我们修改和实施描述人类诱导多能干细胞(iPS细胞)的快速,可重复,高效分化成兴奋皮层神经元12先前公布的协议。具体地讲,我们的修改允许对神经元细胞密度和使用的控制上的微电极阵列以测量在网络级电生理特性。
从人类诱导多能干细胞来源的神经元(iPS细胞)为研究神经系统疾病有前途的新工具。在过去的十年中,用于区分人iPS细胞向神经元的许多协议已被开发出来。然而,这些协议通常具有较高的变异性,重复性低,效率低下缓慢。此外,这些协议中得到的神经元通常未成熟和缺乏无论是在单细胞和网络电平足够功能活性除非神经元是几个月中培养。部分由于这些限制,hiPSC衍生神经元网络的功能性质仍然没有得到很好的表征。在这里,我们适应最近公布的协议,说明产量从iPS细胞人的神经元的转录因子神经元素- 2 月12日被迫表达。这个协议是快速(产生3周内成熟神经元)和高效,具有transduc近100%的转换效率编细胞(> DAPI阳性细胞95%是MAP2阳性)。此外,该协议产生兴奋性神经元,将允许对神经障碍的细胞类型的具体贡献的调查的均质群体。我们通过产生稳定转导hiPSC细胞,让我们在神经元的总数显式控制修改的原始协议。然后将这些细胞用于生成微电极阵列hiPSC衍生的神经元网络。以这种方式,hiPSC衍生的神经元网络的自发电生理学活性可以测量和表征,而在细胞密度方面保持interexperimental一致性。所提出的协议是广泛适用的,尤其是对人类神经元网络的机械和药理研究。
人类诱导多能干细胞(iPS细胞)分化的协议的发展, 在体外产生提供了用于研究神经系统疾病一个强大的新工具的人类神经元。直到最近,这些疾病的研究受到严重缺乏使用人类神经元模型系统的阻碍。虽然啮齿类动物可用于研究神经系统疾病,这些研究的结果不能容易地转换为人类1。鉴于这些限制,hiPSC衍生的神经元是可以用来阐明分子机制神经障碍和用于体外药物筛选一个有前途的替代模型。
在过去的十年中,多个协议转换人iPS细胞向神经元已经开发2-8。但是,这些协议在许多方面仍然受到限制。首先,协议通常费时:有足够的成熟产生的神经元( 即 synap本身形成)和功能活动需要培养程序,这使得很难9大规模研究个月。此外,hiPSC到神经元的转换效率是低的。协议通常产生神经元的异质群体,并因此不允许神经元细胞的特定亚群的研究。此外,该协议是不可复制的,产生不同的结果,不同的iPSC系10,11。最后,成熟阶段,将所得神经元的功能性质也是可变的10。
为了解决这些问题,Zhang 等。 (2013)12开发的,通过过表达转录因子神经元素-2快速,可重复产生的iPS细胞的神经元人类的协议。所报告的作者,分化发生相对快速地(仅2 – 诱导神经元素-2的表达后3周),该协议是可重复的(神经元特性独立于的Starting hiPSC线),以及hiPSC到神经元的转换效率高(几乎100%)。与他们的协议产生的神经元的人口均匀(类似上层皮层神经元),允许神经元疾病的细胞类型的具体贡献进行调查。此外,它们的hiPSC衍生神经元仅20天之后显示出成熟的属性( 例如 ,能力,以形成突触和健壮的功能活性)。
在网络层面表征hiPSC衍生神经元的电生理特性是hiPSC技术面前的一个重要的先决条件可以为人类疾病的研究中被利用。出于这个原因,许多研究小组最近开始探讨采用微电极阵列(MEA)的设备(多声道系统,Reutlingen,德国)13-16在网络级干细胞衍生的神经元。一个MEA的电极嵌在其上的神经元细胞可以培养的基板。的MEA可以用来探索神经网络和它们的活性的体外发育的电生理特性。目前,多边环境协定仅用于与需要几个月的时间来产生成熟的网络协议的分化组合。因此,具有快速分化方案相结合的多边环境协定应有助于神经系统疾病的大规模研究中使用这种技术。
这里,我们提出的Zhang 等人的修改。 (2013年)12协议,使其适用于多边环境协定中使用。特别是,而不是依赖于急性慢病毒转导,我们转而创建hiPSC线诱导分化前稳定表达rtTA / Ngn2。我们这样做主要是为了具有在神经元细胞密度重现的控制中,由于神经元细胞密度为神经网络形成的关键,并且为神经元和MEA 17,18的电极之间的良好接触。 Althoug小时张某等人。协议是非常有效的相对于转导人iPS细胞的转化,这是相对于神经元从人iPS细胞的数目的最终产率镀最初(见图2E在Zhang 等人 )12固有的变量。凭借稳定的线路,我们消除了许多问题引起的变异,如慢病毒毒性和感染效率。然后,我们优化的可靠地生产多边环境协定hiPSC派生的神经元网络的参数,获取网络的成熟( 如 ,涉及到广大渠道同步事件)的第三周。这种快速和可靠的协议应该使来自不同( 即患者特异性)hiPSC线以及用于药理学研究提供健壮一致性来源的神经元之间的直接比较。
在这里,我们已经实现了由张等人发表了高效的hiPSC分化协议。 (2013年)12用于测量多边环境协定hiPSC衍生神经元网络的网络活动。我们通过创建诱导神经元分化之前rtTA / Ngn2阳性hiPSC线调整原来的协议。此附加的步骤使我们能够控制在MEA的神经元细胞密度。控制了神经元密度是一个重要的先决条件适应协议的MEA和确保一致性。来测量使用的MEA的神经元网络的活性,神经元需要以形成直接在MEA电极17,18的顶端密集网络。这必然需要在神经元的铺板密度严密控制。该rtTA / Ngn2阳性hiPSC线实现了神经元密度,因为这种战术不依赖于人iPS细胞分化前急性慢病毒转导的控制;因此rtTA / Ngn2阳性hiPSC线几乎消除在最终产率的任何变化,由于,例如,慢病毒毒性和可变感染效率。
的实验步骤的另一关键步骤是大鼠星形胶质细胞被共培养与分化人iPS细胞的数目。星形胶质细胞积极推动通过控制突触的形成,维护和消除,所有这些都是神经元功能的重要过程开发的神经回路的细化。本文提出的协议是高度星形胶质细胞依赖性:充分成熟,形成功能性突触,神经元需要从星形胶质细胞的支持。我们经历星形胶质细胞的数量应大致等于hiPSC衍生神经元的数目,以支持神经元的成熟和表现出自发性活动的神经元网络的形成。由于我们的星形胶质细胞的协议收益率原代细胞的小路具有有限寿命Tures的,大鼠星形胶质细胞的分离,必须定期进行。
