Introduction
Kuvvet-duyarlı, genetik olarak kodlanmış FRET sensörler, yakın, canlı hücrelerde çekme bazlı kuvvetleri olarak proteinler, 1, 2, 3, 4 arasında nasıl uygulandığı mekanik kuvvetlerin fikir sağlamak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu araçları ile, araştırmacılar geleneksel floresan mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde, non-invaziv görüntü hücre içi kuvvetler can. Bu sensörler bir elastik peptid 3 ile ayrılmış bir FRET çiftinin (donör ve akseptör floresan proteinleri, en çok mavi bir verici ve sarı akseptör) oluşur. C- veya N-terminal etiketleme aksine, bu sensor, bir molekül gerilme göstergesi gibi davranmak, protein üzerinden iletilen mekanik kuvvetini ölçmek için bir proteinin bir iç alanı içine eklenir. FRET p arasında artan bir mesafe sensörü sonuçları arasında mekanik gerilim artışıhava, azalmış FRET 3 elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, FRET ters gerilme kuvveti ile ilgilidir.
Bu flüoresan bazlı sensörler fokal yapışma proteinleri (vinkülin 3 ve talin 4), sitoskeletal proteinler (α-aktinin 5), ve hücre-hücre birleşme proteinleri için geliştirilmiştir (E-kadherin 6, 7, VE-cadherin 8 ve PECAM 8). Bu biyoalgılayıcılarda da en sık kullanılan ve iyi karakterize edilmiş esnek bağlayıcı TSmod olarak bilinir ve örümcek ipeği proteini flagelliform türetilmiş 40 amino asitlik (GPGGA) 8, bir tekrarlanan dizinin oluşur. TSmod çekme kuvveti 3 5 pN için 1 FRET yanıtı, bir doğrusal elastik nano yay olarak hareket ettiği gösterilmiştir. flagelliform farklı uzunlukları dinamik r değiştirmek için kullanılabilirTSmod FRET kuvvet duyarlılık 9 ange. Flagelliform ek olarak, spektrin (HP-35 olarak da bilinir) 5 ve villin başlık peptid 4 içindeki kuvvet biyosensörler 4 FRET çifti arasındaki elastik peptidler olarak kullanılmıştır tekrarlar. Son olarak, son bir yay TSmod da sıkıştırma kuvvetlerini 10 algılamak için kullanılabileceğini gösterdi.
Son zamanlarda TSmod endojen benzer şekilde davranır mini Nesprin2G (Şekil 2C), olarak bilinen, daha önce geliştirilmiş kesik Nesprin2G protein içine sokulur kullanılarak Nucleo-hücre iskeletinin (LINC) kompleks protein Nesprin2G bağlayıcısına için bir güç sensörü gelişmiş Nesprin-2G 11. LINC kompleksi, nükleer lamina sitoplazmik hücre iskeleti bağlama, çekirdeğin içine dışarıdan yol açan birçok proteinler içerir. Nesprin-2G yapısal bir protein bağlanma her ikisitoplazmada ve çekirdek çevresi alanı GÜNEŞ proteinlerine aktin hücre iskeletinin. Bizim biyosensör kullanarak, Nesprin-2G NIH3T3 fibroblastların 2'de actomyosin bağımlı gerilim tabi olduğunu göstermek başardık. Bu, o kuvvet direkt olarak nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında ölçüldü ilk kez oldu ve mechanobiology içinde çekirdeği üzerinde gücünün rolünü anlamak için önemli bir araç haline muhtemeldir.
