Alla experiment på djur har utförts i enlighet med de godkända djurskötsel och använda riktlinjerna i Animal Care kommittén, Radboud University Medical Centre, Nederländerna, (RU-december-2011-021, protokollnummer: 77.073). 1. Glia Cell Isolering och kultur OBS: Protokollet presenteras här bygger på det arbete som McCarthy och de Vellis 19, och en mycket likartad detaljerat protokoll för mus astrocyter finns 20. För att generera primära kulturer av kortikala astrocyter från embryonala (E18) råtthjärnor, behöver en gravid råtta offras, embryona måste skördas från livmodern, och hjärnan måste isoleras från embryon. För att fylla en T75 kolv, cortex från 2 embryonala hjärnor behöver kombineras. Som ett alternativ, kan kommersiellt tillgängliga renade och frysta astrocyter köpas. Förbered T75 odlingskolv Späd Poly-D-lysin (PDL) isterilt, ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 10 mikrogram / ml. Tillsätt 5 ml av den utspädda PDL till T75 odlingskolv. Swish runt försiktigt för att väta hela odlingsytan. Placera kolven i en fuktad 37 ° C inkubator under 3 h. Aspirera PDL från kolven. Skölj kolven 3x med 5 ml sterilt vatten för att avlägsna obundet PDL. Aspirera vattnet helt. Låt kolven torka i ett dragskåp med laminärt flöde eller användas omedelbart. Dissektion av cortex Förbered 50 ml dissektion medium: Lebovitz s L-15 medium med 2% (volym / volym) B-27 tillägg. Håll på is. Söva råttan djupt med isofluran i en induktionskammare (små Plexiglas rutan) tills andning upphör (~ 5-8 min). Ta råtta från induktionskammare och omedelbart avlivas genom cervikal dislokation. Spraya buken hos råtta med 70% EtOH och torka bort överskottet. Exponera och ta bort livmodern från dammen via kejsarsnitt avspå att använda en sax 21. Skär enskilda embryon från deras fostervatten säckar med sax, överföring till en steril petriskål fylld med kallt dissektion medium och hålla på is. Överföra embryon igen till en ny, steril 6 cm petriskål fylld med kallt dissektion medium. Utdrag hjärnor från embryona under ett stereomikroskop. Att exponera hjärnan försiktigt skala bort huden och skallen med pincett. Försiktigt ösa ut hela hjärnan och överför till en 35 mm petriskål med färskt, kallt dissektion medium. OBS: Hela hjärnor dissekerades från embryon kan lagras i dissektion medium på is i flera timmar utan att förlora cellulär viabilitet. Separera de två halvkloten av varje hjärna genom att skära genom mittlinjen med fina spets fjäder sax eller en skalpell. Försiktigt strippa hjärnhinnorna med raka spetsig pincett. OBS: Det är mycket viktigt att avlägsna hjärnhinnorna helt. thär förhindrar förorening av astrocyternas kultur fibroblast. Fibroblaster snabbt delande celler och kommer så småningom tränga undan de andra cellerna. Ta bort mitthjärnan / striatum och luktbulben med fjäder sax eller en skalpell. Se också till att ta bort hippocampus (C-formad struktur som är perimedian och caudal i förhållande till cortex) med fjäder sax eller en skalpell. Samla in de kortikala halvklot i ett 15 ml centrifugrör fylld med 5 ml dissektion medium. Håll på is. Dissociation av cortex Förbereda 2 ml Ca2 + / Mg2 + -fri Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med 0,25% trypsin (dissociation medium). Förbered 50 ml hög-glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 15% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin (odlingsmedium) och filtrera sterilisera. Låt vävnaden sedimentera till botten av centrifugröret. noggrant sompirat så mycket av dissekering mediet som möjligt från ovan vävnaden. Tvätta vävnaden med 5 ml Ca2 + / Mg2 + -fri HBSS (utan trypsin) och låt vävnaden sedimentera på botten av röret. Försiktigt aspirera HBSS. Tillsätt 2 ml dissociation medium och skaka röret försiktigt för att blanda enzymet runt vävnaden. Inkubera i en 37 ° C vattenbad under 5-10 min. Flick