Introduction
Sensível à força, sensores de FRET geneticamente codificados surgiram recentemente como uma ferramenta importante para a medição de forças de tracção baseada em células vivas, fornecendo informações sobre como as forças mecânicas são aplicados em proteínas 1, 2, 3, 4. Com essas ferramentas, os pesquisadores podem imagem não-invasiva forças intracelulares em células vivas usando microscópios fluorescentes convencionais. Estes sensores consistem de um par de FRET (proteínas fluorescentes dadores e aceitador, mais frequentemente um dador e aceitador de azul amarela), separadas por um péptido elástica 3. Em contraste para C- ou codificação N-terminal, este sensor está inserido num local interno de uma proteína para medir a força mecânica transmitidos através da proteína, comportando-se como um medidor de tensão molecular. O aumento da tensão mecânica entre os resultados de sensores num aumento da distância entre a FRET-par, o que resulta em diminuição de FRET 3. Como resultado, a FRET é inversamente proporcional à força de tracção.
Estes sensores fluorescentes de base têm sido desenvolvidos para proteínas de adesão focal (vinculina 3 e talina 4), as proteínas do citoesqueleto (α-actinina 5), e proteínas de junção célula-célula (E-caderina 6, 7, VE-caderina 8, e PECAM 8). O ligante elástico mais frequentemente utilizados e bem caracterizado nestes biossensores é conhecido como TSmod e consiste de uma sequência repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) 8, o qual foi derivado a partir da protea de seda de aranha flageliforme. TSmod tem sido demonstrado que se comportam como um nano-mola elástica linear, com a capacidade de resposta de FRET para 1 a 5 pN de força de tracção 3. Diferentes comprimentos de flageliforme pode ser utilizada para alterar o r dinâmicoange de sensibilidade à força de FRET TSmod 9. Além flageliformes, espectrina repete péptido peça de cabeça 5 e a vilina (conhecido como HP35) 4 têm sido usados como os péptidos elásticas entre pares de FRET em força biossensores semelhantes 4. Finalmente, um relatório recente mostrou que TSmod também pode ser usado para detectar as forças de compressão 10.
Desenvolvemos recentemente um sensor de força para o ligante da nucleo-citoesqueleto (LINC) proteína complexo Nesprin2G usando TSmod inserido numa proteína truncada Nesprin2G anteriormente desenvolvido conhecido como mini-Nesprin2G (Figura 2C), o qual se comporta de forma semelhante ao endógeno Nesprin-2G 11. O complexo LINC contém várias proteínas que conduzem a partir do exterior para o interior do núcleo, ligando o citoesqueleto citoplasmática para a lâmina nuclear. Nesprin-2G vincula uma proteína estrutural de tanto ocitoesqueleto de actina no citoplasma e para proteínas sol no espaço perinuclear. Usando nosso biossensor, fomos capazes de mostrar que Nesprin-2G está sujeita a tensão dependente da actomiosina em NIH3T3 fibroblastos 2. Esta foi a primeira vez que a força foi medida diretamente através de uma proteína no complexo LINC nuclear, e é provável que se torne uma ferramenta importante para compreender o papel da força no núcleo em mechanobiology.
O protocolo abaixo fornece uma metodologia detalhada de como utilizar o sensor de força Nesprin-2G, incluindo a expressão do sensor de tensão Nesprin (Nesprin-TS) em células de mamífero, bem como a aquisição e análise de imagens FRET de células que expressam Nesprin- TS. Usando um microscópio confocal invertido equipado com um detector espectral, uma descrição de como medir emissão sensibilizados FRET utilizando a separação espectral e imagiologia de FRET raciométrica é fornecido. As imagens raciométrica saída pode ser usado para fazer qua relativacomparações força ntitative. Embora este protocolo é focado sobre a expressão de Nesprin-TS em fibroblastos, é facilmente adaptável a outras células de mamíferos, incluindo ambas as linhas celulares e células primárias. Além disso, este protocolo, uma vez que refere-se a aquisição de imagem e análise de FRET pode ser facilmente adaptada para outros biossensores baseados em FRET força que têm sido desenvolvidos para outras proteínas.