Aşağıdaki protokol, Nesprin- ifade eden hücrelerin FRET görüntülerin memeli hücrelerinde Nesprin gerilim sensörü (Nesprin-TS) ifadesi, hem de toplama ve analizi de dahil olmak, Nesprin-2G güç sensörü nasıl kullanılacağını detaylı bir yöntem sağlar TS. bir spektral detektörü ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak, duyarlı emisyon ölçmek için nasıl bir açıklama spektral Karışmama kullanılarak FRET ve rasyometrik FRET görüntüleme sağlanır. çıkış oran ölçer görüntüleri göreceli nereye yapmak için kullanılabilirntitative kuvvet karşılaştırmaları. Bu protokol, fibroblastlarda Nesprin-TS ekspresyonu odaklanmış olsa da, bu hücre hatları ve primer hücreler de dahil olmak diğer memeli hücreleri, kolayca adapte edilebilir. Bundan başka, bu görüntü elde etme ve FRET analizi ile ilgili olarak, bu protokol, hali hazırda diğer proteinler için geliştirilmiştir, diğer FRET'e dayalı bir kuvvet biyosensör için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nesprin-2G Sensör DNA ve diğer plazmid DNA elde edilir
- ticari bir kaynaktan Nesprin-2G TS (gerilim sensörü), Nesprin-2G HL (başsız) kontrol, mTFP1, venus, ve TSmod elde edilir. Bütün DNA plazmidleri yaymak ve daha önce 12, 13 tarif edildiği gibi, örneğin DH5a-a gibi Standart E. coli suşları, kullanarak saflaştırılması.
Nesprin-2G ve diğer Plazmid DNA ile 2. transfekte hücreler
- Sıcaklık (37 ° C) ve CO2 (% 5) düzenlenmesi ile standart bir hücre kültürü inkübatöründe bir 6-yuvalı hücre kültürü çanağı içinde% 70-90 konflüansa NIH 3T3 fibroblast hücrelerinin büyütün. hücre büyüme ortamı için,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanın.
- bir hücre kültür kaput, orta kaldırmak ve bir indirgenmiş serum hücre ortamında yaklaşık olarak 1 mL'si ile de her yıkayın. Her bir oyuğa indirgenmiş serum hücre ortamında 800 mcLve kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin.
- Lipid taşıyıcı çözeltisi 35 uL 1.5 ml tüp içine indirgenmiş serum hücre ortamında Pipet 700 uL "lipomix" oluşturulur. Pipetleme ile karıştırın. bir "L" ile tüp etiketleyin
- Altı 1.5 ml tüpler toplayın ve her bir tüpe indirgenmiş serum hücre ortamında 6. pipetle 100 uL aracılığıyla onları 1 etiketleyin.
- mVenus 5. pipetle 1 ug tüp içine borular 3 ve 4 pipetle 1 OVMP ug içine tüpler 1 ve 2 Pipet 2 Nesprin-HL ug içine aşama 1, pipet 2 Nesprin 2G-TS ug plazmid DNA konsantrasyonu kullanılarak tüp 6. içine yeniden kullanım etmeyin pipet uçları DNA'nın farklı türde pipetlerken zaman.
- Her bir işaretlenmiş borusu (1-6), "L" tüp lipomix Pipet 100 uL ve tekrar pipetleme karıştırın. Her tüp için temiz pipet kullanın. 10-20 dakika süreyle inkübe edin.
- % 70-90 konfluent 6 oyuklu odası içinde bir kuyuya her etiketli tüp 200 mcLHücreler. karşılık gelen DNA ile her bir üst Etiket ilave edildi. 46 saat için bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin.
- orta aspire ve durulama için indirgenmiş serum hücre ortamında 1-2 ml. , Indirgenmiş serum hücre ortamı aspire her bir göze tripsin 2 mL ekleyin ve inkübatör (5-15 dakika), 6-çukurlu bir tabak yerleştirin.
- Hücreler inkübatör içinde ayırmak birlikte, kat 6 cam alt fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda fibronektinle bir tabaka ile bulaşıkları görüntüleme. kaplamak için yemeklere hücre kültürü kaputu (yaklaşık 20 dakika) yüzey izin verin.
- Hücreler müstakil bir kez DMEM 2 mL eklenerek tripsin nötralize.
- iyi bir etiketli 15-ml santrifüj tüpüne her içeriğini aktarın ve sallanan bir rotor santrifüj içinde 5 dakika için 90 x g'da aşağı doğru döndürün. Süpernatant aspire ve pipet karıştırma ile DMEM 1.000 uL, her hücre topağı yeniden askıya.
