Alle eksperimenter på dyr blev udført i overensstemmelse med de godkendte dyr pleje og brug retningslinjerne fra Animal Care udvalget, Radboud University Medical Center, Holland, (RU Dec 2011-021, protokol nummer: 77073). 1. Glia Cell Isolation og Kultur BEMÆRK: Protokollen præsenteres her, er baseret på arbejdet i McCarthy og de Vellis 19, og en meget lignende detaljeret protokol for mus astrocytter er tilgængelig 20. For at generere primære kulturer af kortikale astrocytter fra embryonale (E18) rotte hjerner, skal ofret en gravid rotte, behøver de embryoner, der skal høstes fra livmoderen, og hjerne har brug for at være isoleret fra embryoner. For at fylde en T75 kolbe, de cortex fra 2 embryonale hjerner skal kombineres. Som et alternativ, kan kommercielt tilgængelige oprensede og frosne astrocytter købes. Forbered T75 kultur kolbe Fortynd Poly-D-Lysin (PDL) isterilt, ultrarent vand til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Der tilsættes 5 ml fortyndet PDL til T75 kultur kolben. Swish rundt forsigtigt for at væde hele vækst overfladen. Kolben anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator i 3 timer. Sug PDL fra kolben. Kolben skylles 3 gange med 5 ml sterilt vand for at fjerne ubundet PDL. Aspirer vandet fuldstændigt. Kolben at tørre i en laminar flow hætte eller anvendt øjeblikkeligt. Dissektion af cortex Forbered 50 ml dissektion medium: Lebovitz L-15-medium med 2% (v / v) B-27 supplement. Hold på is. Bedøver rotten dybt med isofluran i en induktion kammer (små plexiglas boks) indtil respiration ophører (~ 5-8 min). Fjern rotte fra induktion kammeret og straks aflivet ved cervikal dislokation. Spray maven af rotten med 70% EtOH og tørre det overskydende. Afsløre og fjerne livmoderen fra dæmningen via kejsersnit sectiom brug en saks 21. Skær individuelle embryoner fra deres fostervand sække med en saks, overførsel til en steril petriskål fyldt med koldt dissektion medium, og holde på is. Overfør embryoner igen til en ny, steril 6 cm petriskål fyldt med koldt dissektion medium. Uddrag hjerner fra embryonerne under et stereomikroskop. At udsætte hjernen, blidt skræl væk huden og kraniet med en pincet. Forsigtigt øse ud hele hjernen og overførsel til en 35 mm petriskål med frisk, koldt dissektion medium. BEMÆRK: Hele hjerner dissekeret fra embryoner kan opbevares i dissektionsmedium på is i mange timer uden at miste cellulær levedygtighed. Adskil de to halvdele af hver hjerne ved at skære gennem midterlinjen med spids fjeder saks eller en skalpel. Forsigtigt strip off meninges med lige fin spids pincet. BEMÆRK: Det er meget vigtigt at fjerne meninges fuldstændigt. ther forhindrer fibroblast kontaminering af astrocyt kultur. Fibroblaster hurtigt delende celler og til sidst vil forskyde de andre celler. Fjern midthjernen / striatum og lugtekolben med fjeder saks eller en skalpel. Sørg også for at fjerne hippocampus (C-formet struktur, der er perimedian og kaudalt i forhold til cortex) med fjeder saks eller en skalpel. Indsamle de kortikale halvkugler i et 15 ml centrifugerør fyldt med 5 ml dissektion medium. Hold på is. Dissociation af cortex Forbered 2 ml Ca2 + / Mg2 + -fri Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 0,25% trypsin (dissociation medium). Forbered 50 ml høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 15% (v / v) kalvefosterserum (FBS) og 1% (v / v) penicillin / streptomycin (dyrkningsmedium) og Filtersteriliser. Lad vævet sedimentere til bunden af centrifugerøret. omhyggeligt sompirat så meget af dissektion medium som muligt fra oven vævet. Vask vævet med 5 ml Ca2 + / Mg2 + -fri HBSS (uden trypsin) og tillade vævet at afvikle på bunden af røret. aspireres forsigtigt HBSS. Tilsæt 2 ml dissociation medium og bladre røret forsigtigt for at blande enzymet