 78,6 |
Tabela 4: Os títulos em 50% ICP de A / Stockholm / 63/2015 contra o anti-soros.
Discussion
Neste estudo, descrevemos um ensaio MN baseada em imagem para quantificar as verdadeiras relações antigênicas entre vírus. Em comparação com outros ensaios de redução da placa, o método de medição enfatiza o ICP de um poço inteiro, assegurando a cobertura completa da população infecciosa. A independência da formação de placas também se alarga a aplicação do ensaio de vírus que podem formar pequenas placas essencialmente invisíveis ou que só pode controlar a infecção de uma única célula. Portanto, o ensaio é capaz de examinar mais vírus e os efeitos de uma ampla gama de anticorpos do que HI, e que ajuda a reflectir de forma mais abrangente as semelhanças ou diferenças entre os vírus 12 antigênicas. Por exemplo, quando carboxilato de oseltamivir está incluído, o ensaio MN é menos afectado pela NA-ligação dependente, refletindo as diferenças antigênicas com mais precisão. Durante o desenvolvimento do ensaio, foram feitos grandes esforços para melhorar a consistência experimento, a velocidade, e a detecçãosensibilidade, inclusive por meio do controle de vírus de entrada através de titulação quantificada, imagens em alto rendimento com um scanner de mesa, e implementação de uma plataforma de processamento de dados user-friendly. Os resultados têm sido geralmente consistente com e confirmou os da HI. Notavelmente, os resultados também revelaram diferenças antigênicas entre variantes de deriva antigênicas dos vírus recentes do tipo A e vacinas B, assim como as mudanças antigênicas causadas por mudanças selecionadas de cultura ou esporádicos, como a substituição G155E em HA1 de certas (H1N1) vírus pdm09 A 12.
O protocolo combinava com o vírus tipo ou subtipo com a selecção de linhas celulares que deram a infecção mais forte, que melhorou substancialmente o sinal de imagem. variação experimental foi alisado com o design de duplicados que em relação com o número de anti-soros testados. Incertezas também pode vir de a qualidade da imagem, que é influenciado principalmente pelo dispositivo de imagem. Uma cor scanner de mesa decente pode signivamente melhorar o contraste de imagem e reduzir o ruído. A quantidade de vírus de entrada na neutralização deve ser quantitativamente determinado previamente a partir da titulação correspondente enquanto os vírus ainda manter um estado semelhante. Durante a neutralização, a resposta anti-soro a uma infecção é normalizada contra a diferença entre o vírus de referência (VC) e o nível de fundo (CC). medições precisas de VC e CC são essenciais para uma experiência de neutralização. Mais duplicatas são recomendados (oito duplicatas foram utilizados nos resultados representativos). Finalmente, compreendendo o software é vital para o sucesso de uma experiência. O software foi testado para a caracterização do vírus de rotina no Centro de Influenza da OMS, Reino Unido por mais de dois anos. As instruções detalhadas para o tratamento de várias situações é fornecido no S1 suplementar.
Este ensaio de manganês é adequado para aplicações em que as amostras cobrem uma extgrande campo remely de vista, mas só exigem resolução de imagem moderada. O baixo custo ea configuração simples tornar o sistema prontamente disponível para a maioria dos laboratórios de virologia. A variação nas medidas de uma mesma amostra foi inferior a 3%, ou menos, que define a incerteza introduzida durante o varrimento 11. Tal reprodutibilidade é suficiente em muitos estudos virológicos e pode ser ainda mais reduzida pela média imagens de vários exames.
Em conclusão, este estudo demonstra um ensaio MN robusto que pode ser utilizado rotineiramente em estudo antigênica e para suportar dados HI em análises detalhadas de vírus da gripe actualmente em circulação, nomeadamente para a seleção semestral do vírus para inclusão em vacinas contra a gripe humana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl 10 g, KCl 0.25 g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g, and Dist. Water 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4 g in 100 ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2x DMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10 ml/plate): | 5 ml 2x DMEM, Trypsin 2 μg/ml final concentration, Avicell 5 ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1,000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
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