röret några gånger under inkubationen för att agitera vävnaden. Omedelbart mal sönder vävnad med hjälp av en 1000 mikroliter pipettspets. Ställa pipett volymen till ca 800 mikroliter. Aspirera bitarna och mata ut kraftfullt mot den sida av röret, direkt ovanför vätskeledningen. Försök dock att minimera bubblor eller skum. Upprepa tills vävnaden är tillräckligt dissocieras, ca 15 – 20x. Lägg 8 ml odlingsmedium för att inaktivera trypsin. Blanda försiktigt genom att vända röret flera gånger. Passera cellsuspensionen genom en 70 | im cellfilter placerades på toppen av en 50 mL centrifugrör. Skölja 15 ml rör med odlingsmedium och filtrera mediet genom cellen sil för att samla mediet i 50 ml rör med cellsuspensionen. Skölj cellfilter några gånger med odlingsmedium. Efter sköljning, bör den slutliga volymen vara ungefär 20-25 ml. Pelletera cellerna vid 200 xg under 10 min. Försiktigt aspirera så mycket mediet som möjligt, utan att vidröra cellpelleten. Resuspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium med hjälp av en 1000 mikroliter pipett. Lägg till 11 ml förvärmt odlingsmedium och blanda försiktigt (för att förhindra bubblor) med en 10 ml pipett. Skölj PDL belagda T75-flaska en gång med 5 ml odlingsmedium. Aspirera mediet och överför cellsuspensionen till kolven. Alla celler är i suspensionen stryks, och vi tycker att det är i allmänhet onödigt att räkna dem, eftersom astrocyter inte kan skiljas från andra celler i suspensionen. Placera kolven i en befuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 feller två dagar. Utbyggnad och underhåll av de astrocyter Ersätta hela mediet för första gången 2 d efter initial plätering. Byt ut hela mediet efteråt var 3 d. Förvärm alltid färskt medium till 37 ° C före tillsats till cellerna. OBS! Astrocyter kräver 7-10 d att uppgå till cirka 90% konfluens (astrocyterna visas som en tätt packad mosaikmonolager, med mikroglia och oligodendrocyter ligger ovanpå och blandas). När astrocyter uppgå till cirka 90% konfluens, skaka kolven för att avlägsna kontaminerande gliaceller: Ta kolven ur inkubatorn och dra locket (fenol) eller täcka porten (filtrerade). För att ta bort mikroglia, skaka kolven på en orbital plattform vid 180 rpm under en timme. Aspirera mediet. Skölj en gång med 5 ml förvärmda odlingsmedium, aspirera och ersätta med 12 ml odlingsmedium. Att ta bortde oligodendrocyter tillbaka kolven till omlopps plattform och skaka vid 250 rpm, 37 ° C under minst 7 timmar, men företrädesvis O / N. Aspirera mediet. Skölj en gång med 5 ml förvärmda odlingsmedium, aspirera och ersätta med 12 ml odlingsmedium. Återgå kolven till inkubatorn. När 100% konfluenta, delbart astrocyterna användning av standardförfaranden i ett förhållande av 1: 3 till 1: 2 med 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA). En T75 kolv vid 100% konfluens typiskt ge ca 4,0 x 10 6 celler totalt. Enligt detta schema, kan kulturerna typiskt delas en gång per vecka. OBS: När astrocyter når konfluens, kan de skördas och användas för hiPSC differentiering som beskrivs nedan i protokoll steg 3,4. Astrocyterna kan delas åtminstone en gång utan märkbar förlust av livsduglighet. De kan bibehållas under upp till 2 månader i odling. Av erfarenhet, primära embryonala dag 18 rått astrocyter progressively bli terminalt differentierade och / eller förlora viabilitet efter upprepad delning. Även om det är möjligt att frysa astrocyter för framtida bruk, föredrar vi att isolera astrocyter från färska embryonala hjärnor när det behövs. 