omkring vævet. Inkuber i et 37 ° C vandbad i 5-10 min. Svippe røret et par gange under inkubation for at agitere vævet. Umiddelbart tritureres vævet ved anvendelse af en 1.000 pi pipettespids. Indstil pipette volumen til omkring 800 uL. Aspirere stykkerne og kortet springe på siden af røret, direkte over fluidledningen. Men prøv at minimere bobler eller skum. Gentag, indtil vævet er tilstrækkeligt dissocieres, omkring 15 – 20x. Tilsæt 8 ml dyrkningsmedium til inaktivering af trypsin. Bland forsigtigt ved at vende røret flere gange. Pass cellesuspensionen gennem en 70 um cellefilter placeret på toppen af en 50 mL centrifugerør. Skyl 15 ml rør med dyrkningsmedium og foretage medium gennem cellesigte at indsamle mediet i 50 ml rør med cellesuspensionen. Skyl cellesigte et par gange med dyrkningsmedium. Efter skylning bør det endelige volumen være i 20 – 25 ml. Pelletere cellerne ved 200 xg i 10 min. aspirere omhyggeligt så meget medium som muligt, uden at røre cellepelleten. Resuspender cellerne i 1 ml dyrkningsmedium under anvendelse af en pi pipette 1000. Tilføj 11 ml forvarmet dyrkningsmedium og blandes forsigtigt (for at undgå bobler) ved anvendelse af en 10 ml pipette. PDL-overtrukne T75 kolbe skylles en gang med 5 ml dyrkningsmedium. Aspirer medium og overføre cellesuspensionen til kolben. Alle celler i suspensionen udplades, og vi finder det i almindelighed unødvendigt at tælle dem, da astrocytter ikke kan skelnes fra andre celler i suspensionen. Kolben anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 feller to dage. Udvidelse og vedligeholdelse af astrocytter Udskifte hele medium for den første gang 2 d efter indledende udpladning. Udskift hele medium bagefter hver 3 d. Altid Forvarm frisk medium til 37 ° C før tilsætning til cellerne. BEMÆRK: astrocytter kræver 7-10 d for at nå ca. 90% sammenflydning (astrocytterne fremstå som en tæt pakket tessellated monolag, med mikroglia og oligodendrocytter liggende på toppen og blandes). Når astrocytter nå ca. 90% sammenflydning, ryst flasken for at fjerne forurenende gliaceller: Kolben fjernes fra inkubatoren og stram hætte (phenol) eller dække porten (filtreret). At fjerne mikroglia, rystes kolben på en orbital platform ved 180 rpm i 1 time. Sug mediet. Skyl gang med 5 ml forvarmet dyrkningsmedium, aspireres og erstatte med 12 ml dyrkningsmedium. At fjerneoligodendrocytterne, kolben 37 ° C tilbage til orbital platform og rystes ved 250 rpm, i mindst 7 timer, men fortrinsvis O / N. Sug mediet. Skyl gang med 5 ml forvarmet dyrkningsmedium, aspireres og erstatte med 12 ml dyrkningsmedium. kolben Retur til inkubatoren. Når 100% konfluente, opdele astrocytter anvendelse af standardprocedurer i et forhold på 1: 3 til 1: 2 med 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). En T75-kolbe ved 100% sammenflydning vil typisk give omkring 4,0 x 10 6 celler i alt. I henhold til denne tidsplan, kan kulturerne typisk opdeles gang om ugen. BEMÆRK: Når astrocytter flyder sammen, kan de høstes og anvendes til hiPSC differentiering som beskrevet nedenfor i protokol trin 3.4. De astrocytter kan opdeles mindst en gang uden en mærkbar tab af levedygtighed. De kan opretholdes i op til 2 måneder i kultur. Af erfaring, primær embryonale dag 18 rotte astrocytter progressively bliver terminalt differentieret og / eller miste levedygtigheden efter gentagen opdelingen. Selv om det er muligt at indefryse astrocytter til fremtidig brug, foretrækker vi at isolere astrocytter fra friske embryonale hjerner, når det kræves. 