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Protocol
1. Obter Nesprin-2G DNA do sensor e outras DNA plasmídeo
- Obter Nesprin-2G TS (sensor de tensão) de controlo, Nesprin-2G HL (sem cabeça), mTFP1, Vénus, e TSmod a partir de uma fonte comercial. Propagar todos os plasmídeos de ADN e purificá-los utilizando estirpes de E. coli convencionais, tais como DH5-α, como descrito anteriormente 12, 13.
2. Células transfectar com Nesprin-2G e outro ADN de plasmídeo
- Cultivar células de fibroblastos NIH 3T3 de 70-90% de confluência numa placa de cultura de células de 6 poços numa incubadora de cultura de células padrão com temperatura (37 ° C) e a regulação de CO 2 (5%). Para o meio de crescimento celular, uso de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo.
- Num capuz de cultura de célula, remover o meio e lavar cada poço com aproximadamente 1 mL de um meio de células de soro reduzido. Adicionar 800? L de meio celular reduzida de soro a cada poçoe colocar a câmara de 6 poços na incubadora.
- Pipetar 700 L de meio celular reduzida-soro para um tubo de 1,5 mL com 35 uL de uma solução de veículo lipídico para formar o "lipomix". Misturar por pipetagem. Rotular o tubo com um "L."
- Reunir seis tubos de 1,5 mL e classificá-los 1 a 6. Pipetar 100 L de meio celular reduzida de soro a cada tubo.
- Usando a concentração de DNA de plasmídeo a partir do passo 1, pipeta de 2 ug de Nesprin 2G-TS para tubos 1 e 2. Pipetar 2 ug de Nesprin-HL em tubos 3 e 4. pipeta de 1 ug de mTFP em tubo 5. Pipetar 1 ug de mVenus no tubo 6. não reutilizar pontas de pipeta ao pipetar diferentes tipos de DNA.
- Pipeta 100 uL da lipomix do "L" do tubo em cada tubo rotulado (1-6) e misturar por pipetagem repetida. Usar uma pipeta para cada tubo limpo. Incubar durante 10-20 minutos.
- Adicionar 200 ul de cada tubo rotulado para um poço na câmara de 6 poços com 70-90% confluentecélulas. Rotular o topo de cada poço com o ADN correspondente adicionado. Coloque a câmara de 6 cavidades em uma incubadora durante 4-6 h.
- Aspirar o meio e adicionar 1-2 mL de meio celular reduzida de soro para enxaguar. Aspirar o meio celular reduzida de soro, adiciona-se 2 mL de tripsina a cada poço, e colocar o prato de 6 poços na incubadora (5-15 min).
- Enquanto as células separar na incubadora, revestimento 6 com fundo de vidro visualização pratos com uma camada de fibronectina numa concentração de 20 ug / mL dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Permitir que os pratos para revestir a superfície da capa de cultura de células (aproximadamente 20 min).
- Neutraliza-se a tripsina por adição de 2 ml de DMEM uma vez que as células são separadas.
- Transferir o conteúdo de cada cavidade para um tubo de centrífuga de 15 mL etiquetados e girar para baixo em 90 xg durante 5 minutos numa centrífuga de rotor oscilante. Aspirar o sobrenadante e re-suspender cada pelete de células em 1000 uL de DMEM por mistura pipeta.
- Aspirar a mistura de fibronectina a partir dapratos de vidro e pipeta de 1000 L de cada suspensão de células para a pratos de vidro.
- Após as células se depositam no fundo dos pratos de vidro (~ 15 min), adicionar outro 1 mL de DMEM + FBS a 10% + 1% de Pen-Strep a cada poço e lugar na incubadora celular. Permitir que as células se fixem e expressar sensor para, pelo menos, 18-24 horas.
