Alle forsøk på dyr ble utført i samsvar med godkjente dyr omsorg og retningslinjer for bruk av Care komiteen Animal, Radboud University Medical Centre, Nederland, (RU-desember-2011-021, protokollnummer: 77073). 1. Glia Cell Isolering og kultur MERK: Protokollen som presenteres her er basert på arbeidet til McCarthy og de Vellis 19, og en svært lik detaljert protokoll for mus astrocytter er tilgjengelig 20. For å generere primærkulturer av kortikale astrocytter fra embryonale (E18) rottehjerner, trenger en gravid rotte å bli ofret, embryoene må høstes fra livmoren, og hjernen trenger å bli isolert fra embryoer. For å fylle en T75 kolbe, de cortices fra 2 embryonale hjerner må kombineres. Som et alternativ, kan kommersielt tilgjengelige rensede og frosne astrocytter kjøpes. Klargjør T75 kultur kolbe Fortynnet Poly-D-lysin (PDL) isterilt, ultrarent vann til en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml. Tilsett 5 ml av den fortynnede PDL til T75 kulturflaske. Swish rundt forsiktig å fukte hele veksten overflaten. Plassere kolben i en fuktet 37 ° C inkubator i 3 timer. Aspirer PDL fra kolben. Skyll kolben med 3 x 5 ml sterilt vann for å fjerne ubundet PDL. Aspirer vannet helt. Forlater kolben for å tørke i en laminær strømningshette eller brukes umiddelbart. Disseksjon av korteks Forbered 50 ml disseksjon medium: Lebovitz L-15 medium med 2% (v / v) B-27 supplement. Hold på is. Anesthetize rotte dypt med isofluran i en induksjonskammeret (små pleksiglass boks) til respirasjon opphører (~ 5-8 min). Fjern rotte fra induksjonskammeret og umiddelbart avlivet ved cervikal dislokasjon. Spray buken av rotte med 70% EtOH og tørk vekk overflødig. Avsløre og fjerne livmor fra demningen via keisersnitt sectipå å bruke en saks 21. Skjær enkelte embryoer fra sine fosterblærer med saks, overføre til en steril petriskål fylt med kaldt disseksjon medium, og holde på is. Overfør embryoer på nytt til en ny, steril 6 cm petriskål fylt med kaldt disseksjon medium. Utdrag hjerner fra embryoene under et stereomikroskop. Å utsette hjernen, forsiktig skrelle bort huden og hodeskallen ved hjelp av tang. Forsiktig øse ut hele hjernen og overføre til en 35 mm petriskål med friskt, kaldt disseksjon medium. MERK: Hele hjernen dissekert fra embryo kan lagres i disseksjon medium på is i mange timer uten å miste mobilnettet levedyktighet. Skill de to halvkuler av hver hjerne ved å skjære gjennom midtlinjen med fine spisser våren saks eller en skalpell. Nøye kle av hjernehinnene med rette fin-tipped tang. MERK: Det er svært viktig å fjerne hjernehinnene helt. ther hindrer fibroblast forurensning av astrocytt kulturen. Fibroblaster er raskt delende celler, og vil etter hvert forskyve de andre cellene. Ta av midthjernen / striatum og luktelappen med våren saks eller en skalpell. Pass også på å fjerne hippocampus (C-formet struktur som er perimedian og hale med hensyn til cortex) med våren saks eller en skalpell. Samle kortikale halvkuler i et 15 ml sentrifugerør fylt med 5 ml disseksjon medium. Hold på is. Dissosiasjon av korteks Forbered 2 ml Ca 2+ / Mg 2+ -fri Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 0,25% trypsin (dissosiasjon medium). Forbered 50 mL høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 15% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin (kultur medium) og filtersteriliser. La vevet slå seg ned til bunnen av sentrifugerøret. nøye sompirat så mye av disseksjon medium som mulig fra ovenfor vevet. Vask vev med 5 ml Ca2 + / Mg2 + -fri HBSS (uten trypsin), og la vev for å slå seg ned på bunnen av røret. Nøye aspirer HBSS. Tilsett 2 ml dissosiasjon medium og flick røret forsiktig for å blande enzymet rundt vev. Inkuberes i et 37 ° C vannbad i 5-10 min. Flick