2. Framställning av rtTA / Ngn2 -positivt hiPSCs OBS: hiPSCs används för våra experiment genererades internt av Lentiviral transduktion av humana fibroblaster med omprogrammering faktorer cMYC, Sox2, Oct4 och Klf4. OBS: För generering av rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs, är lentivirala vektorer som används för att stabilt integrera transgenerna i genomet hos de hiPSCs. Protokollet för framställning av den lentivirus har tidigare 22 publicerats. Närmare uppgifter om de lentivirala förpackningar vektorer som används för att producera lentivirus partiklar rtTA och Ngn2 finns i <sTrong> Table of Materials / utrustning. Överföringsvektorn som används för få den rätta lentivirus är pLVX-EF1α- (Tet-On-Advanced) -IRES-G418 (R); dvs denna vektor kodar för en Tet-On Avancerad trans under kontroll av en konstitutiv EF1a promotor och ger resistens mot antibiotikumet G418. Överföringsvektorn som används för Ngn2 lentivirus är pLVX- (TRE-thight) – (MOUSE) Ngn2-PGK-Puromycin (R); dvs denna vektor kodar genen för murin neurogenin-2 under kontroll av en Tet-styrd promotor och puromycinresistensgenen under kontroll av en konstitutiv PGK-promotorn. Därför, genom att använda dessa två överföringsvektorer, kan skapas en hiPSC linje för vilken uttrycket av murin neurogenin-2 kan induceras genom att komplettera mediumet med doxycyklin. För transduktion av de hiPSCs supernatanten med lentivirus partiklar används (kallat "lentivirus suspension" i återstoden av texten), dvs. without koncentrera partiklarna med hjälp av ultracentrifugering. Skylten hiPSCs (dag 1) OBS: De volymer som anges i detta protokoll anta att hiPSCs odlas i ett 6-brunnars platta och att cellerna i en brunn skördas. Dessutom antas det att cellerna pläteras därefter i 12 brunnar i en 12 brunnars platta. Förbered 10 ml kall DMEM / F12 med 1% (vol / vol) Basement Membrane Matrix (BMM) för att erhålla utspädd BMM. Tillsätt 800 mikroliter utspädd BMM per brunn i en 12 brunnar. Inkubera under åtminstone 1 h i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Före användning, inkubera plattan under 1 h vid RT. Varm 15 ml Essential 8 (E8) medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin, 9 ml DMEM / F12 och 1 ml celllösgörlösning (CDS) till rumstemperatur. Komplettera E8 medium med Rho-associerat proteinkinas (ROCK) inhibitor. Aspirera det använda mediet av hiPSCs end Tillsätt 1 ml CDS till hiPSCs. Inkubera 3-5 min i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Kontrollera under mikroskop huruvida cellerna lossnar från varandra. Tillsätt 2 ml DMEM / F12 i brunnen försiktigt suspendera cellerna med en 1000 mikroliter pipett och överföra celler till en 15 ml rör. Lägg 7 ml DMEM / F12 till cellsuspensionen. Snurra cellerna vid 200 xg under 5 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml av beredd E8 medium. Erhålla en cellsuspension i vilken de hiPSCs dissocieras (bildar inte cellklumpar) genom att sätta spetsen av en 1000 mikroliter pipett mot den sida av 15 ml rör och återsuspendering av cellerna försiktigt. Kontrollera under mikroskop om cellerna dissocieras. Bestäm antalet celler (celler / ml) med hjälp av en hemocytometer kammaren. OBS: En sex brunnar väl vid 80 – 90% sammanflytning kommer typiskt att ge 3,0 – 4,0 x 10 6 celler totalt. Aspireraden utspädda BMM från brunnarna i 12-brunnsplatta. Späd cellerna för att erhålla en cellsuspension av 3,0 x 10 4 celler / ml. Plattan 1 ml av cellsuspensionen per brunn i 12 brunnars platta. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Omvandla de iPS-celler med rtTA och Ngn2 lentivirus (dag 2) Varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till rumstemperatur. Komplettera E8 medium med ROCK-inhibitor och polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml till E8 mediet. Tina portioner med lentivirus fjädring. Lägg polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml till lentivirus suspensionen. Aspirera det använda mediet och tillsätt 1 ml av beredd E8 medium till varje brunn. Utför transduktion med olika mängder av få den rätta – och Ngn2 -lentivirus suspensioner. Till exempel, transduCE hiPSCs genom att tillsätta 