2. generation af rtTA / Ngn2 -positiv hiPSCs BEMÆRK: De hiPSCs anvendt til vores eksperimenter blev genereret in-house af lentiviral transduktion af humane fibroblaster med omprogrammering faktorer cMYC, SOX2, OCT4 og KLF4. BEMÆRK: Til fremstilling af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs, er lentivirale vektorer anvendes til stabilt at integrere transgenerne i genomet af hiPSCs. Protokollen for produktionen af lentivirus er tidligere 22 blevet offentliggjort. Detaljerne i de lentivirale pakkevektorer, der anvendes til at producere de rtTA og Ngn2 lentivirus partikler er tilvejebragt i den <sTrong> Tabel Materialer / udstyr. Overførslen vektor, der anvendes til rtTA lentivirus er pLVX-EF1α- (Tet-On-Advanced) -IRES-G418 (R); dvs. denne vektor koder en Tet-On Advanced transaktivator under kontrol af en konstitutiv EF1α promotor og bibringer resistens over for antibiotikummet G418. Overførslen vektor, der anvendes til Ngn2 lentivirus er pLVX- (TRE-thight) – (mus) Ngn2-PGK-puromycin (R); dvs. denne vektor koder genet for muse neurogenin-2 under kontrol af en Tet-kontrolleret promotoren og puromycin-resistens genet under kontrol af en konstitutiv PGK-promotor. Derfor ved hjælp af disse to transfervektorer, kan en hiPSC linje skabes, for hvilke ekspression af murint neurogenin-2 kan induceres ved at supplere mediet med doxycyclin. For transduktionen af hiPSCs supernatanten med lentivirus partikler anvendes (benævnt "lentivirus suspension" i resten af teksten), dvs. witHout koncentrere partiklerne ved hjælp ultracentrifugering. Plate de hiPSCs (dag 1) BEMÆRK: Mængderne, der er nævnt i denne protokol antager, at hiPSCs dyrkes i et 6-brønds plade, og at cellerne i en brønd, høstes. Desuden antages det, at cellerne udplades efterfølgende i 12 brønde i en plade med 12 brønde. Forbered 10 ml kold DMEM / F12 med 1% (v / v) basalmembranmatrix (BMM) til opnåelse fortyndet BMM. Tilføj 800 pi fortyndet BMM pr brønd af en plade med 12 brønde. Inkuber i mindst 1 time i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Før brug, inkuberes pladen i 1 time ved stuetemperatur. Varm 15 ml Essential 8 (E8) medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin, 9 ml DMEM / F12 og 1 ml Cellefrigørelse opløsning (CDS) til stuetemperatur. Supplere E8 medium med Rho-associeret protein kinase (ROCK) hæmmer. Aspirere brugte medium af hiPSCs end tilsættes 1 ml CDS til hiPSCs. Inkuber 3 – 5 min i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Check under mikroskop, om cellerne løsne fra hinanden. Tilsæt 2 ml DMEM / F12 i brønden, forsigtigt suspendere cellerne med en 1.000 pi pipette og overføres cellerne til et 15 ml rør. Tilsættes 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensionen. Spin cellerne ved 200 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og tilsæt 2 ml af den fremstillet E8 medium. Opnå en cellesuspension, i hvilken hiPSCs dissocieres (ikke danner celleklumper) ved at sætte spidsen af en 1.000 pi pipette mod siden af 15 ml rør og resuspendering af cellerne forsigtigt. Check under mikroskopet om cellerne dissocieres. Bestemme antallet af celler (celler / ml) under anvendelse af et hæmocytometer kammer. BEMÆRK: En 6 brøndsplade godt ved 80 – 90% sammenflydning vil typisk give 3,0 – 4,0 x 10 6 celler i alt. Aspirerden fortyndede BMM fra brøndene i pladen 12 godt. Fortynd cellerne for at opnå en cellesuspension på 3,0 x 10 4 celler / ml. Plade 1 ml af cellesuspensionen pr brønd i pladen med 12 brønde. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Transducere IPS celler med rtTA og Ngn2 lentivirus (dag 2) Varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til stuetemperatur. Supplere E8 medium med ROCK inhibitor og polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml til E8 medium. Optø de portioner med lentivirus suspension. Tilføj polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml til lentivirus suspension. Aspirer det brugte medium og tilsæt 1 ml af den forberedt E8 medium til hver brønd. Udfør transduktion med forskellige mængder af den rtTA – og Ngn2 -lentivirus suspensioner. F.eks transduce hiPSCs ved tilsætning af 100 pi af både rtTA -lentivirus og Ngn2 -lentivirus suspension til en brønd i pladen med 12 brønde. For de andre brønde, bruge 200 uL, 300 uL, 400 uL og 500 uL lentivirus suspension i stedet for 100 uL. bør ikke transduceres de hiPSCs af to brønde i 12 brønds plade; de vil tjene som kontrol under udvælgelsesprocessen. BEMÆRK: De transduktioner er fortrinsvis udført i dobbeltbestemmelse, således at transduktionseffektiviteten kan anslås mere nøjagtigt efter starten af markeringen (se protokol trin 2.2.4). Mængden af lentivirus suspension, der kræves til effektivt at transducere de fleste af de hiPSCs afhænger titeren af lentivirus suspensionen, og hiPSC linje, der bruges. I denne undersøgelse, vi normalt bruger 100 – 500 uL af lentivirus suspension til at transducere de hiPSCs. Pladen med 12 brønde i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i 6 timer. Inden udgangen af 6 timer inkubationsperiode varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin og 12 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) til RT. Supplere E8 medium med ROCK-hæmmer. Aspirer det brugte E8 medium. Vask hver brønd med 1 ml DPBS. Tilsættes 1 ml af den klargjorte E8 medium til hver brønd. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Opdater E8 medium (dag 3) Varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til RT. Aspirer det brugte medium fra brøndene i pladen med 12 brønde, og der tilsættes 1 ml af den forberedte E8 medium til hver brønd. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Udfør valget med puromycin og G418 (dag 4-8) BEMÆRK: Afhængigt af celledeling på HipSC linje og effektiviteten af den lentivirale transduktion kan cellerne nå op på 70 – med 80% konfluens under udvælgelsesprocessen periode, på hvilket tidspunkt kulturerne skal flækkes. Fordi timingen af opsplitning ikke kan forudsiges på forhånd, vil det ikke blive nævnt i protokollen. Men i stedet for at opdatere E8 medium suppleret med de nævnte koncentrationer af puromycin og G418, kan man opdele hiPSC kultur som en normal hiPSC kultur (herunder udpladning af cellerne på vitronectin-coatede plader). Den eneste undtagelse er, at E8 medium bør suppleres med de nævnte koncentrationer af antibiotika for at fortsætte valget. Varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til stuetemperatur. Tilføj puromycin og G418 til valg; forskellige mængder af antibiotika tilsættes under udvælgelsen periode (tabel 1). Vurdere effektiviteten af transduktion ved at estimere andelen af G418- og puromycin-resistente celler. For at estimere andelen af resistente celler, vurdere procentdelen af døde celler (nonresistant celler) for de forskellige forhold (kulturerne transduceret med de forskellige mængder af lentivirus suspension) og for de nontransduced (de celler, der tjener som en markering kontrol). Beregn procentdelen af resistente celler som [100% – (procent af døde celler)]. BEMÆRK: Hvis transduktioner med de forskellige mængder af lentivirus suspension blev udført i to eksemplarer, kan transduktion effektivitet estimeres mere præcist. Betingelsen med de ikke-transducerede celler tjener som en markering kontrol; de procentdele af døde celler til kulturerne transduceret med de forskellige mængder af lentivirus suspension bør være lavere. Den anslåede procentdel af resistente celler bruges til at vælge de hiPSCs, der sandsynligvis positiv for begge transgener. Generelt vælger vi de hiPSCs fra transduktion tilstand var> 90% af cellens overlever udvælgelsesperioden 5 d. Aspirer det brugte medium af hiPSCs og tilsæt 1 ml af den forberedte E8 medium til brøndene. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Slutkoncentration på G418 Slutkoncentration på puromycin Dag 4 250 ug / ml 2 ug / ml Dag 5 250 ug / ml 2 ug / ml Dag 6 250 ug / ml 1 ug / ml Dag 7 250 ug / ml 1 ug / ml Dag 8 250 ug / ml 1 ug / ml Tabel 1: Koncentrationer af antibiotika i løbet af Selection Periode. </stRong> Koncentrationer af puromycin og G418 under 5 d udvælgelsesperioden. Stop udvælgelse og begynde regelmæssig dyrkning (dag 9 og nyere) Efter 5 d udvælgelsesperioden, kultur de rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs som normal hiPSCs, med den undtagelse, at E8 medium af cellerne suppleret med G418 til en slutkoncentration på 50 ug / ml og med puromycin til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml. BEMÆRK: Cellerne kan nu frosset (i overensstemmelse med standardprotokoller for kryopræservering af celler) for at fungere som backup. Dette er et vigtigt skridt for reproducerbarheden af differentiering protokol, fordi det tillader anvendelse af den samme batch af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs for mange fremtidige differentierings- eksperimenter. 3. Differentiering af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs til neuroner på 6 brøndeMEA og dækglas BEMÆRK: I denne protokol, er detaljerne, der er fastsat differentiere rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs på to forskellige substrater, dvs. 6-brønds MMA (enheder bestående af 6 uafhængige brønde med 9 optagelse og 1 reference- indlejrede mikroelektroder per brønd) og dækglas i brøndene i en 24-brønds plade. Protokollerne kan imidlertid let tilpasses til større substrater (fx til brøndene i 12- eller 6-brønds plader), ved at opskalere den nævnte værdier ifølge overfladearealet. Forbered MEA eller dækglas (dag 0 og dag 1) Dagen før starten af differentieringen, sterilisere MEA'er ifølge producentens anbefaling. Fortynd adhæsionsproteinet Poly-L-ornithin (PLO) i sterilt ultrarent vand til en slutkoncentration 50 ug / ml. Coat den aktive elektrodeareal på 6-brønds MEA'er ved at placere en 100 pislip af den fortyndede PLO i hver brønd. Placer dækglas i brøndene i 24-brønds plade under anvendelse af sterile pincetter. Tilføj 800 pi af den fortyndede PLO i hver brønd. Undgå de dækglas fra flydende ved at skubbe dem ned med 1000 uL pipettespids. Inkubér 6-brønds MEA og 24-brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Den næste dag, aspireres den fortyndede PLO. Vask glas overflader af de 6-brønds MEA og dækglassene to gange med sterilt ultrarent vand. Fortynd laminin i koldt DMEM / F12 til en slutkoncentration på 20 ug / ml (for 6-brønds MEA) og 10 ug / ml (for dækglas). Umiddelbart belægge aktive elektrodeareal af de 6-brønds MEA'er ved at placere en 100 pi fald i hver brønd. Ligeledes tilsættes 400 pi af den fortyndede laminin i hver brønd af 24-brønds plade til at overtrække dækglas. Undgå de dækglas fra flydende ved at skubbe dem ned med 1000 uL pipettespids. Inkubér 6-brønds MEA og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i mindst 2 timer. Plate de hiPSCs (dag 1) BEMÆRK: Mængderne, der er nævnt i trin 3.2.1 – 3.2.4 antager, at rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs dyrkes i en 6-brønds plade, og at cellerne i en brønd, høstes. Volumenerne, der kræves for udpladning af cellerne på 6-brønds MEA og / eller dækglassene afhænger af antallet af 6-brønds MEA og / eller antallet af dækglas, der anvendes i forsøget; tallene angivet i trin 3.2.6 – 3.2.8 tillader skalering til forskellige eksperiment-størrelser. Varm DMEM / F12, CDS og E8 medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til R / T. Tilføj doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / ml og ROCK inhibitor til E8 medium. Aspirer det brugte medium af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs og der tilsættes 1 mL CDS til hiPSCs. Inkuber 3 – 