røret et par ganger under inkubasjon å agitere vevet. Umiddelbart triturer vev ved hjelp av en 1000 mL pipette tips. Sett pipetter volumet til 800 mL. Aspirer stykkene og støte kraftig mot den side av røret, rett ovenfor fluidledningen. Men prøv å minimere bobler eller skumming. Gjenta til vevet er tilstrekkelig dissosiert, ca 15 – 20x. Tilsett 8 ml kulturmedium for å inaktivere trypsin. Bland forsiktig ved å snu røret flere ganger. Passere cellesuspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil plassert på toppen av en 50 mL sentrifugerør. Skyll 15 ml rør med kulturmedium og filtrere mediet gjennom cellen sil for å samle mediet i 50 ml rør med cellesuspensjonen. Skyll celle sil noen ganger med kulturmediet. Etter skylling, bør det endelige volum være omtrent 20 – 25 ml. Pellet cellene ved 200 xg i 10 min. aspirere nøye så mye medium som mulig, uten å berøre cellepelleten. Resuspender cellene i 1 ml kulturmedium ved anvendelse av en 1000 ul pipette. Legg 11 ml forvarmet kulturmedium og bland forsiktig (for å hindre at bobler) ved anvendelse av en 10 ml pipette. Skyll PDL-belagte T75 kolbe gang med 5 ml kulturmedium. Aspirere mediet og overføre cellesuspensjonen til kolben. Alle cellene er i suspensjonen er belagt, og vi finner det vanligvis unødvendig å telle dem, ettersom astrocytter ikke kan skilles fra andre celler i suspensjonen. Plassere kolben i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO 2 feller to dager. Ekspansjon og vedlikehold av astrocytter Bytt ut hele medium for første gang 2 d etter første platekledning. Bytt ut hele medium etterpå hver 3 d. Alltid prewarm det friskt medium til 37 ° C før tilsetning til cellene. MERK: astrocytter krever 7-10 d å nå ca 90% konfluens (de astrocytter vises som en tettpakket tessellated enkeltlag, med microglia og oligodendrocytes liggende oppå og blandet). Når astrocytter når tilnærmet 90% konfluens, ristes kolben for å fjerne kontaminerende gliacellene: Fjern kolben fra inkubatoren og stramme hetten (fenol) eller dekke port (filtrert). For å fjerne mikroglia, ristes kolben på en orbital plattformen ved 180 rpm i 1 time. Aspirer medium. Skyll en gang med 5 ml forvarmet dyrkingsmedium, aspirer og erstatte med 12 ml kulturmedium. Å fjernede oligodendrocytter, returnerer kolben til orbital plattformen og riste ved 250 opm, 37 ° C i minst 7 timer, men fortrinnsvis O / N. Aspirer medium. Skyll en gang med 5 ml forvarmet dyrkingsmedium, aspirer og erstatte med 12 ml kulturmedium. Returner kolben til inkubatoren. Ved 100% konfluent, delt astrocytter ved anvendelse av standardprosedyrer ved et forhold på 1: 3 til 1: 2 med 0,05% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). En T75 kolbe på 100% konfluens vil typisk gi ca 4,0 x 10 6 celler totalt. Under denne planen, kan de kulturene vanligvis deles en gang per uke. MERK: Når astrocytter når konfluens, kan de bli høstet og benyttet for hiPSC differensiering som beskrevet nedenfor i protokoll trinn 3.4. Astrocyttene kan deles opp i minst en gang uten et merkbart tap av levedyktighet. De kan opprettholdes i inntil 2 måneder i kultur. Av erfaring, primært embryonale dag 18 rotte astrocytter progressively bli terminalt differensiert og / eller miste levedyktighet etter gjentatte splitting. Selv om det er mulig å fryse astrocyttene for fremtidig bruk, foretrekker vi å isolere astrocytter fra friske embryonale hjerne når det er nødvendig. 