100 mikroliter av både få den rätta -lentivirus och Ngn2 -lentivirus suspensionen till en brunn på 12 brunnar. För andra brunnar, använder 200 mikroliter, 300 mikroliter, 400 mikroliter och 500 mikroliter lentivirus fjädring i stället för 100 mikroliter. De hiPSCs av två brunnar i 12 brunnar bör inte omvandlas; de kommer att tjäna som kontroller under valet. OBS: De transduktioner är företrädesvis i två exemplar, så att omvandlingseffektiviteten kan uppskattas mer exakt efter starten av markeringen (se protokoll steg 2.2.4). Mängden lentivirus fjädring som krävs för att effektivt transducera majoriteten av hiPSCs beror på titern av lentivirus suspensionen och hiPSC linje som används. I denna studie, oftast använder vi 100 – 500 mikroliter av lentivirus fjädring för att omvandla de hiPSCs. Placera 12 brunnar i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under 6 timmar. Före slutet av den 6 h inkubationsperioden, varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin och 12 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) till RT. Komplettera E8 medium med ROCK-hämmare. Aspirera det använda E8 medium. Tvätta varje brunn med en ml DPBS. Tillsätt 1 ml av beredd E8 medium till varje brunn. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Uppdatera E8 medium (dag 3) Varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till RT. Aspirera det använda mediet från brunnarna i 12 brunnar och tillsätt 1 ml av det beredda E8-medium till varje brunn. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Utför val med puromycin och G418 (dag 4-8) OBS! Beroende på celldelningshastigheten av höftenSC linjen och effektivitet Lentiviral transduktion, kan cellerna når 70-80% konfluens under urvalsperioden, vid vilken tidpunkt kulturerna måste delas. Eftersom tidpunkten för uppdelningen inte kan förutses i förväg, kommer det inte att nämnas i protokollet. Men istället för att uppdatera den E8-medium kompletterat med de nämnda koncentrationerna av puromycin och G418, kan en dela upp hiPSC kulturen som en normal hiPSC kultur (inklusive utstrykning av celler på vitronektin-belagda plattor). Det enda undantaget är att E8 medium bör kompletteras med de nämnda koncentrationerna av antibiotika för att fortsätta valet. Varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till rumstemperatur. Lägg puromycin och G418 för selektion; olika mängder av de antibiotika tillsätts under perioden val (tabell 1). Uppskatta effektiviteten av transduktion genom att uppskatta procentandelen av G418- och puromycin-resistenta celler. För att uppskatta andelen resistenta celler, uppskatta andelen döda celler (nonresistant celler) för de olika villkor (kulturerna omvandlade med olika mängder av lentivirus fjädring) och för de nontransduced celler (cellerna som fungerar som ett urval kontroll). Beräkna procentandelen av resistenta celler som [100% – (procent av döda celler)]. OBS: Om transduktioner med olika mängder av lentivirus fjädring utfördes i duplikat, kan transduktion effektiviteten mer exakt uppskattas. Beskaffenheten med de icke-transducerade celler tjänar som en markering kontroll; procentsatserna för döda celler för odlingarna omvandlade med olika mängder av lentivirus fjädring bör vara lägre. Uppskattad procentandel av resistenta celler används för att välja de hiPSCs som sannolikt positivt för båda transgener. I allmänhet väljer vi de hiPSCs från transduktion villkoret var> 90% av cells överleva 5 d urvalsperioden. Aspirera det använda mediet av de hiPSCs och tillsätt 1 ml av det beredda E8-medium till brunnarna. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Slutlig koncentration av G418 Slutlig koncentration av puromycin dag 4 250 | j, g / ml 2 | ig / ml dag 5 250 | j, g / ml 2 | ig / ml dag 6 250 | j, g / ml 1 | j, g / ml dag 7 250 | j, g / ml 1 | j, g / ml dag 8 250 | j, g / ml 1 | j, g / ml Tabell 1: koncentrationer av antibiotika under urvalsperioden. </stRong> Koncentrationer av puromycin och G418 under 5d av urvalsperioden. Stoppa val och börja regelbunden odling (dag 9 och senare) Efter 5 d urvalsperioden, kultur få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs som normala hiPSCs, med det undantaget att den E8 mediet av cellerna kompletteras med G418 till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml och med puromycin till en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml. OBS: Cellerna kan nu frysas (enligt standardprotokoll för kryokonservering av celler) för att fungera som en backup. Detta är ett viktigt steg för reproducerbarhet differentiering protokollet, eftersom det tillåter användning av samma parti rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs för många framtida differentieringsexperiment. 3. Differentiering av rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs till nervceller på sex brunnarMEA och täckglas OBS: I detta protokoll är de uppgifter som anges för differentiering rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs på två olika substrat, dvs sex brunnar MEA (enheter bestående av 6 oberoende brunnar med 9 inspelning och en referens inbäddade mikroelektroder per brunn) och täckglas i brunnarna på en 24-brunnars platta. Protokollen kan emellertid enkelt anpassas för större substrat (t.ex. för brunnarna i 12- eller 6-brunnsplattor), genom ökning av de nämnda värdena enligt ytan. Förbered MEA eller glastäck (dag 0 och dag 1) Dagen före starten av differentiering, sterilisera MEA i enlighet med tillverkarens rekommendation. Späd adhesionsproteinet Poly-L-Ornithine (PLO) i sterilt ultrarent vatten till en slutlig koncentration 50 | ig / ml. Coat den aktiva elektrodarean av sex brunnar MEA genom att placera en 100 mikroliterdroppe av den utspädda PLO i varje brunn. Placera täckglasen i brunnarna i 24-brunnar med användning av sterila pincetter. Tillsätt 800 mikroliter av den utspädda PLO i varje brunn. Förhindra täck flyter genom att trycka ner dem med 1000 mikroliter pipettspetsen. Inkubera 6-brunnars MEA och 24-brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Nästa dag, aspirera utspädda PLO. Tvätta glasytorna hos de sex-brunnars MEA och täckglasen två gånger med sterilt ultrarent vatten. Späd laminin i kall DMEM / F12 till en slutlig koncentration av 20 mikrogram / ml (för de sex-brunnars MEA) och 10 mikrogram / ml (för glastäckglas). Omedelbart belägga den aktiva elektrodarean av de 6-brunnars MEA genom att placera en 100 mikroliter droppe i varje brunn. På liknande sätt, tillsätt 400 mikroliter av den utspädda laminin i varje brunn i 24-brunnsplatta för att belägga täckglas. Förhindra täck flyter genom att trycka ner dem med 1000 mikroliter pipettspetsen. Inkubera 6-brunnars MEA och 24 brunnar i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under åtminstone 2 h. Skylten hiPSCs (dag 1) OBS: Volymerna som nämns i steg 3.2.1 – 3.2.4 antar att få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs odlas i en 6-brunnar och att cellerna i en brunn skördas. De volymer som krävs för plätering av cellerna på 6-brunnars MEA och / eller täckglasen beror på antalet 6-brunnars MEA och / eller antalet täckglas som används i experimentet; siffrorna som anges i steg 3.2.6 – 3.2.8 tillåter skalning till olika experiment storlekar. Varma DMEM / F12, CDS och E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin R / T. Lägg doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 mikrogram / ml och ROCK-inhibitor till E8 mediet. Aspirera det använda mediet av få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs och tillsätt 1 mL CDS till hiPSCs. Inkubera 3-5 min i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Kontrollera under mikroskop huruvida cellerna