NOTA: As células são transfectadas utilizando reagentes lipídicos catiónicos comerciais de transfecção (ver a Tabela de Materiais). Em alternativa, linhas de células estáveis podem ser seleccionados utilizando um plasmídeo com um gene que confere resistência a uma toxina (os plasmídeos pcDNA para Nesprin-TS e -HL estão disponíveis em um site repositório de ADN (ver a Tabela de Materiais) proporcionar células que expressam resistência a geneticina ). Além disso, os métodos de infecção viral (lentivus, retrovus, ou adenovus) pode ser utilizada para expressar o sensor em células que são difíceis de transfectar. - Além Nesprin-TS, transfectar células adicionais com o Nesprin HL-zero parace controlo, como descrito nos passos 2.1-2.12; TSmod também pode ser usado como um controlo da força de zero e deve exibir TERF semelhante ao Nesprin-HL.
- células transfectar com mTFP1 e Vénus para gerar impressões espectrais (ver passo 4).
NOTA: mTFP1 e Vénus expressam tipicamente a níveis mais elevados do que Nesprin-TS, e como tal, os valores mais baixos de ADN podem necessitar de ser transfectadas para alcançar níveis de expressão semelhantes.
3. Verificar a eficiência de transfecção
- Cerca de 18-24 h depois de completar a transfecção, usar um microscópio de fluorescência invertido para examinar a eficiência de transfecção pela comparação do número de células fluorescentes para o número total de células em vista (geralmente 5-30%).
- Usar um microscópio de fluorescência equipado com uma frequência de excitação perto de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus) e um filtro de emissão centrada perto de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus).
NOTA: Como alternativa, GFP conjuntos de filtros irá capturar uma combinação de mTFP1 e veemissões nus e vai permitir a confirmação da eficiência de transfecção.
- Usar um microscópio de fluorescência equipado com uma frequência de excitação perto de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus) e um filtro de emissão centrada perto de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus).
- células vivas imagem dentro de 48 h após a transfecção.
- Alternativamente, as células fixar em paraformaldeo a 4% (em PBS com cálcio e magnésio) durante 5 min, armazenamento em PBS, e vista depois de 48 h 8.
NOTA: Beyond 48 h, a qualidade e força do sinal decai. A fixação das células preserva o seu estado, incluindo a FRET ser expresso 8; no entanto, apenas as células devem ser trabalhada em PBS, como meio de montagem pode afectar FRET 14. As células fixadas só pode ser comparada a outras células fixadas, como pode haver uma mudança na expressão.
Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Use equipamento de proteção pessoal adequado (EPI).
- Alternativamente, as células fixar em paraformaldeo a 4% (em PBS com cálcio e magnésio) durante 5 min, armazenamento em PBS, e vista depois de 48 h 8.
4. Captura Spectral Impressões digitais do mTFP1 e Vênus fluoróforos para de Mistura Espectral
- Num capuz de cultura de células, substituir o meio de células com mediu imagiologiam (tamponado com HEPES) suplementado com soro bovino fetal a 10%.
- Colocar os pratos entrando num (37 ° C) fase microscópio confocal com temperatura controlada.
- Colocar o prato de vidro de visualização com células mTFP1-transfectadas sobre o objectivo de óleo a 60X de ampliação com uma abertura numérica de 1,4.
NOTA: O óleo é usado em um microscópio de varredura a laser no objectivo 60X para se assemelham o índice de refração do substrato de vidro. O óleo é colocado em cima da lente da objectiva e entra em contacto directo com a lamela de vidro. - Localizar mTFP1 células que expressam com uma fonte de excitação de 458 nm e um filtro de passagem de banda de emissão centrado a 500 nm.
- Com uma célula fluorescente no campo de visão, selecione o modo de detecção espectral ( "Modo Lambda" no software usado aqui) e capturar a imagem espectral (Figura 3-1); incluem todas as frequências para além de 458 nm, utilizando incrementos de 10 nm (Figura 3-3). Selecione um fluores brilhanteregião ENT (ROI) da célula (raio de 20 pixels).