5 min i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Check under mikroskop, om cellerne løsne fra hinanden. Tilsæt 2 ml DMEM / F12 i brønden, forsigtigt suspendere cellerne med en 1.000 pi pipette og overføres cellerne til et 15 ml rør. Tilsættes 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensionen. Spin cellerne ved 200 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og tilsæt 2 ml af den fremstillet E8 medium. Dissociere hiPSCs ved at sætte spidsen af en 1.000 pi pipette mod siden af 15 ml rør og resuspendering af cellerne forsigtigt. Check under mikroskopet om cellerne dissocieres. Bestemme antallet af celler (celler / ml) under anvendelse af et hæmocytometer kammer. BEMÆRK: En plade med 6 brønde godt ved 80 – 90% sammenflydning vil typisk give 3,0 – 4,0 x 10 6 celler i alt. Aspirere fortyndede laminin. For 6-brønds multilaterale miljøaftaler, fortyndes cellerne for at opnå en cell suspension af 7,5 x 10 5 celler / ml. Plate cellerne ved at tilsætte en dråbe 100 pi af cellesuspensionen på det aktive elektrodeareal i hver brønd i 6-brønds MEA'er. For dækglassene, fortyndes cellerne til opnåelse af en cellesuspension af 4,0 x 10 4 celler / ml. Plate cellerne ved at tilsætte 500 pi af cellesuspensionen til brøndene i 24-brønds plade. BEMÆRK: Den endelige celledensitet på MEA'er er højere end på dækglassene (figur 1A og B). Vi fandt, at denne høj celledensitet var påkrævet for korrekt registrering af netværksaktivitet. I protokollen er antallet forudsat der viste sig at være optimalt for analyserne. Placer 6-brønds MEA og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i 2 timer (MEA) eller O / (24 brønds plade) N. Efter 2 timer tilsættes forsigtigt 500 pi af fremstillet E8 medium til hver brønd i 6-brønds MEA'er. Placer 6-vill MEA O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Skift medium (dag 2) Den næste dag, forberede DMEM / F12 med 1% (v / v) N-2 supplement, 1% (v / v) ikke-essentielle aminosyrer og 1% (v / v) penicillin / streptomycin. Tilføj humant rekombinant neurotrophin-3 (NT-3) til en slutkoncentration på 10 ng / ml, human rekombinant hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) til en endelig koncentration på 10 ng / ml, og doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / mL. Varm mediet til 37 ° C. Tilføj laminin til en slutkoncentration på 0,2 ug / ml til mediet. Filtrer den resulterende medium. Aspirer det brugte medium fra brøndene i 6-brønds MEA og 24-brønds plade og erstatte det med den klargjorte medium. Inkubér 6-brønds MEA og 24-brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Tilføj rotte astrocytter (dag 3) <br/> BEMÆRK: De mængder, der er nævnt i denne protokol, antage, at rotte astrocytter dyrkes i T75 dyrkningskolber. Det er afgørende, at de rotter astrocytter, der tilsættes til kulturerne er af god kvalitet. Vi anvender to kriterier for at kontrollere, om de rotte astrocytter er af god kvalitet. For det første bør rotte astrocyt kultur kunne vokse sammenflydende inden for ti dage efter isolation fra rotte embryonale hjerner. For det andet, efter spaltning af rotte astrocyt kultur, bør rotte astrocytter kunne danne et konfluent, tessellated monolag (figur 1C). Hvis rotten astrocyt kultur ikke opfylder disse to kriterier, anbefaler vi ikke at bruge denne kultur for differentiering eksperimenter. Varm 0,05% trypsin-EDTA til stuetemperatur. Varm DPBS og DMEM / F12 med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til 37 ° C. Aspirere brugte medium af rotte astrocyt kultur. Vask kulturen ved tilsætning af 5 ml DPBS og hvislen det rundt forsigtigt. Aspirspiste DPBS og tilsæt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Swish trypsin-EDTA rundt forsigtigt. Inkuber i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i 5 – 