lossnar från varandra. Tillsätt 2 ml DMEM / F12 i brunnen försiktigt suspendera cellerna med en 1000 mikroliter pipett och överföra celler till en 15 ml rör. Lägg 7 ml DMEM / F12 till cellsuspensionen. Snurra cellerna vid 200 xg under 5 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml av beredd E8 medium. Dissociera hiPSCs genom att sätta spetsen av en 1000 mikroliter pipett mot den sida av 15 ml rör och återsuspendering av cellerna försiktigt. Kontrollera under mikroskop om cellerna dissocieras. Bestäm antalet celler (celler / ml) med hjälp av en hemocytometer kammaren. ANMÄRKNING: En 6-brunnars platta brunn vid 80-90% konfluens kommer typiskt att ge 3,0 – 4,0 x 10 6 celler totalt. Sug upp det utspädda laminin. För sex brunnar MEA, späd cellerna för att erhålla en cell suspension av 7,5 x 10 5 celler / ml. Platta cellerna genom tillsats av en droppe av 100 mikroliter av cellsuspensionen på den aktiva elektrodarean i varje brunn i 6-brunnars MEA. För täckglas, späd cellerna för att erhålla en cellsuspension av 4,0 x 10 4 celler / ml. Platta cellerna genom att tillsätta 500 mikroliter av cellsuspensionen till brunnarna i 24-brunnars platta. OBS: Den slutliga celldensiteten på MEA är högre än på täckglas (Figur 1A och B). Vi fann att denna höga celltätheten krävdes för korrekt inspelning av nätverksaktivitet. I protokollet, siffrorna tillhandahålls som visade sig vara optimalt för analyserna. Placera 6-brunnars MEA och 24 brunnar i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under 2 h (MEA) eller O / N (24 brunnsplatta). Efter 2 h, tillsätt försiktigt 500 mikroliter av den beredda E8 medium till varje brunn i 6-brunnars MEA. Placera 6-vill MEA O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Ändra mediet (dag 2) Nästa dag, förbereda DMEM / F12 med 1% (volym / volym) N-2 supplement, 1% (v / v) icke-essentiella aminosyror och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin. Lägg humant rekombinant neurotrofin-3 (NT-3) till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, humant rekombinant hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, och doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 ^ g / mL. Värma mediet till 37 ° C. Lägg laminin till en slutlig koncentration av 0,2 mikrogram / ml till mediet. Filtrera den resulterande mediet. Aspirera det använda mediet från brunnarna i 6-brunns MEA och 24-brunnar och ersätta det med det färdiga mediet. Inkubera 6-brunnars MEA och 24-brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Lägg råtta astrocyter (dag 3) <br/> OBS! Volymer som nämns i detta protokoll anta att rått astrocyter odlas i T75 odlingskolvar. Det är viktigt att rått astrocyter som läggs till odlingarna är av god kvalitet. Vi använder två kriterier för att kontrollera om de rått astrocyter är av god kvalitet. För det första bör råtta astrocyternas kultur kunna växa sammanflytande inom tio dagar efter det att isoleringen från råtta embryonala hjärnor. För det andra, efter en delning råttan astrocyt kulturen bör de rått astrocyter att kunna bilda ett konfluent, tessellated monoskikt (figur 1C). Om råttan astrocyternas kultur inte uppfyller dessa två kriterier, rekommenderar vi att inte använda denna kultur för differentieringsexperiment. Varm 0,05% trypsin-EDTA till RT. Värma DPBS och DMEM / F12 med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till 37 ° C. Aspirera det använda mediet av råtta astrocyternas kultur. Tvätta kultur genom att tillsätta 5 ml DPBS och swish runt försiktigt. Aspiråt DPBS och tillsätt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Swish trypsin-EDTA runt försiktigt. Inkubera i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under 5 – 10 min. Kontrollera under mikroskop om cellerna är fristående. Lossa de sista cellerna genom att träffa kolven några gånger. Tillsätt 5 ml av DMEM / F12 till kolven. Finfördela cellerna försiktigt i kolven med en 10 ml pipett. Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör. Snurra röret vid 200 xg under 8 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml DMEM / F12. Bestäm antalet celler (celler / ml) med hjälp av en hemocytometer kammaren. Lägg 7,5 x 10 4 astrocyter per brunn av de 6-brunnars MEA. Lägg 2,0 x 10 4 astrocyter per brunn i 24-brunnar. Inkubera MEA och 24-brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Ändra mediet (dag 4) <li> Förbered Neurobasal-medium med 2% (volym / volym) B-27 supplement, 1% (volym / volym) L-alanyl-L-glutamin och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin. Lägga NT-3 till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, BDNF till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, och doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 | ig / ml. Dessutom, tillsätt cytosin β-D-arabinofuranosid till en koncentration av 2 ^ M. OBS: Cytosine β-D-arabinofuranosid sättes till mediet för att inhibera astrocyt proliferation och för att döda de återstående hiPSCs som inte differentierar till neuroner. Filtrera mediet och värm till 37 ° C. Aspirera det använda mediet från brunnarna i 6-brunns MEA och 24-brunnar och ersätta det med det färdiga mediet. Bibehålla de 6-brunnars MEA och 24-brunnar i en befuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Uppdatera medium (dag 6-28) OBS: Från dag 6, uppdatera halvav mediet varannan dag. Från dag 10 och framåt, är det medium som kompletterats med FBS för att stödja astrocyt viabilitet. Förbereda Neurobasal-medium med 2% (volym / volym) B-27 supplement, 1% (volym / volym) L-alanyl-L-glutamin och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin. Lägga NT-3 till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, BDNF till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, och doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 | ig / ml. Från dag 10 och framåt, också komplettera mediet med 2,5% (volym / volym) FBS. Filtrera den resulterande mediet och värm till 37 ° C. Ta hälften av det använda mediet från brunnarna i 6-brunns MEA och 24-brunnar med hjälp av en 1000 mikroliter pipett och ersätta det med det färdiga mediet. Bibehålla de 6-brunnars MEA och 24-brunnar i en befuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. 4. Upprätta neurofysiologiska profil hiPSC härledda neuroner OBS: Två till tre veckor efter den iproduktion av differentiering kan hiPSC-härledda neuroner användas för olika analyser nedströms. I detta avsnitt ges exempel på några efterföljande analyser ges som kan utföras för att fastställa neurofysiologisk profilen av hiPSC-härledda neuroner. Karakterisera neuronala nätverksaktivitet med hjälp av MEA Record 20 min av elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-härledda neuroner odlade på MEA. Under inspelningen, hålla temperaturen vid 37 ° C, och förhindra avdunstnings- och pH-förändringar av mediet genom uppblåsning av en konstant, långsamt flöde av befuktad gas (5% CO2, 20% O2, 75% N2) på MEA . Efter 1200X förstärkning (MEA 1060, MCS), sampla signalen på 10 kHz med hjälp av MCS datainsamlingskort. Analysera data (spik och brast detektions) med en anpassad mjukvara 23. Karakterisera encelliga elektrofysiologiska aktivitet </strong> Överför täckglas som innehåller hiPSC-härledda neuronala kulturer till en nedsänkt fast steg inspelning kammare i en upprätt mikroskop. Record 20 min spontana aktionspotential framkallade postsynaptiska strömmar (sEPSC) 24. Identifiera den synaptiska händelsen med neurovetenskapliga program. Karakterisera neuronala morfologi och synapsin uttryck Fix och färga hiPSC-härledda neuroner för MAP2, synapsin-1/2, och PSD-95 22, 24, 25. Kvantifiera antalet synapsin-1/2 och PSD-95 puncta använder bildanalysmjukvara.