NOTA: A forma espectral do mTFP1 expressando ROI deve permanecer relativamente constante através da célula. Se a forma varia consideravelmente, re-ajustar o laser e ganhar configurações para melhorar a relação sinal-ruído. - Adicione o ROI fluorescente dizer, intensidade normalizada ao banco de dados espectrais, clicando em "salvar espectros de banco de dados."
- Optimizar a potência do laser e ganhar de tal forma que uma boa relação sinal-ruído é alcançada. Configurações irá variar para diferentes equipamentos. Usando células não fluorescentes, não transf ectadas como um quadro de referência, e aumentar o ganho de potência até que as células são brilhantes, mas não para além da gama dinâmica do detector (ponto de saturação). células de fundo não deve ter fluorescência detectável após uma média.
- Repetir o processo para as células Vénus-transfectadas com as seguintes excepções:
- Assegure-se que a frequência de excitação é de 515 nm e que o filtro passa-banda é centered perto de 530 nm, quando a localização de células Vénus-exprimem.
- Em "modo espectral," usar uma frequência de excitação de 515 nm em vez de 458 nm.
5. Captura de Imagens Unmixed
- Mude o modo de captura para "de Mistura Espectral."
- Adicionar as impressões espectrais de Vénus e mTFP1 para os canais de desmistura (Figura 3, Seta-2).
- Defina o laser de excitação de volta para uma fonte de argônio 458 nm.
- Coloque o prato visualização Nesprin-TS acima do objetivo de petróleo 60X.
- Depois de se concentrar em uma célula fluorescente com expressão suficientemente brilhante, ajustar o poder de ganho e de laser para otimizar a relação sinal-ruído.
NOTA: Uma vez que a eficiência FRET de Nesprin-TS está perto de 20%, a imagem venus sem mistura deve ser substancialmente mais fraca do que a imagem mTFP1 sem mistura. Uma vez que uma configuração de energia e ganho aceitável foram determinados de forma iterativa, estes parâmetros devem permanecer constante para todas as imagens captured. - Capturar um mínimo de 15-20 imagens de células Nesprin-TS com um brilho relativamente similares e evitar a saturação de pixel excessiva (todos os pixels saturados são removidos durante o processamento de imagem).
- Repetir o processo de captura de imagens com as células HL-Nesprin usando parâmetros de imagem idênticos.
Processamento 6. Imagem e Análise de Imagem Rácio
- (Fiji) software ImageJ usando open-source (http://fiji.sc/), imagens no formato nativo abertos usando BioFormats Reader.
- Pré-processar as imagens e calcular as imagens de escala utilizando protocolos previamente estabelecidos 15.
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Representative Results
Seguindo o protocolo acima, o DNA de plasmídeo foi adquirida a partir do repositório de ADN e transformado em células de E. coli. E. coli que expressam o ADN do sensor foram seleccionados a partir de placas de LB / Ampicilina e amplificado em um caldo de LB líquido. Após a amplificação dos vectores, plasmídeos de ADN foram purificados em tampão TRIS-EDTA utilizando um padrão, disponíveis comercialmente kit de isolamento de ADN. Usando um espectrofotómetro, o ADN purificado foi quantificado em uma concentração padrão de? G / mL (Figura 1A, Dias 1-2).
Usando os fibroblastos NIH-3T3, as células foram cultivadas até 70-90% de confluência num prato de 6 poços de cultura de células de plástico. Para inserir DNA de plasmídeo em células NIH3T3, foi realizada uma transfecção mediada por lípidos plasmídeo. Comercialmente disponível reagente de transfecção (ver a Tabela de Materiais) foi utilizada como o recipiente de lípido para ADN. Duas repetições deos sensores Nesprin-TS e Nesprin-HL foram transfectados em 4 poços de células (Figura 1B). Na preparação para a imagiologia de FRET, construções de fluoróforo individuais de mTFP1 e Vénus foram transfectados para células NIH-3T3 (Figura 1B). A seguir à transfecção, as células foram transferidas para o fundo de vidro visualização pratos compatíveis com ampliação elevada, microscópios confocais invertidos.