- fibronektin karışımı aspireCam kaplar ve pipet cam tabaklar üzerine her bir hücre süspansiyonu 1.000 uL.
- Hücreler cam kasesi taban (~ 15 dakika) yerleşmek sonra hücre kuluçka makinesi içinde de yer ve her DMEM başka bir 1 ml +% 10 FBS +% 1 Pen-Strep ekleyin. Hücreler en az 18-24 saat sensör takmak ve ekspres izin verin.
Not: Hücreler, ticari katyonik lipid transfeksiyon reaktifleri (Malzemelerin Tablo) kullanılarak transfekte edilir. Seçenek olarak ise, stabil hücre hatları, bir toksine karşı direnç kazandıran bir gen ile bir plasmid kullanılarak seçilebilir (Nesprin-TS ve -HL için pcDNA plazmidler genetisin direnci ifade eden hücreler (Malzemelerin Tablo) temin eden bir DNA depo web sitesinde bulunabilir ). Ek olarak, viral enfeksiyon yöntemleri (lentivirüs, retrovirüs, veya adenovirüs) transfekte etmek zor olan hücrelerde sensörü ifade etmek için kullanılabilir. - Nesprin-TS ek olarak, Nesprin HL sıfır için ek hücreleri transfektece kontrol adımlar 2.1-2.12 tarif edildiği gibi; TSmod aynı zamanda sıfır güç kontrol olarak kullanılabilir ve Nesprin-HL benzer FRET sergilemelidir.
- mTFP1 ve venus ile transfekte hücreler spektral parmak izi (Adım 4) üretmek için.
Not: mTFP1 ve venus, tipik olarak Nesprin-TS daha yüksek seviyelerde eksprese eder ve bu şekilde DNA alt miktarların benzer ekspresyon seviyelerini elde etmek için transfekte edilmesi gerekebilir.
3. Transfeksiyon Verimi doğrulama
- Yaklaşık 18-24 saat transfeksiyon tamamlandıktan sonra, görünümünde hücreler (genellikle% 5-30) toplam sayısı flüoresan hücrelerin sayısını karşılaştırarak transfeksiyon etkinliğini incelemek için bir ters flüoresan mikroskop kullanılır.
- 462 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venus) ve 492 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venüs) yakınında bulunan bir emisyon filtresi yakın bir uyarım frekansı ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak.
NOT: Alternatif olarak, GFP filtre setleri mTFP1 bir arada yakalamak ve ettik edeceknus emisyon transfeksiyon verimliliği teyidini sağlayacak ve.
- 462 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venus) ve 492 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venüs) yakınında bulunan bir emisyon filtresi yakın bir uyarım frekansı ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak.
- Transfeksiyon sonrası 48 saat içinde resmi canlı hücreleri.
- Seçenek olarak ise, 48 saat 8 sonra, PBS içinde 5 dakika, deposu için, ve görünümü (kalsiyum ve magnezyumlu PBS içinde)% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit.
NOT: 48 saat ötesinde, sinyal kalitesi ve gücü azalır. Hücrelerin Tespit 8 ifade edilen FRET dahil olmak üzere durumunu korur; orta montaj FRET 14 etkileyebilir olarak, ancak, hücrelerin sadece PBS içinde görüntülü olmalıdır. ekspresyonunda bir değişiklik olabilir gibi sabit hücreleri yalnızca, diğer sabit hücrelere kıyasla olabilir.
Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin.
- Seçenek olarak ise, 48 saat 8 sonra, PBS içinde 5 dakika, deposu için, ve görünümü (kalsiyum ve magnezyumlu PBS içinde)% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit.
Spektral unmixing için mTFP1 ve Venüs floroforların 4. Yakalama Spektral parmak izleri
- Bir hücre kültürü kaputu, görüntüleme Mediu ile hücre orta yerine% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş m (HEPES-tamponlu).
- sıcaklık-kontrollü bir (37 ° C), konfokal mikroskop aşamasında görüntüleme yemekler yerleştirin.