10 min. Check under mikroskopet om cellerne er fritliggende. Frigør de sidste celler ved at ramme kolben et par gange. Der tilsættes 5 ml DMEM / F12 til kolben. Triturer cellerne forsigtigt inde i kolben med en 10 ml pipette. Opsaml cellesuspension i en 15 ml rør. Spin røret ved 200 xg i 8 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml DMEM / F12. Bestemme antallet af celler (celler / ml) under anvendelse af et hæmocytometer kammer. Tilføj 7,5 x 10 4 astrocytter pr brønd i 6-brønds MEA'er. Tilsæt 2,0 x 10 4 astrocytter per brønd af 24-brønds plade. Inkubér MEA og 24-brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Skift medium (dag 4) <li> Forbered Neurobasal medium med 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamin og 1% (v / v) penicillin / streptomycin. Tilføj NT-3 til en slutkoncentration på 10 ng / mL, BDNF til en endelig koncentration på 10 ng / ml, og doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / ml. Desuden tilføjer cytosin β-D-arabinofuranosid til en koncentration på 2 uM. BEMÆRK: cytosin β-D-arabinofuranosid tilsættes til mediet for at hæmme astrocyt proliferation og til at dræbe de resterende hiPSCs, der ikke differentiere i neuroner. Filter mediet og opvarm til 37 ° C. Aspirer det brugte medium fra brøndene i 6-brønds MEA og 24-brønds plade og erstatte det med den klargjorte medium. Opretholde de 6-brønds MEA'er og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Opdater mediet (dag 6-28) BEMÆRK: Startende fra dag 6, opdatere halvdelenaf mediet hver anden dag. Fra dag 10 og frem, er det medium suppleret med FBS at støtte astrocyt levedygtighed. Forbered Neurobasal medium med 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamin og 1% (v / v) penicillin / streptomycin. Tilføj NT-3 til en slutkoncentration på 10 ng / mL, BDNF til en endelig koncentration på 10 ng / ml, og doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / ml. Fra dag 10 og frem, også supplere mediet med 2,5% (vol / vol) FBS. Filtrer den resulterende medium og varme til 37 ° C. Fjern halvdelen af det brugte medium fra brøndene i 6-brønds MEA'er og 24-brønds plade under anvendelse af en pi pipette 1000 og erstatte det med den klargjorte medium. Opretholde de 6-brønds MEA'er og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. 4. Etablere den neurofysiologiske Profil af hiPSC-afledte neuroner BEMÆRK: To til tre uger efter iduktion af differentiering, kan de hiPSC-afledte neuroner anvendes til forskellige downstream analyser. I dette afsnit er eksempler på nogle downstream analyser givet som kan udføres for at etablere det neurofysiologiske profil af de hiPSC-afledte neuroner. Karakterisere neuronale netværk aktivitet ved anvendelse MEA'er Record 20 min af elektrofysiologisk aktivitet af hiPSC-afledte neuroner dyrket på MEA'er. Under optagelsen holde temperaturen ved 37 ° C, og forhindre fordampning og pH-ændringer i mediet ved at oppuste en konstant, langsom strømning af befugtede gas (5% CO2, 20% O2, 75% N2) på MEA . Efter 1200X forstærkning (MEA 1060, MCS), prøve signalet ved 10 kHz ved hjælp af MCS datafangst-kort. Analyser af data (spike og brast afsløring) ved hjælp af en brugerdefineret software-pakke 23. Karakterisere encellede elektrofysiologisk aktivitet </strong> Overfør dækglas indeholdende hiPSC-afledte neuronale kulturer til en neddykket fast fase optagelse kammer i en opretstående mikroskop. Record 20 min af spontan aktionspotentiale-fremkaldte postsynaptiske strømme (sEPSC) 24. Detect den synaptiske begivenhed ved hjælp neurovidenskabelig program. Karakterisere neuronal morfologi og synapsin ekspression Fix og plette de hiPSC-afledte neuroner for MAP2, synapsin-1/2, og PSD-95 22, 24, 25. Kvantificer antallet af synapsin-1/2 og PSD-95 puncta bruger billedanalyse software.