Antes de prosseguir para imagiologia confocal, uma vasta-campo do microscópio fluorescente invertido simples foi usada para verificar a eficiência da transfecção. Utilizando uma objectiva de 10x com uma abertura numérica de 0,25, muitas células em um campo de visão típico expressa os Nesprin-TS (Figura 2). Geralmente, o sensor localizada em torno do envelope nuclear, consistente com a localização endógena de Nesprin-2G 2. O sensor de controlo sem força, Nesprin-HL, seguiu um padrão de expressão semelhante 2.
Finalmente, as pilhas de imagens espectralmente resolvidos foram importados para ImageJ software open-source para processamento. As imagens foram pré-processado, e imagens rácio foram calculados utilizando procedimentos estabelecidos 15.
Figura 1: baseado em tempo Experimental Fluxograma. (A) Começando com sens adquiridosou DNA de plasmídeo, vectores de E. coli são transformadas com o ADN, seleccionado e amplificado (Dias 1-2). A partir de concentrados de caldo de E. coli LB, o DNA de plasmídeo é isolado e quantificada (Dia 3). Utilizando os plasmídeos de ADN purificados, fibroblastos NIH3T3 são transfectadas com um formato de seis poços (B) e transferidas para pratos de vidro de fundo que são compatíveis com um microscópio confocal invertido (Dia 3). Para verificar o sucesso da transfecção, as células são vistas sob um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com os filtros adequados (dia 4). Depende de uma transfecção bem sucedida, as células são visualizados num microscópio confocal equipado com um detector espectral. Usando a separação espectral, canais mTFP1 e venus são separados durante a aquisição e guardado como pilhas de imagens espectralmente resolvidos (Dias 4-5). Por último, as imagens são pré-processados em ImageJ, eo Índice-imagens são computados. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: uma imagem representativa de Transfectadas NIH3T3 fibroblastos. (A) de ampliação 10X de fibroblastos NIH-3T3 transfectadas que expressam Nesprin-TS usando um filterset GFP. (B) Uma vista explodida da caixa delimitadora de expressão parte A. sensor segue o envelope nuclear e muitas vezes prolonga-se para o citoplasma. (C) Nesprin-TS e Controlo -HL e como eles se ligam à actina e domios de ligao de sol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Spectral Fingerprinting Tutorial Usando confocal Software. Os espectros de emissão normalizada obtido a partir de raios 20 pixels nas regiões de interesse destacadas delineadas pela mira coloridas. (Seta-1) Modo de detecção espectral para capturar a imagem. (Arrow-2) "de Mistura Espectral" configuração para adicionar espectros normalizados para o banco de dados espectral. (Seta-3) A frequência de excitação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ao vivo de Mistura Espectral e saída de Confocal Software. (A) parâmetros de imagem críticas para reproduzir imagens ao vivo, não misturados. (Seta-1) A frequência de excitação. (Arrow-2) Viva modo a separação espectral. (B) Imagem Núcleos em canal Vénus não misturados. (
Figura 5: as imagens de relação Nesprin-TS FRET em células do rim de Madin-Darby Canine modelado e unpatterned (MDCK). Células MDCK que expressam estavelmente Nesprin-TS foram fotografadas em 10 linhas? M de largura fibronectina (A) ou polidimetilsiloxano unpatterned (PDMS) membranas (B). membranas nucleares foram visualmente mascarado e transformados em índices de FRET. A barra de escala de cor representa a relação de amplitude de FRET para núcleos unpatterned e modelado.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Processado Raciometrico FRET Imagens de Nesprin-TS células que expressam e Análise de Dados Agregados Histograma. (A) Um representante, normalizada histograma empilhado de FRET imagens de relação de Nesprin-TS tratados com ML7 inibidor da miosina, um código de cores por núcleos de células individuais. (B) Um representante, normalizada histograma empilhado de FRET imagens de relação de Nesprin-TS tratados com caliculina A, um activador da contractilidade celular. A legenda correlaciona cada núcleo analisados para a sua localização no histograma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um método e demonstração da imagem de células vivas da tensão mecânica através Nesprin-2G, uma proteína no complexo nuclear LINC, foi descrito acima. Antes deste trabalho, várias técnicas, tais como a aspiração micropipeta, magnético-grânulo citometria, e microscopia laser de ablação, têm sido usados para aplicar pressão sobre o núcleo da célula e para medir as suas propriedades de material a granel 16, 17, 18. No entanto, até que o nosso trabalho recente, não há estudos tinham mostrado que directamente as forças de tracção são transferidas directamente para uma proteína complexa LINC em células vivas 2.