- 1.4 olan bir sayısal açıklık ile 60X büyütmede yağ objektiv mTFP1-transfekte edilmiş hücreler ile cam görüntüleme tabağına yerleştirin.
NOT: Yağ yakından cam zeminin kırılma indeksi benzemeye 60X objektif bir lazer tarama mikroskobu kullanılmaktadır. Yağ objektif lens üstüne yerleştirilir ve cam kapak ile doğrudan temas edilir. - mTFP1 bir 458 mm uyarım kaynağı ve 500 nm de bir emisyon bant-geçiş filtresi ile eksprese eden hücrelerin bulun.
- Görüş alanında bir flüoresan hücre ile, (burada kullanılan yazılım "Lambda modu") spektral algılama modu seçmek ve spektral görüntü (Şekil 3-1) yakalamak; 10 mil artışlarım (Şekil 3-3) kullanılarak 458 nm ötesinde tüm frekansları içerir. Parlak fluoresc seçinHücre (20 piksel uzaklık) üzerinde ent bölgesi (ROI).
Not: mTFP1 eksprese ROI spektral şekil hücresi boyunca nispeten sabit kalmalıdır. şekil büyük ölçüde farklı ise, lazer yeniden ayarlayın ve sinyal-gürültü oranını geliştirmek için ayarları kazanır. - tıklayarak spektral veritabanına, floresan ROI ortalama normalize yoğunluğunu Ekle "veritabanına spektrum kaydedin."
- lazer gücü optimize edin ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilecek şekilde kazanırlar. Ayarlar farklı ekipman için değişecektir. Arka plan referans olarak floresan olmayan, transfekte edilmemiş hücreler kullanılarak, fakat detektörü (doyma noktasına) dinamik aralığının dışında, hücrelerin parlak olana kadar kazanç ve gücünü artırmak. Arka plan hücre ortalaması sonra saptanabilir flüoresans olmamalıdır.
- aşağıdaki istisnalarla Venus-transfekte hücreler için tekrarlayın:
- uyarı frekansı 515 nm'de olduğundan emin olun ve bant geçiş filtresi ce olduğuvenus-ifade eden hücreleri tespit ederken 530 nm'ye yakın ntered.
- Olarak "Spektral Mod" 515 nm yerine 458 nm'lik bir eksitasyon frekans kullanımı.
5. Yakalama Karışmamış Görüntüler
- için yakalama modunu değiştirin "Spektral unmixing."
- Karışmama kanallarına (Şekil 3, Ok-2) venus ve mTFP1 spektral parmak izi ekle.
- geri 458 nm argon kaynağına uyarım lazer ayarlayın.
- 60X petrol amacı yukarıda Nesprin-TS inceleyen tabağına yerleştirin.
- yeteri kadar parlak ifadesi ile bir floresan hücre odaklanan sonra, sinyal-gürültü oranını optimize etmekte kazanç ve lazer gücü ayarlar.
NOT: Nesprin-TS FRET verimliliği% 20 yakın olduğu için, karışmamış Venus görüntü karıştırılmamış mTFP1 resimden daha büyük ölçüde sönük olmalıdır. Kabul edilebilir bir güç ve kazanç ayarı iteratif belirlendikten sonra, bu parametreler tüm resimler capt için sabit kalmalıdıredilsin. - (Tüm doymuş piksel görüntü işleme sırasında çıkartılmıştır) nispeten benzer parlaklık Nesprin-TH hücrelerinin 15-20 görüntülerin en az çekme ve aşırı piksel doygunluk kaçının.
- özdeş görüntüleme parametreleri kullanılarak Nesprin-HL hücreleri ile görüntü yakalama işlemi tekrarlayın.
6. Görüntü İşleme ve Oran Görüntü Analizi
- Kullanılması açık kaynak ImageJ (FİJİ) yazılımı (http://fiji.sc/), BioFormats Reader kullanılarak açık yerel biçim görüntüler.