我们由张等人公布了协议的适配。 (2013年)12与MEA技术的使用可能会显著提高我们的学习hiPSC衍生的网络的网络活动的能力。此前,用于研究hiPSC派生的神经元网络与多边环境协议依靠耗时分化过程13-16。从张某等人的协议。 (2013)提供了一种快速的替代,并且提供了修改删除变异性的来源,这使得它现在更可行使用hiPSC衍生的神经元结合的MEA的技术,尤其是在高通量或药理学研究。另外,由于由Zhang 等人公布的方法。 (2013年)12得到上层皮层神经元的同质人口,我们的改编协议成为可能重点研究进入网络这种特殊神经元的子集ctivity。
尽管如此,这种方法也有一些限制。首先,将培养的均一性也可被认为是一个缺点,因为培养的可能性较小体内网络中,不同类的神经元( 即抑制性和兴奋性神经元)构成的非均相网络类似于。为了进一步提高使用具有MEA技术hiPSC衍生的神经元,这将是重要的,以开发其他的神经元细胞群快速(基于转基因-)分化协议。如果协议变得可用, 在体外网络将更加紧密地模拟体内网络。第二,目前大鼠星形胶质细胞必须被添加到生长的支持hiPSC衍生的神经元,因此,引起的神经元网络不是人类神经网络狭义。可靠的协议,在未来的溶胶人iPS细胞分化成星形胶质细胞可能已经这个问题26。第三,二维神经元网络,如这里描述的,可用于研究复杂的三维体内神经元网络有限模型。幸运的是,描述的大鼠原代神经元的三维培养物中结合MEA技术协议已经可用27,28。前瞻性,用于获得hiPSC衍生神经元和星形胶质细胞的三维培养技术和MEA技术迅速分化协议的组合应提供新颖的洞察的生物学机制底层神经障碍。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Jessica Classen for performing the whole-cell patch-clamp experiments. The hiPSCs used in our experiments were kindly provided by Huiqing Zhou and Willem van den Akker from the Radboud University Nijmegen. The transfer vectors used in this protocol were kindly provided by Oliver Brüstle, Philipp Koch and Julia Ladewig from the University of Bonn Medical Centre.
Lebovitz's L-15 medium | Gibco | 11415-064 | |
B-27 supplement | Gibco | 0080085SA | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Ca2+/Mg2+-free HBSS | Gibco | 14175-095 | |
0.05 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
2.5 % Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
High-glucose DMEM | Gibco | 11965-092 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
psPAX2 lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12260 | |
pMD2.G lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12259 | |
Basement membrane matrix | Gibco | A1413201 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964 | |
E8 medium | Gibco | A1517001 | |
ROCK inhibitor | Gibco | A2644501 | Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used. |
Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168-10ML | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
Vitronectin | Gibco | A14700 | |
6-well MEAs | Multi Channel Systems | 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr | |
Glass coverslips | VWR | 631-0899 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655-10MG | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891-5G | |
N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
NT-3, human recombinant | Promokine | C66425 | |
BDNF, human recombinant | Promokine | C66212 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
L-alanyl-L-glutamine | Gibco | 35050-038 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768-100MG | |
Straight fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251 | |
Fine-tipped spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 |