Anteriormente, o nosso laboratório demonstrou que uma versão modificada do Nesprin2G, conhecido como mini-Nesprin2G, podiam ser manipuladas para expressar uma sonda de força de FRET conhecido como TSmod (Figura 2C) 2. TSmod foi mostrado anteriormente para medir de forma dinâmica à tracção paraces em células vivas e em várias proteínas de suporte de carga 3, 4, 6, 8. Foi ainda demonstrado que a mini-Nesprin-2G era indistinguível da endógeno Nesprin-2G com respeito à sua localização, efeitos conhecidos sobre o citoesqueleto, e capacidade para resgatar posicionamento nuclear 11, 19. Utilizando a proteína de mini Nesprin-2G com o TSmod (Nesprin-TS), demonstrou-se que os fibroblastos NIH3T3 que expressam o sensor tem um nível de referência de tensão em relação ao Nesprin-HL, o que não se pode ligar a actina 2. Além disso, a modulação da contractilidade celular usando inibidores ou activadores de miosina pode ser detectado por Nesprin-TS 2.
Há um número de passos críticos neste protocolo. Confundindo Nesprin-TS com Nesprin-HL (ou células que expressam ADN) não é Readily detectado, como tanto semelhante para localizar a membrana nuclear, e conduzirá a resultados confusos. Desde Nesprin-HL é um controlo sem força, a FRET medido deve ser maior do que Nesprin-TS em média. Para ser cautelosa, de sequenciação isolado construções de ADN e as células cuidadosamente rotulagem é aconselhada. Em segundo lugar, é importante para otimizar cuidadosamente o ganho do detector e potência do laser no microscópio confocal para melhorar a relação sinal-ruído e minimizar branqueamento. Para medir corretamente FRET, estes parâmetros devem permanecer constante durante a aquisição da imagem. Além disso, a otimização do ganho de detector ou energia para as células que expressam fraca ou muito brilhantes é sub-ótima, porque as células mediana expressar tenderá a cair fora da faixa dinâmica do detector. Certas células que expressam uma alta concentração de sensores tendem a fluorescência no nucleoplasma e do retículo endoplasmático, tornando-o difícil de resolver a membrana nuclear, que é presumivelmente a região mais interessante no que diz respeito a force. Selecção de células com níveis de expressão ligeiramente mais baixas tende a resolver este problema de localização do sensor.
Enquanto imagem espectral ratiometric é uma maneira relativamente simples e rápida de medir a FRET, ele faz unidades não saída de eficiência FRET devido ao sinal de receptor de sangria-through 20. Sem unidades de eficiência de FRET, que não é possível converter o índice de rácio de FRET em uma medição de força calibrada. Devido a esta limitação, as comparações força quantitativos único parente pode ser feita. eficiência de TERF pode ser determinado por métodos mais complicados, tais como microscopia de imagem de fluorescência-vida (FLIM) ou o fotobranqueamento do aceitador. Força absoluta (ao nível PN) pode ser estimada a partir de eficiência de FRET, tal como previamente descrito 3, 8.