- Ön-işlem ve görüntüler ve daha önce tespit edilmiş protokollerin 15 kullanılarak oranı görüntü hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokole ardından DNA plazmidi DNA deposundan alınan edildi ve E. coli hücrelerine transforme edildi. Sensör DNA ifade eden E. coli LB / Amfisilin plakaları seçilir ve bir sıvı LB suyu içinde amplifiye edildi. Vektörlerin amplifikasyonu takiben, DNA plazmidleri standart, ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak Tris-EDTA tampon maddesi içinde saflaştırılmıştır. Bir spektrofotometre kullanılarak, saflaştırılmış DNA ug / mL (Şekil 1A, günler 1-2), standart bir konsantrasyonu ölçülmüştür.
NIH3T3 fibroblastlar kullanılarak hücreler 6-çukurlu plastik hücre kültürü çanağı içinde% 70-90 kaynaşmaya kadar büyütülmüştür. NIH3T3 hücrelerinin plazmid DNA eklemek için, bir lipid-kaynaklı plazmid transfeksiyon gerçekleştirilmiştir. Ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifi (Malzemelerin Tablo) DNA için lipit kabı olarak kullanılmıştır. iki replikaNesprin-TS ve Nesprin-HL sensörleri 4 hücre yuvasının (Şekil 1B) içine transfekte edildi. FRET görüntüleme için hazırlık olarak, mTFP1 ve venus tek florofor yapıları NIH3T3 hücreleri (Şekil 1B) içine transfekte edildi. transfeeksiyonu takiben hücreler yüksek büyütme, ters konfokal mikroskoplar ile uyumlu yemekler inceleyen cam dibine aktarıldı.
konfokal görüntüleme geçmeden önce, basit bir ters geniş alan fluoresan mikroskop transfeksiyon etkinliğini doğrulamak için kullanılmıştır. Tipik bir görüş alanı görünümünde 0.25, çok sayıda hücre sayısal açıklığa sahip bir 10X objektif kullanarak Nesprin-TS (Şekil 2) olarak ifade edilmiştir. Genellikle, sensör Nesprin-2G 2 endojen yerelleştirme ile tutarlı, nükleer zarfın etrafında lokalize. Herhangi bir kuvvet kontrol sensörü, Nesprin-HL, bir benzer bir tanımlama 2 izledi.
Son olarak, tayfsal çözünürlüğü görüntü yığınları işlenmek üzere ImageJ açık kaynak yazılımına ithal edildi. Görüntü ön işleme tabi tutuldu, ve bu oran görüntü yerleşmiş prosedürler 15 kullanılarak hesaplanmıştır.
Şekil 1: Deneysel Zaman tabanlı Akış Şeması. (A) alınan sens ile başlayarakya da plazmid DNA, E. coli vektörleri, DNA ile transforme seçilir ve (Gün 1-2) amplifiye edilir. Konsantre edilir, E. coli LB suyu, plazmid DNA izole edilir ve (3 gün) ölçülmüştür. Saflaştırılmış DNA plazmidleri kullanılarak, NIH3T3 fibroblastlar, altı gözlü bir formatta (B) 'de, transfekte ve ters bir eş odaklı mikroskop (Gün 3) ile uyumlu olan cam alt yemekler aktarılır. Transfeksiyon başarılı olduğunu doğrulamak için, hücreler, uygun bir filtre setleri (Gün 4) ile donatılmış bir geniş açılı floresan mikroskop altında incelendi. Başarılı transfeksiyon üzerine Koşullu, hücreler, bir spektral detektörü ile donatılmış bir konfokal mikroskop görüntülü. Spektral Karışmama kullanarak, mTFP1 ve venus kanal edinimi sırasında ayrılır ve spektral çözülmüş görüntü yığınlarının (Günler 4-5) olarak kaydedilir. Son olarak, görüntüler ImageJ ön düzenlenir, ve oran-images hesaplanır. Please bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Transfekte edilen NIH3T3 fibroblastlar bir Örnek resmi. GFP için Filtre kullanılarak Nesprin-TS ifade eden transfekte edilmiş NIH3T3 fibroblastlarının (A) 10 x büyütme. (B), kısım A'da Sensör ifadesinden sınırlayıcı kutunun bir parçalara ayrılmış