2. Generering av rtTA- / Ngn2 -positivt hiPSCs MERK: hiPSCs brukes for våre eksperimenter ble generert internt av lentiviral transduksjon av menneskelige fibroblaster med omprogrammering faktorer cMYC, SOX2, OCT4 og KLF4. MERK: For generering av rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs er lentiviral vektorer som brukes til å stabilt integrere transgener i genomet av hiPSCs. Protokollen for fremstilling av lentivirus er tidligere publisert 22. Detaljene av lentivirale emballasje vektorer som brukes til å produsere de rtTA- og Ngn2 lentivirus-partikler er gitt i <strong> Table of Materials / utstyr. Overføringen vektor brukes til rtTA- lentivirus er pLVX-EF1α- (Tet-On-Advanced) -IRES-G418 (R); dvs. denne vektoren koder for en Tet-On Advanced transaktivator under kontroll av en konstitutiv promoter EF1α og gir resistens mot antibiotika G418. Overføringen vektor brukes til Ngn2 lentivirus er pLVX- (TRE-thight) – (mus) Ngn2-PGK-puromycin (R); dvs. denne vektoren koder for genet for muse-neurogenin-2 under kontroll av en Tet-styrt promoteren og puromycin-resistensgenet under kontroll av en konstitutiv promoter PGK. Derfor, ved å bruke disse to overføringsvektorer, kan opprettes et hiPSC linje for hvilken ekspresjonen av murin neurogenin-2 kan bli indusert ved å supplere det medium med doksycyklin. For transduksjon av hiPSCs blir supernatanten med lentivirus partiklene som brukes (referert til som "lentivirus suspensjon 'i resten av teksten), dvs. witHout konsentrerer partiklene ved hjelp av ultrasentrifugering. Plate hiPSCs (dag 1) MERK: Volumene som er nevnt i denne protokollen anta at hiPSCs dyrkes i en 6 brønn plate og at cellene i en brønn er høstet. I tillegg er det antatt at cellene blir sådd ut senere i 12 brønner i en 12-brønners plate. Forbered 10 ml kald DMEM / F12 med 1% (v / v) basalmembran Matrix (BMM) under dannelse av fortynnet BMM. Legg 800 mL fortynnet BMM per brønn i en 12 brønners plate. Inkuberes i minst 1 time i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Før bruk, Inkuber platen i 1 time ved RT. Varm 15 ml Essential 8 (E8) medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin, 9 ml DMEM / F12 og 1 ml celle løsrivelse løsning (CDS) til romtemperatur. Supplere E8 medium med Rho-assosiert protein kinase (ROCK) hemmer. Aspirer brukt medium av hiPSCs end tilsett 1 ml CDS til hiPSCs. Inkuber 3 – 5 minutter i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er løsne fra hverandre. Tilsett 2 ml DMEM / F12 i brønnen, forsiktig suspendere cellene med en 1000 ul pipette og overføre cellene til en 15 ml tube. Legg 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensjonen. Spinne cellene ved 200 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml av den tilberedte E8 medium. Oppnå en cellesuspensjon hvor hiPSCs dissosiert (ikke danner celleklumper) ved å sette spissen av en 1000 ul pipette mot siden av 15 ml rør og resuspendering av cellene forsiktig. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er dissosiert. Bestemme antall celler (celler / ml) ved anvendelse av et hemocytometer kammer. MERK: En seks brønn plate vel på 80-90% konfluens vil typisk gi 3,0 – 4,0 x 10 6 celler totalt. Sugden fortynnede BMM fra brønnene i 12 brønners plate. Fortynn cellene for å oppnå en celle-suspensjon av 3,0 x 10 4 celler / ml. Plate 1 ml av cellesuspensjonen pr brønn av 12 brønn plate. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Transduce de iPS celler med rtTA- og Ngn2 lentivirus (dag 2) Varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til romtemperatur. Supplere E8 medium med ROCK-inhibitor og polybren til en sluttkonsentrasjon på 8 mg / ml til E8 medium. Tine porsjoner med lentivirus suspensjon. Legg polybren til en sluttkonsentrasjon på 8 mg / ml til lentivirus suspensjon. Aspirer brukte medium og tilsett 1 ml av den tilberedte E8 medium til hver brønn. Utfør transduksjon med ulike mengder av rtTA- – og Ngn2 -lentivirus suspensjoner. For eksempel, transduCE hiPSCs ved å tilsette 100 mL av både rtTA- -lentivirus og Ngn2 -lentivirus