Em contraste com os métodos anteriores para medir as propriedades mecânicas do núcleo ou o deslocamento do núcleo baseado on forças aplicadas externamente, medição da FRET do Nesprin-TS tem a vantagem de não invasiva-tensão sondagem sobre um componente da membrana nuclear 16, 17, 18. O sensor emite um sinal fluorescente que está correlacionada com a estirpe em moléculas individuais Nesprin-2G. Em contraste, a aspiração por micropipeta requer o uso de ferramentas delicados quando se trabalha com células vivas. ablação a laser confocal causa dano celular local e requer uma fonte de laser pulsado. torção magnética citometria forças de transferências para a membrana nuclear através do citoesqueleto e não pode ser usado para medir as forças em proteínas específicas, a menos que fosse para ser acoplado com o sensor de tensão Nesprin-2G.
Embora tenha sido demonstrado que as forças de tracção à base de actina são transferidos para Nesprin-2G, um componente do complexo LINC, permanece desconhecido quanto à tracção ou forças de compressão são exercidaspara outras proteínas LINC estruturais, tais dom-1 ou SOL-2. Trabalho futuro vai ser dirigido para a clonagem de sondas de FRET-força para estas proteínas LINC putativos de suporte de carga para elucidar ainda mais a mecânica nucleares com resolução ao nível da proteína. Outra questão que se apresenta é que as mudanças na FRET pode estar relacionado a mudanças na tensão, mas sim refletir qualquer mudança em Nesprin-2G oligomerização ou mudanças de conformação de Nesprin-2G. Alterações do pH celular pode influenciar a fluorescência do sensor e alterar o FRET medido. O sensor Nesprin-2G HL representa um bom controlo para algumas destas alterações (como alterações FRET observados com este sensor são provavelmente não relacionado para forçar), e construções de controle de FRET intermoleculares podem ser desenvolvidas para avaliar oligomerização (ver abaixo). Além disso, a expressão de nesprin-2G TS é conduzido por um promotor de CMV, o que resulta em sobre-expressão, e este elevado nível de expressão podem potencialmente induzir artefactos biológicos. Os avanços recentes com cAbrilhantado regularmente interspaced repeties palindricas curtas (CRISPR) têm permitido a reparação dirigida por homologia (HDR) abordagens para inserir sequências de ADN maiores no genoma 21. Esta abordagem pode ser utilizada para modificar endógeno Nesprin-2G (ou outras proteínas) para incluir TSmod. Isto iria proporcionar a expressão do sensor de força usando o promotor endógeno adequado, reduzindo o potencial de artefactos superexpressão.
TSmod e outras sondas FRET elástico também pode ser usado para desenvolver novos sensores para outras proteínas, o que poderia, então, ser utilizados num protocolo semelhante ao descrito neste artigo. Uma preocupação importante com o desenvolvimento de qualquer novo sensor de força é a determinação do local de inserção interna para o sensor de FRET. Em primeiro lugar, o local de inserção deve ser numa região da proteína submetida a carga mecânica. Estas regiões podem ser identificadas através da análise onde as proteínas do citoesqueleto conectado-interagir com a proteína. Em segundo lugar, a inserçãodo grande (~ 50 kDa) TSmod não deve perturbar a função biológica da proteína em estudo. Um "mini" forma anteriormente desenvolvido de Nesprin-2G mostraram que os domínios CH-se ligam à actina em ponte ao domínio KASH SOL-ligação foram suficientes para movimento nuclear Nesprin-2G em monocamadas de feridas 11, 19, o que sugere que a inserção de TSmod não seria provável interromper a função da proteína. Confirmação da função biológica do sensor requer um ensaio funcional para a função da proteína (em que o sensor de força pode ser mostrado para resgatar uma função específica em células desprovidas de proteína endógena). Em terceiro lugar, as mudanças na oligomerização de proteínas pode alterar a FRET entre as proteínas (denominadas FRET intermolecular 22), o que iria resultar em mudanças de FRET que não estão relacionados com a força. Uma análise cuidadosa desta muitas vezes requer construções FRET intermolecular especializadas que reportam especificamente oligomerização.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memoria Trust (para DEC) e NIH conceder R35GM119617 (a DEC). A imagem ao microscópio confocal foi realizada nas instalações de VCU nanomateriais Caracterização do núcleo (NCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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