görünüşüdür, nükleer zarf izler ve genellikle sitoplazma içine doğru uzanır. (C) Nesprin-TS ve -HL Kontrol ve nasıl aktin ve SUN bağlanma bölgeleriyle bağlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: SEşodaklı Yazılımını Kullanma pectral Parmak İzi Eğitimi. Normalize emisyon spektrumu vurgulanan bölgelerinin ilgilenilen renkli çapraz hedefler ile tarif 20. piksel yarıçapları elde edilen. (Ok-1) görüntüsünü yakalamak için spektral algılama modu. spektral veritabanına normalize spektrum eklemek için ayarı (Ok-2) "Spektral Karışmama". (Ok-3) uyarı frekansı. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Canlı Spektral Karışmama ve Konfokal Yazılımı Çıktı. (A) Kritik görüntüleme parametreleri canlı, karışmamış görüntüleri çoğaltmak. (Ok-1) uyarı frekansı. (Ok-2) spektral Karışmama modunu canlı. Karışmamış venüs kanal (B), Çekirdekler görüntüsü. (
Şekil 5: desenli ve desensiz Madin Darby Köpek Böbrek (MDCK) hücreleri içinde Nesprin-TS FRET oranı ve görüntüler. Kararlı biçimde Nesprin-TS ifade MDCK hücreleri 10 um çapında fibronektin hattına (A) ya da desensiz polidimetilsiloksan (PDMS) zarlarının (B) üzerinde görüntülenmiştir. Nükleer membranlar görsel maskelenir ve FRET oranları içine işlenmiştir. renkli ölçek çubuğu desensiz ve desenli çekirdekleri FRET oranı genliğini temsil etmektedir.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: den İşlenmiş oranlı metrik FRET Fotoğraflar Hücreler ve birleştirilmiş veri histogram analizi Nesprin-TS-ifade edilmesi. (A), bir temsilci, tek tek hücre çekirdekleri tarafından renk kodlu ML7 miyozin inhibitörü ile muamele edilmiş Nesprin-TS FRET oranı görüntü normalize istiflenmiş histogram. (B) bir temsilci, Calyculin A, hücre kasılmasının, bir aktivatör ile muamele Nesprin-TS FRET oranı görüntü normalize istiflenmiş histogram. efsane histogram üzerindeki konumu her analiz çekirdeği ilişkilidir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir yöntem ve Nesprin-2G, nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında mekanik gerilimin canlı hücre görüntüleme gösteri, yukarıda özetlenen edildi. Bundan önce işe, örneğin mikropipet aspirasyon sitometrisi manyetik boncuk ve mikroskopik lazer ablasyon gibi çeşitli teknikler, hücre çekirdeği üzerindeki yükü uygulamak ve dökme malzeme özellikleri 16, 17, 18 ölçmek için kullanılmıştır. Ancak, bizim son çalışmasında kadar hiçbir çalışma doğrudan çekme kuvvetleri canlı hücrelerde 2'de bir LINC karmaşık protein doğrudan transfer olduğunu göstermişti.
Daha önce, laboratuar mini Nesprin2G olarak bilinen Nesprin2G, değiştirilmiş bir versiyonu TSmod (Şekil 2C) 2 diye bilinen bir FRET prob kuvveti ifade etmek için canlandırır. TSmod daha önce dinamik için gerilme ölçümü gösterilmiştircanlı hücrelerde ve çeşitli taşıyıcı proteinler, 3, 4, 6, 8 ces. Bundan başka, mini Nesprin-2G lokalizasyona göre endojen Nesprin-2G farksız olduğu gösterilmiştir, hücre iskeletinin ve yeteneği bilinen etkisi, nükleer konumlandırma 11, 19 kurtarmak için. TSmod (Nesprin-TS) mini Nesprin-2G proteinini kullanarak, sensör eksprese eden NIH3T3 fibroblastlar actin 2 bağlanan olamaz Nesprin-HL için germe nisbetle bir taban hattı seviyesine sahip olduğu gösterilmiştir. Bundan başka, inhibitörleri veya miyozin aktifleştiricilerinin kullanım hücresel kontraktilite modülasyonu Nesprin-TS 2 ile tespit edilebilir.