suspensjon til en brønn på 12-brønners plate. For de øvrige brønnene, bruke 200 mL, 300 mL, 400 mL og 500 mL lentivirus suspensjon i stedet for 100 mL. De hiPSCs av to brønner på 12 brønners plate bør ikke transduced; de vil tjene som kontroller under valget. MERK: transductions blir fortrinnsvis utført i duplikat, slik at transduksjon effektivitet kan beregnes mer nøyaktig etter starten av det merkede (se protokoll trinn 2.2.4). Mengden av lentivirus suspensjon som er nødvendig for effektivt å omsette størstedelen av hiPSCs avhenger av titer av lentivirus suspensjonen og hiPSC linje som er brukt. I denne studien bruker vi vanligvis 100 – 500 mL av lentivirus suspensjon til transduce de hiPSCs. Plasser 12 brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 til 6 timer. Før slutten av den 6 timers inkubasjonstiden, varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin og 12 ml Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) til RT. Supplere E8 medium med ROCK hemmer. Aspirer brukt E8 medium. Vask hver brønn med 1 ml DPBS. Tilsett 1 ml av den tilberedte E8 medium til hver brønn. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Oppdater E8 medium (dag 3) Varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til RT. Aspirer brukte mediet fra brønnene i 12 brønners platen og tilsett 1 ml av den fremstilte E8 medium til hver brønn. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Utfør utvalg med puromycin og G418 (dag 4-8) MERK: Avhengig av celledeling frekvensen av HIPSC linje og effektiviteten av lentiviral transduksjon, kan cellene nå 70 – 80% konfluens i utvelgelses periode, på hvilket punkt kulturen må splittes. På grunn av at tidspunktet for splitting ikke kan forutsies på forhånd, vil det ikke bli nevnt i protokollen. Men i stedet for å oppdatere E8 medium supplert med de nevnte konsentrasjoner av puromycin og G418, kan man dele hiPSC kulturen som en normal hiPSC kultur (inkludert plating av cellene på vitronektin-belagte plater). Det eneste unntaket er at E8 mediet bør suppleres med de nevnte konsentrasjoner av antibiotika for å fortsette valget. Varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til romtemperatur. Legg puromycin og G418 for valg; forskjellige mengder av antibiotika tilsettes under utvalgsperioden (tabell 1). Anslå effektiviteten av transduksjon ved å beregne prosentandelen av G418- og puromycin-resistente celler. For å beregne prosentandelen av resistente celler, beregne prosentandelen av døde celler (nonresistant celler) for de forskjellige forhold (kulturene transdusert med de forskjellige mengder av lentivirus suspensjon) og for nontransduced celler (cellene som tjener som et utvalg kontroll). Beregn prosentandelen av resistente celler som [100% – (prosentandel av døde celler)]. MERK: Dersom transductions med de forskjellige mengder av lentivirus suspensjon ble utført i duplikat, kan transduksjon effektiviteten beregnes mer nøyaktig. Tilstanden med de ikke-transduced celler fungerer som et utvalg kontroll; prosentandelen av døde celler i kulturene transdusert med de forskjellige mengder av lentivirus suspensjon bør være lavere. Den estimerte andelen resistente celler brukes til å velge de hiPSCs som sannsynligvis positiv for begge transgener. Generelt velger vi de hiPSCs fra transduksjon tilstand var> 90% av celles overleve fem d utvalget periode. Aspirer brukt medium av hiPSCs og tilsett 1 ml av den tilberedte E8 medium til brønnene. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Sluttkonsentrasjon av G418 Sluttkonsentrasjon av puromycin dag 4 250 ug / mL 2 ug / mL dag 5 250 ug / mL 2 ug / mL dag 6 250 ug / mL 1 pg / ml dag 7 250 ug / mL 1 pg / ml dag 8 250 ug / mL 1 pg / ml Tabell 1: Konsentrasjonene av antibiotika i utvelgelsesperioden. </strong> Konsentrasjoner av puromycinet og G418 under 5 d av utvalget perioden. Stopp valg og begynne vanlig dyrking (dag 9 og senere) Etter 5 d utvalg periode, kultur de rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs som normale hiPSCs, med unntak av at det E8 medium av cellene er supplert med G418 til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml og med puromycin til en sluttkonsentrasjon på 0,5 ug / mL. MERK: Cellene kan nå bli frosset (i henhold til standard protokoller for nedfrysing av celler) for å tjene som sikkerhetskopi. Dette er et viktig skritt for reproduserbarheten av differensiering protokollen, fordi den tillater bruk av den samme batch av rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs for mange fremtidige differensierings eksperimenter. 3. Differensiering av rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs til Nerveceller på 6-brønnenMEAs og dekkglass MERK: I denne protokollen, er det gitt nærmere detaljer for å differensiere rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs på to forskjellige underlag, dvs. seks-brønns Meas (enheter består av 6 selvstendige brønner med 9-opptak og en referanseinnebygde mikroelektroder per brønn) og dekkglass i brønnene i en 24-brønns plate. Protokollene kan imidlertid lett tilpasses for større substrater (for eksempel, for brønnene i 12- eller 6-brønners plater), ved å skalere opp de nevnte verdier i henhold til det overflateareal. Forbered MEAs eller dekkglass (dag 0 og dag 1) Dagen før starten av differensiering, sterilisere MEAs i henhold til produsentens anbefaling. Fortynn bindingsproteinet, Poly-L-Ornitin (PLO) i sterilt ultrarent vann til en sluttkonsentrasjon 50 ug / ml. Coat den aktive elektroden område av seks-brønns MEAs ved å plassere en 100 mLslipp av den fortynnede PLO i hver brønn. Plassere objektglassene i brønnene i 24-brønns plate ved hjelp av sterile pinsetter. Legg 800 mL av den fortynnede PLO i hver brønn. Forhindre glassene fra flytende ved å dytte dem ned med 1000 mL pipette tips. Inkuber 6-brønns MEAs og 24-brønns plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Neste dag, aspirer utvannet PLO. Vask glassflater i de seks-brønns MEAs og Dekk to ganger med sterilt ultrarent vann. Fortynn laminin i kaldt DMEM / F12 til en sluttkonsentrasjon på 20 ug / ml (for 6-brønners MEAs) og 10 ug / ml (for dekkglass). Umiddelbart belegge det aktive elektrodeareal på 6-brønners MEAs ved å plassere en dråpe 100 ul i hver brønn. På samme måte, tilsett 400 ul av den fortynnede laminin i hver brønn på 24-brønners plate for å belegge dekkglass. Forhindre glassene fra flytende ved å dytte dem ned med 1000 mL pipette tips. Inkuber 6-brønns MEAs og 24 brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i minst 2 timer. Plate hiPSCs (dag 1) MERK: Volumene som er nevnt i trinn 3.2.1 – 3.2.4 anta at rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs dyrkes i en seks-brønns plate og at cellene i en brønn er høstet. Mengdene som er nødvendig for plating av cellene på 6-brønners MEAs og / eller objektglassene avhenger av antall av seks-brønners MEAs og / eller antallet av dekkglass som er brukt i eksperimentet; tallene som er angitt i trinn 3.2.6 – 3.2.8 tillater skalering til ulike forsøks størrelser. Varme DMEM / F12, CDS og E8 medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til R / T. Legg doksycyklin til en endelig konsentrasjon på 4 mg / ml og ROCK inhibitoren til E8 medium. Aspirer brukt medium av rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs og tilsett 1 mL CDS til hiPSCs. Inkuber 3 – 5 minutter i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er løsne fra hverandre. Tilsett 2 ml DMEM / F12 i brønnen, forsiktig suspendere cellene med en 1000 ul pipette og overføre cellene til en 15 ml tube. Legg 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensjonen. Spinne cellene ved 200 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml av den tilberedte E8 medium. Dissosiere hiPSCs ved å sette spissen av en 1000 ul pipette mot siden av 15 ml rør og resuspendering av cellene forsiktig. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er dissosiert. Bestemme antall celler (celler / ml) ved anvendelse av et hemocytometer kammer. MERK: En seks-brønns plate vel på 80-90% konfluens vil typisk gi 3,0 – 4,0 x 10 6 celler totalt. Aspirer utvannet laminin. For de seks-brønns MEAs, fortynne cellene for å få en cell suspensjon av 7,5 x 10 5 celler / ml. Plate cellene ved å tilsette en dråpe av 100 ul av cellesuspensjonen på det aktive elektrodeareal i hver brønn av seks-brønners Meas. For glassene, fortynn cellene for å oppnå en celle-suspensjon av 4,0 x 10 4 celler / ml. Plate cellene ved tilsetning av 500 ul av cellesuspensjonen til brønnene i 24-brønns plate. MERK: Den endelige celletetthet på MEAs er høyere enn på glassene (figur 1A og B). Vi fant at denne høy celletetthet var nødvendig for riktig registrering av nettverksaktivitet. I protokollen, tallene er gitt som viste seg å være optimal for analysene. Plasser 6-brønns MEAs og 24 brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i 2 timer (MEAS) eller O / N (24 brønnsplate). Etter 2 timer, tilsett forsiktig 500 ul av den tilberedte E8 medium til hver brønn av seks-brønners Meas. Sett 6-vill MEAs O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Endre medium (dag 2) Den neste dag, forberede DMEM / F12 med 1% (v / v) N-2-supplement, 1% (v / v) ikke-essensielle aminosyrer og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin. Legg human rekombinant neurotrofin-3 (NT-3) til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml human rekombinant hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml, og doksycyklin til en sluttkonsentrasjon på 4 ug / ml. Varm opp mediet til 37 ° C. Legg laminin til en endelig konsentrasjon på 0,2 ug / ml til mediet. Filtrer den resulterende medium. Aspirer brukt medium fra brønnene på seks-brønns MEAs og 24-brønns plate og erstatte den med den forberedte medium. Inkuber 6-brønns MEAs og 24-brønns plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Legg rotte astrocytter (dag 3) <br/> MERK: Volumene som er nevnt i denne protokollen anta at rotte astrocytter dyrkes i T75 kulturflasker. Det er viktig at rotte astrocytter som er lagt til kulturene er av god kvalitet. Vi bruker to kriterier for å kontrollere om rotte astrocytter er av god kvalitet. Først skal rotten astrocytt kulturen være i stand til å vokse konfluente i løpet av ti dager etter isolering fra rotte embryonale hjerner. For det andre, etter å splitte rotte astrocyte kultur, bør rotte astrocytter kunne danne en konfluent, tessellated enkeltlag (figur 1C). Hvis rotta astrocyte kultur ikke oppfyller disse to kriteriene, anbefaler vi ikke å bruke denne kulturen for differensiering eksperimenter. Varm 0,05% trypsin-EDTA til RT. Varm DPBS og DMEM / F12 med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til 37 ° C. Aspirer brukte medium av rotte astrocytt kulturen. Vask kulturen ved å tilsette 5 ml DPBS og swish den rundt forsiktig. Aspirspiste DPBS og tilsett 5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Swish trypsin-EDTA rundt forsiktig. Inkuber i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i 5 – 10 min. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er frittliggende. Løsne de siste cellene ved å treffe flasken et par ganger. Tilsett 5 ml DMEM / F12 til kolben. Triturer cellene forsiktig inn i kolben med en 10 ml pipette. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør. Spinn rør ved 200 xg i 8 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml DMEM / F12. Bestemme antall celler (celler / ml) ved anvendelse av et hemocytometer kammer. Legg 7,5 x 10 4 astrocytter per brønn av de seks-brønns MEAs. Tilsett 2,0 x 10 4 astrocytter per brønn på 24-brønners plate. Inkuber MEAs og den 24-brønns plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Endre medium (dag 4) <li> Forbered Neurobasal medium med 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamin og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin. Legg NT-3 til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml BDNF til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml, og doksycyklin til en endelig konsentrasjon på 4 ug / ml. I tillegg legger cytosin β-D-arabinofuranoside til en konsentrasjon på 2 uM. MERK: Cytosin β-D-arabinofuranoside tilsettes til mediet for å hemme astrocytt proliferasjon og for å drepe de gjenværende hiPSCs som ikke differensiere til neuroner. Filtrer mediet og varm til 37 ° C. Aspirer brukt medium fra brønnene på seks-brønns MEAs og 24-brønns plate og erstatte den med den forberedte medium. Opprettholde de seks-brønns MEAs og den 24-brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Oppdater medium (dag 6-28) MERK: Starter fra dag 6, oppdatere halvav mediet annenhver dag. Fra dag 10 og utover, er det medium supplert med FBS for å støtte astrocytt levedyktighet. Forbered Neurobasal medium med 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamin og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin. Legg NT-3 til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml BDNF til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml, og doksycyklin til en endelig konsentrasjon på 4 ug / ml. Fra dag 10 og utover, også supplere medium med 2,5% (v / v) FBS. Filtrer det resulterende medium og varm til 37 ° C. Fjerne halvparten av det brukte mediet fra brønnene på seks-brønns MEAs og den 24-brønns plate ved anvendelse av en 1000 ul pipette og erstatte den med den preparerte medium. Opprettholde de seks-brønns MEAs og den 24-brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. 4. Etablere den nevrofysiologiske profil av hiPSC-avledet Nerveceller MERK: To til tre uker etter iproduksjon av differensiering, kan de hiPSC-avledede nevroner brukes til ulike nedstrøms analyser. I denne delen er eksempler på noen nedstrøms analyser gitt som kan utføres for å etablere den nevrofysiologiske profil av hiPSC-avledede nevroner. Karakteriserer nevronale nettverk aktivitet ved hjelp MEAs Record 20 min av elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-avledet nerveceller dyrket på MEAs. Under innspillingen, holde temperaturen ved 37 ° C, og forebygge fordampning og pH-forandringer i mediet ved å blåse en konstant, langsom strøm av fuktet gass (5% CO2, 20% O2, 75% N 2) på MEA . Etter 1200X forsterkning (MEA 1060, MCS), sample signalet på 10 kHz bruker MCS datainnsamling kort. Analysere dataene (pigg og brast gjenkjenning) ved hjelp av en egendefinert programvarepakke 23. Preger encellede elektrofysiologisk aktivitet </strong> Overfør dekkglass som inneholder hiPSC-avledet nevronale kulturer til en neddykket fast scene opptak kammer i en oppreist mikroskop. Record 20 min av spontane aksjonspotensial fremkalt postsynaptiske strømmer (sEPSC) 24. Oppdage den synaptiske hendelse ved hjelp av nevrovitenskapelig program. Karakteriserer neuronal morfologi og synapsin uttrykk Fest og beis hiPSC-avledede nevroner for MAP2, synapsin-1/2, og PSD-95 22, 24, 25. Kvantifisere antallet synapsin-1/2 og PSD-95 puncta bruker bildeanalyse programvare.