Bu protokolde kritik adımların vardır. Nesprin-HL (DNA ya da eksprese eden hücreler) ile Nesprin-TS karıştırılması readi değildirHer iki benzer nükleer zarı lokalize olmakta ve şöyle bir sonucu gibi ly, algıladı. Nesprin-HL no-kuvvet kontrolü için, ölçülen FRET ortalama Nesprin-TS daha yüksek olmalıdır. dikkatli olmak, dizileme izole DNA yapıları, ve dikkatli bir şekilde etiketlenmesine hücreler tavsiye edilir. İkinci olarak, dikkatli bir şekilde, sinyal-gürültü oranını geliştirmek için ve ağartma en aza indirmek için eş odaklı mikroskop dedektör kazanç ve lazer gücü optimize etmek için önemlidir. Düzgün FRET'i ölçmek için, bu parametreler görüntü alımı sırasında sabit kalmalıdır. medyan ifade eden hücreler detektörün dinamik aralık dışında düşme eğiliminde olacaktır, çünkü Dahası, loş veya çok parlak ifade eden hücreler için dedektör kazanç veya güç optimize suboptimaldir. sensörün yüksek bir konsantrasyon ifade Bazı hücreler zor fo açısından daha ilginç bölge muhtemelen olan nükleer membran, çözmek için yapım çekirdek plazması ve endoplazmik retikulum ışıldamaya eğilimindedirrce. biraz daha düşük ekspresyon düzeyleri ile hücrelerin seçilmesi sensör yerelleşme Bu sorunu çözmek eğilimindedir.
Oranlı metrik spektral görüntüleme FRET'i ölçmek için nispeten basit ve hızlı bir yöntemdir iken, bunun nedeni alıcı sinyali kanaması-through 20 FRET verimlilik değil çıkış birimlerini yok. FRET verimliliği birimleri olmadan, kalibre edilmiş kuvvet ölçümü içine FRET oranı endeksi dönüştürmek mümkün değildir. Bu nedenle sınırlama, sadece göreceli kantitatif kuvvet karşılaştırmalar yapılabilir. FRET verimliliği, floresans süresi görüntüleme mikroskobu (FLIM) ya da alıcı ışıkla ağartma gibi daha karmaşık yöntemler ile belirlenebilir. Daha önce 3, 8 açıklandığı gibi (pN seviyesinde) Mutlak kuvvet, FRET verimliliği tahmin edilebilir.
Önceki yöntemlerin tersine, çekirdeğin mekanik özelliklerini veya çekirdek göre o yerinden ölçmekn, dıştan Nesprin-TS çekirdek zarı 16, 17, 18 bir bileşeni olmayan invazif problama geriliminin bir avantajı vardır gelen FRET ölçüm, uygulanan kuvvetlere. Sensör bireysel Nesprin-2G molekülleri üzerinde suşu ile ilişkili olduğu bir flüoresan sinyal gönderir. canlı hücreler çalışırken aksine, mikropipet aspirasyon narin araçların kullanımını gerektirmektedir. Konfokal lazer ablasyon yerel hücresel hasara neden olur ve bir darbeli lazer kaynağı gerektirir. Bu Nesprin-2G gerilim sensörü ile bağlanmış olması sürece manyetik hücre iskeletinin ile çekirdek zar üzerine transfer kuvvetleri sitometri büküm ve belirli proteinler üzerinde güçlerini ölçmek için kullanılamaz.
aktin bazlı gerilme kuvvetleri Nesprin-2G, LINC, kompleksin bir bileşeni aktarılır gösterilmiştir edilmiş olsa da, bu çekme ya da sıkıştırma kuvvetleri uygulandığı ne kadar bilinmemektedirdiğer yapısal LINC proteinler üzerine, örneğin, güneş-1 ya da güneş-2. Gelecekteki çalışmalar bundan başka, protein düzeyinde çözünürlüklü nükleer mekanik aydınlatmak için, bu varsayımsal taşıyıcı LINC proteinleri içine FRET kuvvet probları klonlama yönelik olacaktır. kendini göstermektedir Bir diğer konu FRET değişiklikler gerginlik değişikliklere ilgisiz olabilir ama daha ziyade Nesprin-2G oligomerization veya Nesprin-2G uyumlu değişmelerle ya değişiklikleri yansıtmak olabilmesidir. Hücresel pH değişimler sensörünün floresan etkileyen ve ölçülen FRET değiştirebilir. (Bu sensör ile gözlenen FRET değişiklikler büyük olasılıkla ilgisiz zorlamak gibi) Nesprin-2G HL sensörü Bu değişikliklerin bazıları için iyi bir denetim temsil eder ve moleküller arası FRET kontrol yapılar (aşağıya bakınız) oligomerleştirmesini değerlendirmek üzere geliştirilebilir. Buna ek olarak, nesprin-2G TS ekspresyonu aşırı ekspresyonu ile sonuçlanan, bir CMV promoteri tarafından tahrik edilir, ve ifade bu yüksek potansiyel olarak biyolojik eserler indükleyebilir. c ile son gelişmelerlüsterli düzenli aralıklı bırakılmış kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) homoloji yönelik tamir için izin (HDR) genomuna 21 içine büyük DNA dizilerinin sokulması için yaklaşımlar. Bu yaklaşım, TSmod dahil etmek için endojen Nesprin-2G (ya da diğer proteinler) değiştirmek için kullanılabilir. Bu aşırı ekspresyonu eserler potansiyelini azaltarak uygun endojen promoter kullanılarak güç sensörünün ifade sağlayacaktır.
TSmod ve diğer elastik FRET probları, aynı zamanda bu makalede tarif edilene benzer bir protokol kullanılabilir diğer proteinler için yeni sensörler geliştirmek için kullanılabilir. Herhangi bir yeni kuvvet sensörü gelişmesiyle birlikte büyük bir endişe FRET sensörü için dahili yerleştirme sitesini belirlemektir. İlk olarak, ekleme yeri mekanik yüke tabi bir protein bölgede olması gerekir. Bu bölgeler, sitoskeletal bağlı proteinler protein ile etkileşimde bulunduğu incelenmesi ile tespit edilebilir. İkinci olarak, eklemeBüyük (± 50 kDa) TSmod proteinin biyolojik fonksiyonu çalışılan bozmayacak gerekir. Nesprin-2G daha önce geliştirilmiş olan "küçük" bir şekilde GÜNEŞ bağlayıcı Kash etki köprülü aktin bağlayıcı CH etki gösteren, yaralı tek katmanlar 11, 19 Nesprin-2G nükleer hareketi için yeterli olduğunu gösterdi büyük ihtimalle olup TSmod ekleme protein fonksiyonunu bozabilir. Sensörün biyolojik fonksiyonuna teyidi (kuvvet sensörü endojen protein tükenmiş hücreleri belirli bir işlevi kurtarmak için gösterilebilir ki) protein fonksiyonu için bir işlevsel analiz gerektirmektedir. Üçüncü olarak, protein, oligomerizasyon değişiklikler zorlamak için ilgili olmayan FRET değişikliklere neden olur proteinler arasındaki FRET (adlandırılır arası FRET 22) değiştirebilir. Bu dikkatli bir biçimde analiz genellikle spesifik oligomerleştirmesini rapor uzman moleküller arası FRET yapıları gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, (DEC) R35GM119617 vermek Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memoria (DEC) güven ve NIH tarafından desteklenmiştir. konfokal mikroskop görüntüleme VCU Nanomaterials Karakterizasyonu Çekirdek (KKK) Tesisinde gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A.
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
